CN109355311A - 一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法 - Google Patents

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CN109355311A CN201811451216.4A CN201811451216A CN109355311A CN 109355311 A CN109355311 A CN 109355311A CN 201811451216 A CN201811451216 A CN 201811451216A CN 109355311 A CN109355311 A CN 109355311A
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张木清
徐世强
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Abstract

本发明提供一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，具体涉及一种甘蔗愈伤组织受体处理的方法，包括以下步骤：1)准备甘蔗胚性愈伤组织；2)制备基因枪转化甘蔗愈伤组织受体；3)基因枪转化：将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体，用装载有DNA微弹的基因枪轰击，对轰击后的愈伤组织进行培养；4)抗性筛选，再生培养。本发明将甘蔗愈伤组织机械处理成小块，平铺在滤膜上作为受体材料，通过基因枪介导转化，经过抗性筛选和再生，获得转基因甘蔗。制备转基因受体的效率高，易操作，能够大大降低制备劳动，节省时间。

Description

一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法
技术领域
本发明涉及技术领域涉及植物遗传转化领域，具体涉及通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法。
背景技术
基因枪转化技术是一种十分成熟的转化手段，具有受体适应性广，转化效率高的特点。目前已经广泛应用于动、植物转基因育种，基因瞬时表达研究等。植物遗传转化技术是研究基因功能和培育转基因植物新品种的有效途径，是重要的介导基因转化的手段之一。近年来，随着转基因植物的商业化大面积的种植，产生了巨大的经济效益和环境效益。开发高效快速的转基因技术是研究的发展趋势。
甘蔗是热带、亚热带地区的重要的糖料经济作物之一，也是生产乙醇的最佳材料，是一种极具潜力的生物能源作物。甘蔗糖占全球食糖总量的70％以上，同时，甘蔗属于C4植物，具有高光合效率、高生物产量的特点。甘蔗属于日中性植物，开花难，杂交育种相对困难；甘蔗也是多倍体，遗传背景复杂，后代筛选率低；加之甘蔗植株高大，在实生苗的选育种需要消耗大量的土地、人力和物力等。同时甘蔗在生产上通过无性繁殖，相比其它转基因甘蔗具有较高的生物安全性，属于转基因安全Ι类植物，具有良好的商业化种植前景。抗虫的转基因甘蔗也已经在巴西开始商业化种植。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，可利用该方法获得基因枪转化中的受体。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，包括以下步骤：
1)胚性愈伤组织制备：
对诱导得到的甘蔗愈伤组织在胚性诱导培养基上进行胚性诱导，得到胚性愈伤组织；
所述胚性诱导培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L 2,4-D、1～1.5mg/LKT、30～35g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节PH至5.8～6.0；
2)基因枪转化甘蔗愈伤组织受体制备：
将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移固定在支持物上，得到甘蔗愈伤组织受体；
3)基因枪转化：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养，得到轰击前愈伤组织；按照基因枪转化流程轰击轰击前愈伤组织，再将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养后，整体转移到继代培养基上恢复培养，得愈伤组织材料，
步骤3)中，所述高渗培养基为在MS培养基基础上，添加0.2～0.3mol/L Sorbitol、0.2～0.3mol/L Mannitol、3～3.5mg/L 2,4-D、30～35g/L蔗糖以及5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8～6.0；
步骤3)中，所述继代培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L 2,4-D、30～35g/L蔗糖以及5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8～6.0；
4)抗性筛选与再生：
对愈伤组织材料进行抗性筛选，再生培养，得到甘蔗抗性植株。
优选地，步骤1)中具体操作为，用镊子挑取由甘蔗诱导得到的淡黄色的愈伤组织，分散接种到胚性诱导培养基上进行诱导，28±2℃黑暗培养20～25天，得到胚性愈伤组织。
优选地，步骤2)中具体操作为，将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移到孔直径为1-2mm的不锈钢漏勺上，再用不锈钢药勺在上面挤压愈伤组织，收集漏勺下面的愈伤组织，再将愈伤组织平铺到支持物上，愈伤组织的直径为1～1.2cm，得到甘蔗愈伤组织受体。
优选地，步骤3)包括如下步骤：
i)DNA微弹的制备：
取3～5℃保存的60～65mg/mL的金粉悬浮液，依次加入含有外源基因的质粒1～5μg、2.5～3.0mol/L的CaCl2和0.1～0.5mol/L的亚精胺，振荡后冰上静置，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，离心后弃上清液；加68～70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置再离心后弃上清；加无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置再离心后弃上清；加无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；
ii)轰击前愈伤组织的培养：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养6～10h，得到轰击前愈伤组织；
iii)轰击：
将DNA微弹装载至基因枪，对轰击前愈伤组织进行轰击，得到轰击后愈伤组织，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20～25mM Pa，轰击压力位1100～1200psi，射程为6～12cm，轰击1～2次；
iv)轰击后愈伤组织的培养：
将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养16～18h后，整体转移到继代培养基上，恢复培养3～5d，得愈伤组织材料。
优选地，步骤4)中包括如下具体步骤：
I)选择性培养：
将步骤3)的步骤iv)获得的愈伤组织材料整体移到含有除草剂草丁膦的选择培养基上，培养3～5周；
其中，所述含有除草剂草丁膦的选择培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L2,4-D、5～5.5mg/L草丁膦和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
II)分化培养：
取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培养至抗性愈伤组织幼苗高2-3cm；
所述分化培养基为在MS培养基基础上，添加3～6.5mg/L 6-BA、5～5.5mg/L草丁膦和5.0～5.5g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
III)生根培养：
切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱导；
所述生根培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L NAA、5～5.5mg/L草丁膦和5.0～5.5g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
IV)再生培养：
炼苗1～2周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中。
优选地，育苗盘中基质为园土和泥炭土按1：1混合得到的培养土。
优选地，将愈伤组织平铺到支持物上，愈伤组织的直径为1.5-2cm。
优选地，步骤2)中，收集胚性愈伤组织的支持物为尼龙膜或硝酸纤维素膜。
优选地，步骤3)中，将胚性愈伤组织平铺在支持物上作为一个整体在转化过程进行受体操作。
优选地，步骤3)中，i)DNA微弹的制备：
取3～5℃保存的60～65mg/mL的金粉悬浮液100～120μL，依次加入含有外源基因的质粒1-5μg、2.5～3.0mol/L的CaCl2100～120μL和0.1～0.5mol/L的亚精胺40～60μL，振荡5～8min，冰上静置10～12min，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清液；加180～200μL 68～70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置10～12min，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清；加180～200μL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10～12min，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清；加80～100μL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取6～10μL制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用。
本发明相比起现在有技术，有以下技术效果：
1.本发明采用了胚性甘蔗愈伤组织作为转化的受体，提高了愈伤组织的质量，有效提高了转化效率；
2.本发明提供的受体制作方法，采用小孔将大块的甘蔗愈伤组织分割成为小块，增加了每次转化操作时受体的数量，提高了获得转基因植株的概率；
3.本发明制备的受体制作方法，利用基因枪对甘蔗进行转化，获得了转基因甘蔗，提供了一种更加经济可行的获得转基因甘蔗的转基因方法；
4.本发明提供的甘蔗转基因受体的制备方法，操作简单方便，大大提高了工作效率，适合大规模的商业化转基因甘蔗的批量生产；
5.本发明提供的甘蔗转基因受体的制备方法，不仅适用于作为基因枪转化使用，还适用于农杆菌介导的转化方法。
附图说明
图1为胚性甘蔗愈伤组织；
图2为高渗处理切割后的愈伤组织；
图3为基因枪转化后抗性筛选的愈伤组织；
图4为抗性愈伤的分化；
图5为再生植株。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
以下具体实施方式中，所用试剂或仪器如无特殊说明，均视为市售。
一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，包括以下步骤：
1)胚性愈伤组织制备：对诱导得到的甘蔗愈伤组织在胚性诱导培养基上进行胚性诱导；
2)基因枪转化甘蔗愈伤组织受体制备：将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移到孔直径为1-2mm的不锈钢漏勺上，再用不锈钢药勺在上面挤压愈伤组织，收集漏勺下面的愈伤组织,再将愈伤组织转移到直径为1.5-2cm的膜上；
3)基因枪转化：将步骤2)获得受体，按照基因枪转化流程进行轰击固定在尼龙膜上的甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；
4)抗性筛选与再生：使用相应进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。
以下实施例中，所采用的甘蔗基因型为甘蔗品种新台糖20号和新台糖22号，所述外源基因为抗除草剂bar基因。bar基因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂基因，已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的遗传转化。
以下实施例中，所述Sorbitol为山梨(糖)醇，所述Mannitol为甘露醇。
实施例1：
一种通过基因枪转化快速培养抗性植株的方法，包括以下步骤：
1)胚性愈伤组织制备：
用镊子挑取由甘蔗品种新台糖20号诱导得到的淡黄色的愈伤组织，分散接种到胚性诱导培养基上进行诱导，28±2℃黑暗培养20天，得到胚性愈伤组织；
所述胚性诱导培养基为在MS培养基基础上，添加3mg/L 2,4-D、1mg/L KT、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂粉，再调节PH至5.8；
2)基因枪转化甘蔗愈伤组织受体制备：
将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移到孔直径为1-2mm的不锈钢漏勺上，再用不锈钢药勺在上面挤压愈伤组织，收集漏勺下面的愈伤组织，再将愈伤组织平铺到直径为1.5-2cm的膜上，愈伤组织的直径为1cm，得到甘蔗愈伤组织受体；
3)基因枪转化
i)DNA微弹的制备：
取3℃保存的60mg/mL的金粉悬浮液100μL，依次加入含有外源基因的质粒1μg、2.5mol/L的CaCl2100μL和0.1mol/L的亚精胺40μL，振荡5min，冰上静置10min，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，12,000rpm离心5s，弃上清液；加180μL 70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置10min，12,000rpm离心5s，弃上清；加180μL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10min，12,000rpm离心5s，弃上清；加80μL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取6μL制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；
本实施例中所述含有外源基因的质粒为bar基因目的质粒；
ii)轰击前愈伤组织的培养：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养6h，得到轰击前愈伤组织；
iii)轰击：
将DNA微弹装载至Bio-Rad PDS-1000/He型基因枪，对轰击前愈伤组织进行轰击，得到轰击后愈伤组织，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位1100psi，射程为9cm，轰击1次；
iv)轰击后愈伤组织的培养：
将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养16～18h后，整体转移到继代培养基上，恢复培养3d，得愈伤组织材料，图3为基因枪转化后的愈伤组织；
步骤3)中，所述高渗培养基为在MS培养基基础上，添加0.2mol/L Sorbitol、0.2mol/L Mannitol、3mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖以及5.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8；
步骤3)中，所述继代培养基为在MS培养基基础上，添加3mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖以及5.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8；
4)抗性筛选
I)选择性培养：
将步骤3)的步骤iv)获得的愈伤组织材料整体移到含有除草剂草丁膦的选择培养基上，培养5周；
在培养期间，愈伤组织材料的植体绝大多数褐化死亡，有少数黄色状愈伤组织从褐化的愈伤组织表面长出，在含有除草剂草丁膦的选择培养基上暗培养3次，间隔21天/次，得到抗性愈伤组织；
其中，所述含有除草剂草丁膦的选择培养基为在MS培养基基础上，添加3mg/L 2,4-D、5mg/L草丁膦和5.5g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8；
II)分化培养：
取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培养至抗性愈伤组织的苗高2-3cm；
所述分化培养基为在MS培养基基础上，添加3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦和5.0g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8；
III)生根培养：
切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱导；4周后，可见植株高约6cm，下部出现长约2cm的根，再生植株见图4；
所述生根培养基为在MS培养基基础上，添加3mg/L NAA、5mg/L草丁膦和5.0g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8；
IV)再生培养：
炼苗2周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中，其中育苗盘中基质为园土和泥炭土按1：1混合得到的培养土，图5为移栽成活的转基因植株。
实施例2：
一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，包括以下步骤：
1)胚性愈伤组织制备：对甘蔗品种新台糖22号诱导得到的愈伤组织在胚性诱导培养基上进行胚性诱导；用镊子挑取淡黄色的愈伤组织，分散接种到胚性诱导培养基(配方为：MS+3.5mg/L 2,4-D+1.5mg/L KT+35g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH＝6.5)上进行诱导，28±2℃黑暗培养25天，得胚性愈伤组织；
2)基因枪转化甘蔗愈伤组织受体制备：将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移到孔直径为1-2mm的不锈钢漏勺上，再用不锈钢药勺在上面挤压愈伤组织，收集漏勺下面的愈伤组织，再将愈伤组织平铺到直径为1.5-2cm的膜上，愈伤组织的直径为1.2cm；
3)基因枪转化
i)DNA微弹的制备：
取5℃保存的65mg/mL的金粉悬浮液120μL，依次加入含有外源基因的质粒5μg、3.0mol/L的CaCl2120μL和0.5mol/L的亚精胺60μL，振荡8min，冰上静置12min，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，15,000rpm离心3s，弃上清液；加200μL 68％乙醇漂洗沉淀，冰上静置12min，15,000rpm离心3s，弃上清；加200μL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置12min，15,000rpm离心3s，弃上清；加100μL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取10μL制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；
本实施例中所述含有外源基因的质粒为bar基因目的质粒；
ii)轰击前愈伤组织的培养：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养10h，得到轰击前愈伤组织；
iii)轰击：
将DNA微弹装载至Bio-Rad PDS-1000/He型基因枪，对轰击前愈伤组织进行轰击，得到轰击后愈伤组织，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为25mM Pa，轰击压力位1200psi，射程为12cm，轰击1次，射程为6cm，再轰击1次；
iv)轰击后愈伤组织的培养：
将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养16～18h后，整体转移到继代培养基上，恢复培养3d，得愈伤组织材料；
步骤3)中，所述高渗培养基为在MS培养基基础上，添加0.3mol/L Sorbitol、0.3mol/L Mannitol、3.5mg/L 2,4-D、35g/L蔗糖以及6.5g/L琼脂粉，再调节pH至6.0；
步骤3)中，所述继代培养基为在MS培养基基础上，添加3.5mg/L 2,4-D、35g/L蔗糖以及6.5g/L琼脂粉，再调节pH至6.0；
4)抗性筛选
I)选择性培养：将步骤3步骤iv)获得的愈伤组织材料整体移到含有除草剂草丁膦的选择培养基上，培养4周；
在培养期间，愈伤组织材料的植体绝大多数部分褐化死亡，有少数黄色状愈伤组织从褐化的愈伤组织表面长出，在选择培养基上暗培养2次，间隔14天/次，得到抗性愈伤组织；
其中选择培养基为含有3.5mg/L2,4-D、5.5mg/L草丁膦和6.0g/L琼脂粉的MS培养基，选择培养基的pH值为6.0；
II)分化培养：取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培养至抗性愈伤组织的苗高2-3cm；
其中，分化培养基为含有3.5mg/L 6-BA、5.5mg/L草丁膦、5.5g/L琼脂粉的MS培养基，分化培养基的pH值为6.0；
III)生根培养：切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱导；4周后，可见植株高约6cm，下部出现长约2cm的根；
其中，生根培养基为含有3.5mg/L NAA、5.5mg/L草丁膦、5.5g/L琼脂粉的MS培养基，生根培养基的pH值为6.0；
IV)再生培养：炼苗1周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中，其中育苗盘中基质为园土和泥炭土按1：1混合得到的培养土。
本发明提供的甘蔗愈伤组织制备受体的方法的转化率高。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)胚性愈伤组织制备：
对诱导得到的甘蔗愈伤组织在胚性诱导培养基上进行胚性诱导，得到胚性愈伤组织；
所述胚性诱导培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L 2,4-D、1～1.5mg/L KT、30～35g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节PH至5.8～6.0；
2)基因枪转化甘蔗愈伤组织受体制备：
将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移固定在支持物上，得到甘蔗愈伤组织受体；
3)基因枪转化：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养，得到轰击前愈伤组织；按照基因枪转化流程轰击轰击前愈伤组织，再将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养后，整体转移到继代培养基上恢复培养，得愈伤组织材料，
步骤3)中，所述高渗培养基为在MS培养基基础上，添加0.2～0.3mol/L Sorbitol、0.2～0.3mol/L Mannitol、3～3.5mg/L 2,4-D、30～35g/L蔗糖以及5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8～6.0；
步骤3)中，所述继代培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L 2,4-D、30～35g/L蔗糖以及5.5～6.5g/L琼脂粉，再调节pH至5.8～6.0；
4)抗性筛选与再生：
对愈伤组织材料进行抗性筛选，再生培养，得到甘蔗抗性植株。
2.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤1)中具体操作为，用镊子挑取由甘蔗诱导得到的淡黄色的愈伤组织，分散接种到胚性诱导培养基上进行诱导，28±2℃黑暗培养20～25天，得到胚性愈伤组织。
3.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤2)中具体操作为，将步骤1)获得的胚性愈伤组织转移到孔直径为1-2mm的不锈钢漏勺上，再用不锈钢药勺在上面挤压愈伤组织，收集漏勺下面的愈伤组织，再将愈伤组织平铺到支持物上，愈伤组织的直径为1～1.2cm，得到甘蔗愈伤组织受体。
4.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤3)包括如下步骤：
i)DNA微弹的制备：
取3～5℃保存的60～65mg/mL的金粉悬浮液，依次加入含有外源基因的质粒1～5μg、2.5～3.0mol/L的CaCl2和0.1～0.5mol/L的亚精胺，振荡后冰上静置，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，离心后弃上清液；加68～70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置再离心后弃上清；加无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置再离心后弃上清；加无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；
ii)轰击前愈伤组织的培养：
将步骤2)获得的甘蔗愈伤组织受体转移到高渗培养基上暗培养6～10h，得到轰击前愈伤组织；
iii)轰击：
将DNA微弹装载至基因枪，对轰击前愈伤组织进行轰击，得到轰击后愈伤组织，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20～25mM Pa，轰击压力位1100～1200psi，射程为6～12cm，轰击1～2次；
iv)轰击后愈伤组织的培养：
将轰击后愈伤组织置于高渗培养基中继续暗培养16～18h后，整体转移到继代培养基上，恢复培养3～5d，得愈伤组织材料。
5.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤4)中包括如下具体步骤：
I)选择性培养：
将步骤3)的步骤iv)获得的愈伤组织材料整体移到含有除草剂草丁膦的选择培养基上，培养3～5周；
其中，所述含有除草剂草丁膦的选择培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L2,4-D、5～5.5mg/L草丁膦和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
II)分化培养：
取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培养至抗性愈伤组织幼苗高2-3cm；
所述分化培养基为在MS培养基基础上，添加3～6.5mg/L 6-BA、5～5.5mg/L草丁膦和5.0～5.5g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
III)生根培养：
切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱导；
所述生根培养基为在MS培养基基础上，添加3～3.5mg/L NAA、5～5.5mg/L草丁膦和5.0～5.5g/L琼脂粉，再调节pH值为5.8～6.0；
IV)再生培养：
炼苗1～2周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中。
6.如权利要求5所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，育苗盘中基质为园土和泥炭土按1：1混合得到的培养土。
7.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，将愈伤组织平铺到支持物上，愈伤组织的直径为1.5-2cm。
8.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤2)中，收集胚性愈伤组织的支持物为尼龙膜或硝酸纤维素膜。
9.如权利要求1所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤3)中，将胚性愈伤组织平铺在支持物上作为一个整体在转化过程进行受体操作。
10.如权利要求4所述的通过基因枪转化快速培养甘蔗抗性植株的方法，其特征在于，步骤3)中，i)DNA微弹的制备：
取3～5℃保存的60～65mg/mL的金粉悬浮液100～120μL，依次加入含有外源基因的质粒1-5μg、2.5～3.0mol/L的CaCl2 100～120μL和0.1～0.5mol/L的亚精胺40～60μL，振荡5～8min，冰上静置10～12min，使含有外源基因的质粒沉淀到金粉微粒载体上，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清液；加180～200μL 68～70％乙醇漂洗沉淀，冰上静置10～12min，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清；加180～200μL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10～12min，12,000～15000rpm离心3～5s，弃上清；加80～100μL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取6～10μL制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用。
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