CN116491421A - 一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法，先培养获得甘蔗胚胎组织，再对甘蔗胚胎组织进行基因枪轰击，通过恢复培养、筛选培养、再生培养、生根培养、幼苗培育及移栽，得到转基因小苗。本发明的方法直接诱导甘蔗胚胎组织，而不是愈伤组织，对胚胎组织进行基因枪轰击，省去了前期的胚性愈伤诱导工作，缩短了甘蔗遗传转化的时间，不仅减少了时间浪费和经济成本，也减少了继代过程中可能出现的污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法。
背景技术
甘蔗是我国主要的糖料经济作物，蔗糖占全国食用糖总量高达92％，广西的甘蔗产量占全国的60％以上。甘蔗的主要育种目标为高产、高糖、高抗和高经济效益，而其高度多倍体且非整倍体的复杂基因组结构、优良性状受等位基因及多个基因控制的现象显著，导致甘蔗育种进程缓慢，难以获得综合性状优良的甘蔗品种。现下我国主栽甘蔗品种的选育方法多为杂交育种，传统杂交育种的育种效率低、周期长、后代表型鉴定复杂，难以将多个优良目标性状整合到一起，无法满足社会和市场的需求。分子辅助育种可以有效提高甘蔗育种效率。甘蔗遗传转化的方法主要分为农杆菌介导法和基因枪轰击法。相较于农杆菌介导法，基因枪轰击法在提高甘蔗遗传转化效率上有更明显的优势。
现有的基因枪轰击法，是用压缩气体动力产生气体冲击波，把粘有DNA的细微金打向甘蔗愈伤组织，需要先通过植物组培诱导愈伤组织，前期的诱导过程较耗费时间，而且在愈伤组织继代培养的过程中，很可能出现污染问题，且由于组织培养的时间长，导致组培苗存在较大的变异概率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法，包括以下步骤：
步骤一，甘蔗胚胎组织的获得：选取健康的甘蔗植株组织，消毒后接种于胚胎诱导培养基上培养，培养得到甘蔗胚胎组织；
步骤二，基因枪轰击：将甘蔗胚胎组织转移至转化培养基上预先培养3～5h，再进行基因枪轰击；
步骤三，恢复培养：将基因枪转化后的甘蔗胚胎组织转入DEM培养基上培养3～5天；
步骤四，筛选培养：将恢复培养后的甘蔗胚胎组织转入筛选培养基上培育，挑选长势良好的组织每8～12天继代，继代2～3次；
步骤五，再生培养：将在筛选培养基存活的组织转移到再生培养基上，每8～12天继代，继代2～8次；
步骤六，生根培养：待长出4～6cm高的健康再生芽时，将再生芽转移至生根培养基中进行生根培养；
步骤七，幼苗培育及移栽：当生根培养基中的再生芽长出4-6cm长度的根时，将小苗移栽到土壤中。
优选地，在步骤一中：所述的甘蔗植株组织为甘蔗植株顶端生长点部位组织；消毒后剥除外叶鞘，取距离顶端生长点5～30mm部分截切成1～2mm厚的薄片。
优选地，在步骤一中，所述胚胎诱导培养基为DEM培养基，所述DEM培养基组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+4-CPA 1.86mg/L+6-BA 0.09mg/L，pH值为5.6～6.0；培养过程中每7-10天继代。
优选地，步骤二所述的转化培养基组成为：DEM培养基+山梨醇0.4mol/L，pH值为5.6～6.0；预先培养的时间为4h。
优选地，步骤二中的基因枪轰击方法为：将金粉悬浮液与携带有目的基因的载体质粒DNA混合，添加亚胺精和氯化钙混合，离心使金粉沉淀，吸除上清再加入无水乙醇，充分混匀后的混合液用于进行基因枪轰击，轰击靶距为6～9cm。
优选地，步骤四中所述筛选培养基的组成为：DEM培养基+筛选试剂，pH值为5.6～6.0；所述筛选试剂为G418。
优选地，步骤五中的再生培养基组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+6-BA0.09mg/L+筛选试剂，pH为5.6～6.0；所述筛选试剂为G418。
优选地，步骤六中的生根培养基组成为：MS培养基，pH值为5.6～6.0。
优选地，步骤一、步骤三、步骤四中的培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％～60％、弱光100μE/m2/s。
优选地，步骤五、步骤六中的培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％～60％，较强光250μE/m2/s。
优选地，步骤六中的健康再生芽高度为5cm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法直接诱导甘蔗胚胎组织，而不是愈伤组织，对胚胎组织进行基因枪轰击，省去了前期的胚性愈伤诱导工作，缩短了甘蔗遗传转化的时间，不仅减少了时间浪费和经济成本，也减少了继代过程中可能出现的污染问题，本发明的方法体系成熟且稳定，在2～3个月时间就能获得转基因甘蔗植株。
(2)本发明的方法在提高转化效率的同时，后代转基因幼苗更健壮，更易成活，且由于组织培养的时间短，组培苗发生变异的概率大大降低。
(3)本发明的方法采用了高效的基因枪转化方式，提高了甘蔗的转基因效率。
说明书附图
图1为甘蔗胚胎组织照片。
图2为目标载体成功转化成功的小芽。
图3为转基因植株PCR检测产物电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。
具体实施方式中所用的甘蔗为广西甘蔗生物学重点实验室自育品种“中蔗1号”，本专利申请所保护的方法不限于只使用该品种，其他甘蔗品种均可用于本专利申请的技术方案。
具体实施方式中的外源基因编码中国水仙凝集素，发明人团队将该基因与双元表达载体pCAMBIA2301构建重组表达载体并转入大肠杆菌菌株DH5α，提取重组表达载体的质粒DNA用于基因枪轰击。本领域技术人员在应用本专利申请的技术方案时，可将目的基因与适合的表达载体构建重组表达载体，提取其质粒DNA来替换即可。
实施例1将外源基因通过基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化
步骤一，甘蔗胚胎组织的获得：
从田间选取健康的甘蔗植株尾梢，截取30～35cm保留生长点的部分带回实验室，用75％乙醇消毒表面，剥除3～5层外叶鞘后置于超净工作台内，继续剥去叶鞘直至观察到幼嫩柔软的心叶组织，取距顶端生长点5～30mm部分截切成厚约1～2mm的薄片，接种于DEM培养基上弱光培养；培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％-60％、弱光100μE/m2/s；DEM培养基的组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+4-CPA1.86mg/L+6-BA0.09mg/L，pH值为5.6～6.0；7天后进行继代；当外植体体积膨大，能观察到细微白色愈伤组织生长时(图1)，说明已诱导出甘蔗胚胎组织，已达到基因枪转化要求。
步骤二，基因枪轰击：
S21，在基因枪轰击前4小时，将甘蔗胚胎组织移至转化培养基上预先培养4小时再进行基因枪轰击；转化培养基组成为：DEM培养基+山梨醇0.4mol/L，pH值为5.6～6.0；
S22，吸取30μL混合均匀的60mg/mL金粉悬浮液与携带外源基因的质粒DNA混合，涡旋1分钟；添加20μL的0.1M亚精胺和50μL的2.5M氯化钙，涡旋1分钟；而后离心10s使金粉沉淀，吸除上清；加入250μL无水乙醇，离心后去除上清；重复该步骤一次；加入100μL无水乙醇，充分混合均匀直至轻击试管无明显大块颗粒悬浮；
S23，每枪用5μL的上述混合液进行基因枪轰击,轰击靶距为6～9cm；
步骤三，恢复培养：将基因枪转化后的甘蔗胚胎组织转入DEM培养基上培养4天，培养条件同步骤一；
步骤四，筛选培养：将恢复培养后的甘蔗胚胎组织为1～2cm的小块，转入筛选培养基上继代培养，挑选长势良好的组织每10天继代，继代2次；筛选培养基的组成为：DEM培养基+筛选试剂(G418，即遗传霉素)，pH值为5.6～6.0；培养条件同步骤一；
步骤五，再生培养：在筛选培养基上存活的组织即为目标载体成功转化的抗性组织，将抗性组织转移到再生培养基上，每10天继代，继代2～4次；再生培养基组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+6-BA0.09mg/L+筛选试剂(G418，即遗传霉素)，pH为5.6～6.0；培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％～60％，较强光250μE/m2/s；
步骤六，生根培养：待有健康小芽长至4～6cm时(图2)，切下小芽至生根培养基中进行生根培养；生根培养基组成为：MS培养基，pH值为5.6～6.0；培养条件同步骤五；
步骤七，幼苗培育及移栽：当生根培养基中的再生芽长出4～6cm长度的健壮根时，洗净组培苗根部多余凝胶或琼脂，移栽于装有营养土的育苗盆中培养，保持空气相对湿度在80％，待苗成活后再移栽到温室大盘中。
实施例2转基因植株检测
取实施例1的转基因苗的叶片，提取总DNA用于PCR检测，回收PCR产物，将其纯化连接T载体，转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌液进行转基因的测序验证(图3)，在图3中，泳道1-22号代表应用本发明方法获得的抗性苗1-22号，均可以通过PCR检测鉴定为转基因阳性苗(PCR产物长度531bp，以载体质粒作为阳性对照，以水以及中蔗1号基因组DNA作为阴性对照)PCR反应程序及体系如下：
1)引物
F primer:CGGGGTACCATGGCTAAGTCAAGTTTCCTCAT(SEQ ID NO.1)
Rprimer:CCCAAGCTTTTACTTGGCGGCCACTAACT(SEQ ID NO.2)
2)PCR反应体系(10μL)
3)PCR反应程序
95℃3min；95℃15sec，58℃15sec，72℃15sec 35个循环；72℃5min。
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，甘蔗胚胎组织的获得：选取健康的甘蔗植株组织，消毒后接种于胚胎诱导培养基上培养，培养得到甘蔗胚胎组织；
步骤二，基因枪轰击：将甘蔗胚胎组织转移至转化培养基上预先培养3～5h，再进行基因枪轰击；
步骤三，恢复培养：将基因枪转化后的甘蔗胚胎组织转入DEM培养基上培养3～5天；
步骤四，筛选培养：将恢复培养后的甘蔗胚胎组织转入筛选培养基上培育，挑选长势良好的组织每8～12天继代，继代2～3次；
步骤五，再生培养：将在筛选培养基存活的组织转移到再生培养基上，每8～12天继代，继代2～8次；
步骤六，生根培养：待长出4～6cm高的健康再生芽时，将再生芽转移至生根培养基中进行生根培养；
步骤七，幼苗培育及移栽：当生根培养基中的再生芽长出4-6cm长度的根时，将小苗移栽到土壤中。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤一中，所述的甘蔗植株组织为甘蔗植株顶端生长点部位组织；消毒后剥除外叶鞘，取距离顶端生长点5～30mm部分截切成1～2mm厚的薄片。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤一中，所述胚胎诱导培养基为DEM培养基，所述DEM培养基组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+4-CPA 1.86mg/L+6-BA 0.09mg/L，pH值为5.6～6.0；培养过程中每7-10天继代。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述的转化培养基组成为：DEM培养基+山梨醇0.4mol/L，pH值为5.6～6.0；预先培养的时间为4h。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中的基因枪轰击方法为：将金粉悬浮液与携带有目的基因的载体质粒DNA混合，添加亚胺精和氯化钙混合，离心使金粉沉淀，吸除上清再加入无水乙醇，充分混匀后的混合液用于进行基因枪轰击，轰击靶距为6～9cm。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四中所述筛选培养基的组成为：DEM培养基+筛选试剂，pH值为5.6～6.0；所述筛选试剂为G418。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中的再生培养基组成为：MS培养基+NAA 1.86mg/L+6-BA0.09mg/L+筛选试剂，pH为5.6～6.0；所述筛选试剂为G418。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤六中的生根培养基组成为：MS培养基，pH值为5.6～6.0。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一、步骤三、步骤四中的培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％～60％、弱光100μE/m2/s。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五、步骤六中的培养条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40％～60％，较强光250μE/m2/s。
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2023
- 2023-05-26 CN CN202310605443.2A patent/CN116491421A/zh active Pending
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