CN105039389B

CN105039389B - 一种甘蔗无载体框架转基因方法

Info

Publication number: CN105039389B
Application number: CN201510374031.8A
Authority: CN
Inventors: 王继华; 曹干; 张木清; 王丽
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2035-06-29
Also published as: CN105039389A

Abstract

本发明提供一种甘蔗无载体框架转基因方法，具体涉及一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：1)提取含有Bar基因的质粒；2)制备无载体框架的Bar基因表达盒；3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；4)抗性筛选，再生培养。本发明直接将甘蔗愈伤组织作为受体材料，通过基因枪介导Bar基因表达盒来转化甘蔗愈伤组织，培养后进行抗性筛选和再生，获得含有抗除草剂功能的转基因甘蔗，基因转化率高，能够大大降低转基因成本，节省时间。

Description

一种甘蔗无载体框架转基因方法

技术领域

本发明涉及技术领域涉及植物遗传转化领域，具体涉及甘蔗无载体框架转基因方法。

背景技术

植物遗传转化是研究外源目的基因功能和开发转基因植物的有效途径，是开展植物学研究的基础手段之一。近年来，随着转基因植物的商业化种植，转基因作物品种和种植面积逐年增加，产生了巨大的经济效益和环境效益。但是，消费者对转基因作物的安全性要求也越来越高，转化背景简单的转基因植物和高效快速的转基因技术是研究的发展趋势。

甘蔗是一种重要的糖料经济作物，广泛种植于热带、亚热带地区，甘蔗糖占全球食糖总量的70％以上。同时，甘蔗具有高光合效率、高生物产量的特点，是生产乙醇的最佳能源作物。甘蔗属于日中性植物，开花难，同时甘蔗在生产上通过无性繁殖，相比其它转基因甘蔗具有较高的生物安全性，属于转基因安全Ι类植物，具有良好的商业化种植前景。

基因枪转化技术目前已经广泛应用于植物转基因研究，具有适应性广，效率高的特点。目前常规的甘蔗转基因所用的外源基因材料多为含有目的基因的载体，这导致大量载体序列也插入到甘蔗基因组中，导致效率低下，同时也导致转基因甘蔗的遗传背景较为复杂。特别是目前甘蔗基因组还没有完成，导致确定目的基因的插入位点无法完成。目前有通过如pCambia1300系列载体将外源基因导入甘蔗的方法报道，如专利CN201210462236.8公开的一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基团导入甘蔗的方法，由于基因枪转化是随机的，避免了载体序列的插入，导致插入片段的随机性和复杂性，造成转化效率低。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种无载体框架的甘蔗无载体框架转基因方法，可利用该方法获得一种转基因甘蔗。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

1)质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的质粒；

2)Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶HindⅢ和XhoⅠ酶切步骤1)获得的含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和终止子的Bar基因表达盒；

3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；

4)抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。

作为优选，步骤2)中，取步骤1)获得的含有bar基因的质粒，每10μg质粒加入10*buffer 10μL、HindⅢ酶2μL和XhoⅠ酶2μL，加入双蒸水定容至100μL，37℃过夜，得酶切产物。

作为优选，步骤2)中以琼脂糖凝胶为凝胶介质，以核酸电泳缓冲液10×TAEBuffer为电泳缓冲液，进行电泳纯化。

作为优选，步骤3)中，使bar基因沉淀到金粉微粒载体上，制备金粉悬浮液，转移至载物膜上，制得DNA微弹。

作为优选，步骤3)中，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位1100psi，射程为9cm，轰击1次。

作为优选，步骤3)中，愈伤组织采用高渗培养基进行培养，所述高渗培养基为含有0.2mol/L Sorbitol和0.2mol/L Mannitol、1mg/L 2,4-D和5.5g/L琼脂粉的MS培养基。

作为优选，步骤4)中，采用选择培养基进行抗性筛选，所述选择培养基为含有3mg/L2,4－D、5mg/L草丁膦、5.5g/L琼脂粉的MS培养基，所述选择培养基的pH值为5.8。

作为优选，步骤4)中，使用分化培养基后和生根培养基进行再生培养，所述分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5.0g/L琼脂粉的MS培养基，所述分化培养基的pH值为5.8；所述生根培养基为含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5.0g/L琼脂粉的MS培养基，所述生根培养基的pH值为5.8。

作为优选，步骤4)后，还包括一PCR检测步骤，采用如下引物序列：

上游引物SEQ ID No.1：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'；

下游引物SEQ ID No.2：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。

作为优选，PCR检测反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/LdNTP 0.35μL,10mmol/L上游引物0.35μL,10mmol/L下游引物0.35μL,25mmol/L MgCl21.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,加ddH₂O至15μL；

PCR反应条件:95℃预变性3min；95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35个循环；72℃延伸10min,4℃保存。

本发明相比起现在有技术，有以下技术效果：

1.本发明采用含有目的基因的表达盒，去掉无用的载体序列直接采用目的外源基因转入甘蔗受体，减少无用序列插入的机会，提高了目的基因的插入改良，有效提高了转化效率；

2.本发明提供的转基因方法，外源基因的背景清晰，更有利于插入位点的确定，转基因过程更加可控；

3.本发明制备了Bar基因的表达盒，利用基因枪对甘蔗进行转化，获得了含有Bar的抗除草剂转基因甘蔗，提供了一种更加经济可行的获得抗除草剂甘蔗的转基因方法；

4.本发明提供的甘蔗无载体框架转基因方法，操作方便，不需要操作人员掌握大量的操作技能，适合大规模的商业化转基因甘蔗的批量生产；

5.本发明提供的甘蔗无载体框架转基因方法，不仅适用于将Bar基因导入甘蔗植株，还适用于将其它除草剂基因导入甘蔗植株。

下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为Bar基因表达盒示意图；

图2为酶切产物电泳图；

图3为基因枪转化后的愈伤组织图；

图4为再生植株；

图5为移栽成活的转基因植株；

图6为再生植株的PCR检测电泳图，其中1号为阳性对照；2号为阴性对照；3-25号为转基因植株。

具体实施方式

以下具体实施方式中，所用试剂或仪器如无特殊说明，均视为市售。

本发明提供一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

2)Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶HindⅢ和XhoⅠ酶切步骤1)获得的含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因目的片段和终止子的Bar基因表达盒；

该Bar基因的表达盒可用于制备DNA微弹，再利用基因枪对甘蔗进行转化；

以下实施例中，所采用的甘蔗基因型为甘蔗品种新台糖20号、新台糖22号、粤糖00-236。本发明中bar基因为除草剂基因。

以下实施例中，所述Sorbitol为山梨(糖)醇，所述Mannitol为甘露醇。

实施例1：

一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

1)质粒的提取

平板挑取含有Bar的大肠杆菌的单菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜，收集菌体，获得含有bar基因的质粒；

具体质粒提取方法可参见《植物基因工程原理与技术》，王关林、方宏筠等编。

2)Bar基因表达盒的制备

a)取步骤1)获得的含有bar基因的质粒10μg，加入10*buffer 10μL、HindⅢ酶2μL和XhoⅠ酶2μL，加入双蒸水定容至100μL，37℃过夜，得酶切产物；

b)取酶切产物，在10×TAE电泳缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳，当溴酚蓝迁移至5cm-8cm时，切下bar基因目的片段的胶块，收集含有启动子、bar基因目的片段和终止子的Bar基因表达盒，调整bar基因目的片段的浓度为100ng/μL，-20℃储存备用；图1为Bar基因表达盒示意图；图2为酶切产物电泳图。

3)基因枪转化

i)DNA微弹的制备：取4℃保存的60mg/mL的金粉悬浮液100μL，从步骤2)获得的Bar基因表达盒内取样20μL，依次加入2.5mol/L的CaCl₂100μL和0.1mol/L的亚精胺40μL，振荡5min，冰上静置10min，使bar基因目的片段沉淀到金粉微粒载体上，12,000rpm离心5s，弃上清液，加180μL 70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置10min，12,000rpm离心5s，弃上清，加180μL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10min，12,000rpm离心5s，弃上清，加80μL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取6μL制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；

ii)轰击前愈伤组织的培养：挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织为转化受体，转移到高渗培养基上暗培养8h，其中高渗培养基为含有0.2mol/L Sorbitol、0.2mol/L Mannitol、1mg/L 2,4-D和5.5g/L琼脂粉的MS培养基；

iii)轰击：将DNA微弹装载至Bio-Rad PDS-1000/He型基因枪，对上述愈伤组织进行轰击，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位1100psi，射程为9cm，轰击1次；

iv)轰击后愈伤组织的培养：轰击后的愈伤组织在原高渗培养基上继续暗培养16～18h后，转移到继代培养基上，恢复培养3d，得愈伤组织材料，图3为基因枪转化后的愈伤组织图；

4)抗性筛选

I)选择性培养：将步骤3步骤iv)获得的愈伤组织材料移到含有除草剂草丁膦的选择培养基上，培养4周；

在培养期间，愈伤组织材料的植体绝大多数部分褐化死亡，有少数瘤状愈伤组织从褐化的叶片表面长出，挑选瘤状愈伤组织继续在选择培养基上暗培养2次，得到抗性愈伤组织；

其中选择培养基为含有3mg/L2,4-D、5mg/L草丁膦和5.5g/L琼脂粉的MS培养基，选择培养基的pH值为5.8；

II)分化培养：取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培养至抗性愈伤组织的苗高2-3cm；

其中，分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5.0g/L琼脂粉的MS培养基，分化培养基的pH值为5.8；

III)生根培养：切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱导；4周后，可见植株高约6cm，下部出现长约2cm的根，再生植株见图4；

其中，生根培养基为含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5.0g/L琼脂粉的MS培养基，生根培养基的pH值为5.8；

IV)再生培养：炼苗1周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中，其中育苗盘中基质为园土和泥炭土按1：1混合得到的培养土，图5为移栽成活的转基因植株。

实施例2：再生植株的PCR检测

取实施例1步骤4)获得的再生植株的叶片，采用微量法提取总DNA进行PCR扩增，PCR扩增采用SEQ ID No.1所述的上游引物，采用SEQ ID No.2所述的上游引物；

SEQ ID No.1：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'；

SEQ ID No.2：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'；

PCR反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP0.35μL,10mmol/L上游引物0.35μL,10mmol/L下游引物0.35μL,25mmol/L MgCl21.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,加ddH₂O至15μL；

PCR反应条件:95℃预变性3min；95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35个循环；72℃延伸10min,4℃保存；

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，图6为再生植株的PCR检测电泳图，1号为阳性对照，2为阴性对照，3-25号为转基因植株，其中，3-9号为新台糖20号；11-12、14-19号为新台新台糖22号；23-25号为新台粤糖00-236；从图6可知，本发明提供的甘蔗无载体框架转基因方法的转化率高。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

1）质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的质粒；

2）Bar基因表达盒的制备：

采用核酸内切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切步骤1）获得的含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和终止子的Bar基因表达盒；bar基因目的片段的浓度为100ng/μL；

3）基因枪转化：将步骤2）获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，轰击前愈伤组织的培养，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗叶片愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养，具体操作如下：

其中，制备DNA微弹如下：

取4℃保存的60 mg/mL的金粉悬浮液100 µL，从步骤2）获得的Bar基因表达盒内取样20µL，依次加入2.5 mol/L的CaCl₂100 µL和0.1 mol/L的亚精胺40 µL，振荡5 min，冰上静置10 min，使bar基因目的片段沉淀到金粉微粒载体上，12,000 rpm离心5 s，弃上清液，加180µL 70%乙醇漂洗沉淀，冰上静置10 min ，12,000 rpm离心5 s，弃上清，加180µL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10 min ，12,000 rpm离心5 s，弃上清，加80 µL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉重悬浮液，取6 µL制备好的金粉重悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；

轰击前愈伤组织的培养如下：挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织为转化受体，转移到高渗培养基上暗培养8h；

轰击后愈伤组织的培养如下：轰击后的愈伤组织在原高渗培养基上继续暗培养16～18h后，转移到继代培养基上，恢复培养3 d，得愈伤组织材料；

所述高渗培养基为含有0.2 mol/L Sorbitol、0.2 mol/L Mannitol、1mg/L 2,4-D和5.5 g/L 琼脂粉的MS培养基；

4）抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株；

采用选择培养基进行抗性筛选，所述选择培养基为含有3 mg/L2,4-D、5 mg/L草丁膦、5.5 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述选择培养基的pH值为5.8；

使用分化培养基后和生根培养基进行再生培养，所述分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5.0 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述分化培养基的pH值为5.8；所述生根培养基为含有3mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、5.0 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述生根培养基的pH值为5.8。

2.如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤4）后，还包括PCR检测步骤，PCR检测采用如下引物序列：

上游引物SEQ ID No.1：5' -ACCATCGTCAACCACTACAT-3'；

下游引物SEQ ID No.2：5'- AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。

3.如权利要求2所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，

PCR检测反应体系：模板DNA 50-100 ng，10×Buffer 1.5μL，10 mmol/L dNTP 0.35μL,10 mmol/L 上游引物 0.35μL, 10mmol/L 下游引物0.35μL,25 mmol/L MgCl21.0μL,Taq酶0.2μL,加ddH₂O至15μL；Taq酶的浓度为5 U/μL；

PCR反应条件:95℃预变性3 min;95℃30 sec,60℃40 sec,72℃40 sec,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。