CN105706923A - 一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，属于甘蔗分子育种技术领域，具体涉及的是一种耐旱甘蔗植株的选育方法。一种耐旱甘蔗植株的选育方法，用适合的斑茅总DNA溶液浓度共培养甘蔗胚性悬浮小细胞，将培养物培养在不同浓度PEG的MS培养基上，在愈伤组织的增殖、分化等进行反复抗旱筛选，并经过SRAP分子检测变异株，最后经过温室大棚抗旱胁迫的选择，最终选育出抗旱的甘蔗植株。本发明的方法缩短了甘蔗选育的时间，且操作简单、价格廉价，同时提供一种突破甘蔗属、种的近缘杂交新途径，所获得的甘蔗植株比对照具有更好的耐旱特性。
Description
技术领域
本发明属于甘蔗分子育种技术领域，具体涉及的是一种耐旱甘蔗植株的选育方法。
背景技术
干旱是一个全球性面临的难题，世界上有50多个国家和地区属于干旱、半干旱地区，占地球总陆地面积的35％，而有灌溉条件的耕地面积仅有15％或更少。中国的旱地面积有0.78亿hm2，占总耕地面积的60％，其中无灌溉设施的旱作面积占总耕地面积的49.1％，随着全球气候呈现变暖趋势，干旱将面临更严峻的挑战。
甘蔗作为我国重要的糖料和能源作物，食糖是关系到国计民生的主要农产品，中国的主产蔗区主要分布在广西、云南、海南和广东等省(区)，约有2/3以上的甘蔗分布在旱地上，而广西90％以上种植在无灌溉条件的丘陵地带，旱害已严重阻碍广西乃至全国甘蔗产业的发展。近20年来甘蔗科研工作者通过杂交育种或引种选育出不少优良的甘蔗品种或品系，但抗旱品种仍没有得到很好的解决，特别由于广西气候自身因素的原因，种植在该区域的甘蔗开花十分困难，经过人工技术调节开花难度大，且开花后花粉活力很弱，杂交育种非常困难，目前广西甘蔗杂交育种主要在海南南繁育种基地进行，给本地的育种带来诸多不便，育种受到一定程度的障碍。因此，开发一种新的甘蔗抗旱选育方法，进一步提高甘蔗产量，对提高种植者的经济效益、促进甘蔗的产业化具有重要的意义和应用价值。
外源DNA直接导入技术，是植物分子育种的内容之一，它既不同于载体转化的基因工程技术，也有别于通过有性杂交实现植物之间基因交流的传统育种方式，而是以植物为受体，直接将带有目的性状的供体遗传物质(总DNA)或目的基因导入受体植物，创造出大量的变异材料，通过筛选获得目的性状的后代，从而达到改良品种目的。由于其操作简单、方便易行，不受受体植物种类的限制，适用范围广泛，且价格低廉，易于推广，已被越来越多的育种工作者所采用。通过这种方法已培养出一些抗病、抗虫及其它优良性状的农作物新品种或品系。早在1974年，周光宇在调查了植物远缘杂交广泛实践的基础上，提出了植物远缘杂交存在着染色体水平以下的DNA片段杂交假说。从整体上说，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的，但从进化的角度来看，部分基因的结构有可能保持一定的亲合性。当远缘的基因组进入母体(受体)后，大部分片段被分解，侥幸保存下来的某些DNA片段有可能整合进入到受体的染色体中，在后代表达出典型的或更多是非典型的遗传变异。通过外源DNA直接导入植物技术已在水稻、玉米、小麦和烟草等作物取得成功，培育出的许多优良品种(系)在生产上已推广应用，并取得了良好的经济和社会效益。
斑茅是甘蔗近缘属植物，具有许多甘蔗育种者所寻求的优良性状，如抗旱、耐瘠和抗病等特性，倍受甘蔗育种家关注。但长期以来，由于斑茅花粉不育或败育等问题，目前利用斑茅作亲本通过常规杂交育种选育出的抗旱新品种很少。因此，如何通过一些实验手段将其与甘蔗杂交融合筛选抗旱的优良甘蔗种质，将为甘蔗开辟一条新途径。
目前，大部分研究是对生产上的甘蔗品种进行抗旱生理等性状对比，如滕峥等报道了新台糖22号等6个甘蔗品种(品系)抗旱生理生化性状比较。而有关甘蔗耐旱选育方法报道很少，公开号为CN101503692A的发明专利公开了一种利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，该技术方法繁琐，需要用到基因枪等价格昂贵的仪器设备及抗性标记基因筛选等较为复杂的过程。从品种推广应用和食品安全的角度考虑，转基因植物种植仍存在许多屏障，如基因漂移对环境产生的生态风险，抗生素等选择标记基因仍有可能保留在植物体内，转基因食品对人的生理以及是否产生毒性等不确定的因素在科学界存在激烈论证中。
因此，开发一种甘蔗抗旱选育方法是目前需要迫切解决问题。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供一种耐旱甘蔗植株的选育方法，尝试利用斑茅与甘蔗细胞进行悬浮共培养接近大自然选育的方式培养，在含PEG的MS培养基上选择，通过大棚水分胁迫筛选出抗旱甘蔗植株，可提高甘蔗抗旱能力，为今后筛选抗旱的甘蔗品种奠定技术基础。
本发明提供的技术方案为：
一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，包括以下步骤：
(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至10-20cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接4-5圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；
(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，可结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；
(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含1.0-3.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养10-14d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养2-4d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径为80-150目的细胞筛滤，即得到直径0.1-0.22mm的较分散的微小细胞粒；
(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含1.0-2.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为200-400μg/mL，将甘蔗愈伤小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；
(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有20％PEG(w/w)、1.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养10d；
(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；
(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；
(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株。
作为优选，所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为2000-3000Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为26±2℃。
作为优选，步骤(1)中所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下0-2cm新叶，切成1-2mm厚圆片。
作为优选，步骤(1)中所述的诱导培养基为含2.0-3.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基。
作为优选，步骤(2)中所述的继代培养基为含1.0-2.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基。
作为优选，步骤(4)中所述的斑茅总DNA是采用SDS方法提取斑茅叶片的总DNA。
作为优选，步骤(5)、步骤(6)中所述的PEG为聚乙二醇6000。
作为优选，步骤(6)中所述的分化培养基为含20％PEG(w/w)、1.0mg/LBA的MS培养基。
作为优选，步骤(7)中所述的生根培养基为含4.0mg/LNAA、0.5mg/LPP333的1/2MS改良培养基；所述的1/2MS改良培养基的组成如表1所示。
作为优选，步骤(8)中所述的水分胁迫处理的具体操作为：在智能温室大棚中，先将沙床苗单株种植于塑料桶中，当甘蔗长到具有6片完全叶时进行干旱处理，干旱处理是采取逐渐减少浇水量直至停止浇水的胁迫方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的方法可缩短甘蔗选育的时间，且操作简单、价格廉价，同时提供一种突破甘蔗属、种的近缘源杂交新途径，所获得的甘蔗植株比对照具有更好的耐旱特性。
附图说明
图1为本发明的方法培育获得甘蔗变异株、未变异株、对照叶片与斑茅叶片SRAP分子鉴定的聚丙烯凝胶电泳图；
有关附图标记的说明：
1为未变异株；2-8为变异株；9为ROC22-CK；10为斑茅-CK。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在下列实施例中，外源DNA为斑茅叶片提取，所用甘蔗材料为新台糖22号(ROC22)的茎段，采集于广西壮族自治区亚热带作物研究所的甘蔗种质资源圃，其中1/2MS改良培养基的组成见下表1。
表11/2MS改良培养基组成
实施例1：
一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，包括以下步骤：
(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至10cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接4圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下0.5cm新叶，切成1mm厚圆片；所述的诱导培养基为含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基；
(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，可结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；所述的继代培养基为含1.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基；
(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含1.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养10d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养2d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径为80目的细胞筛滤，即得到直径0.22mm的较分散的微小细胞粒；
(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含1.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为200μg/mL，将甘蔗愈伤小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；所述的斑茅总DNA是采用SDS方法提取斑茅叶片的总DNA；
(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有20％PEG(w/w)、1.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养10d；
(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；所述的PEG为聚乙二醇6000；所述的分化培养基为含20％PEG(w/w)、1.0mg/LBA的MS培养基；
(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；所述的生根培养基为含4.0mg/LNAA、0.5mg/LPP333的1/2MS改良培养基；所述的1/2MS改良培养基的组成如表1所示；
(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株；所述的水分胁迫处理的具体操作为：在智能温室大棚中，先将沙床苗单株种植于塑料桶中，当甘蔗长到具有6片完全叶时进行干旱处理，干旱处理是采取逐渐减少浇水量直至停止浇水的胁迫方法；
所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为2000Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为24℃。
实施例2：
一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，包括以下步骤：
(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至20cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接5圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下2cm新叶，切成2mm厚圆片；所述的诱导培养基为含3.0mg/L2，4-D、0.2mg/LNAA的MS培养基；
(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，可结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；所述的继代培养基为含2.0mg/L2，4-D、0.2mg/LNAA的MS培养基；
(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含3.0mg/L2，4-D、0.2mg/LNAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养14d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养4d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径150目的细胞筛滤，即得到直径0.1mm的较分散的微小细胞粒；
(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含2.0mg/L2，4-D、0.2mg/LNAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为400μg/mL，将甘蔗愈伤小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；所述的斑茅总DNA是采用SDS方法提取斑茅叶片的总DNA；
(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有20％PEG(w/w)、1.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养10d；
(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；所述的PEG为聚乙二醇6000；所述的分化培养基为含20％PEG(w/w)、1.0mg/LBA的MS培养基；
(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；所述的生根培养基为含4.0mg/LNAA、0.5mg/LPP333的1/2MS改良培养基；所述的1/2MS改良培养基的组成如表1所示；
(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株；所述的水分胁迫处理的具体操作为：在智能温室大棚中，先将沙床苗单株种植于塑料桶中，当甘蔗长到具有6片完全叶时进行干旱处理，干旱处理是采取逐渐减少浇水量直至停止浇水的胁迫方法；
所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为3000Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为28℃。
实施例3：
一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，包括以下步骤：
(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至15cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接5圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下1.5cm新叶，切成1.5mm厚圆片；所述的诱导培养基为含2.5mg/L2，4-D、0.15mg/LNAA的MS培养基；
(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，可结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；所述的继代培养基为含1.5mg/L2，4-D、0.15mg/LNAA的MS培养基；
(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含2.0mg/L2，4-D、0.15mg/LNAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养12d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养3d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径120目的细胞筛滤，即得到直径0.125mm的较分散的微小细胞粒；
(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含1.5mg/L2，4-D、0.15mg/LNAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为300μg/mL，将甘蔗愈伤小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；所述的斑茅总DNA是采用SDS方法提取斑茅叶片的总DNA；
(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有20％PEG(w/w)、1.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养10d；
(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；所述的PEG为聚乙二醇6000；所述的分化培养基为含20％PEG(w/w)、1.0mg/LBA的MS培养基；
(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；所述的生根培养基为含4.0mg/LNAA、0.5mg/LPP333的1/2MS改良培养基；所述的1/2MS改良培养基的组成如表1所示；
(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株；所述的水分胁迫处理的具体操作为：在智能温室大棚中，先将沙床苗单株种植于塑料桶中，当甘蔗长到具有6片完全叶时进行干旱处理，干旱处理是采取逐渐减少浇水量直至停止浇水的胁迫方法；
所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为2500Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为26℃。
将实施例1-3所选育得到的耐旱甘蔗植株和对照品种新台糖22号做抗旱能力测试，具体指标见表2。
表2本发明的方法选育得到的耐旱甘蔗植株的抗旱能力测试
注：①脯氨酸积累越多，越有利于植物抗旱，抗旱性越强；丙二醛积累越多，受害越严重，抗旱性越弱；叶绿素下降越少，越有利于植物抗旱；绿叶率伤害度越小，越有利于植物抗旱；②干旱胁迫的处理：收获实施例1、例2和例3中的耐旱植株的茎秆及对照ROC22茎秆，砍成单芽段，用清水浸种20h，放入人工智能气候箱内发芽，待芽长至2-3cm，选取长势一致的甘蔗芽进行盆栽种植，每个种植12盆，每盆4株，放智能温室大棚，进行正常的水肥管理，当甘蔗生长进入伸长后期处理，分正常淋水与干旱胁迫，当甘蔗叶片出现永久萎蔫、卷曲、枯黄等严重缺水症状时取+1叶叶片测定；③测试方法：脯氨酸含量采用磺基水杨酸法，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法，叶绿素含量采用分光光度法，绿叶率伤害度采用绿叶数、枯黄叶数统计法。
从表2可以看出，采用本发明的方法选育得到的耐旱甘蔗植株的抗旱能力得到明显增强，比对照具有更好的耐旱特性。本发明的方法缩短了甘蔗选育的时间，且操作简单、价格廉价，提供了一种突破甘蔗属、种的近缘杂交新途径。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至10-20cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接4-5圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；
(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，可结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；
(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含1.0-3.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养10-14d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L2，4-D、0.1mg/LNAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养2-4d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径为80-150目的细胞筛滤，即得到直径0.10-0.22mm的较分散的微小细胞粒；
(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含1.0-2.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为200-400μg/mL，将甘蔗愈伤小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；
(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有20％PEG(w/w)、1.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L2，4-D的MS培养基上进行光照培养10d；
(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；
(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；
(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株。
2.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为2000-3000Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为26±2℃。
3.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下0-2cm新叶，切成1-2mm厚圆片。
4.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的诱导培养基为含2.0-3.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基。
5.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的继代培养基为含1.0-2.0mg/L2，4-D、0.1-0.2mg/LNAA的MS培养基。
6.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的斑茅总DNA是采用SDS方法提取斑茅叶片的总DNA。
7.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(5)、步骤(6)中所述的PEG为聚乙二醇6000。
8.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的分化培养基为含20％PEG(w/w)、1.0mg/LBA的MS培养基。
9.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的生根培养基为含4.0mg/LNAA、0.5mg/LPP333的1/2MS改良培养基；所述的1/2MS改良培养基的组成如表1所示。
10.根据权利要求1所述的筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，步骤(8)中所述的水分胁迫处理的具体操作为：在智能温室大棚中，先将沙床苗单株种植于塑料桶中，当甘蔗长到具有6片完全叶时进行干旱处理，干旱处理是采取逐渐减少浇水量直至停止浇水的胁迫方法。
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|---|---|---|---|---|
| CN1566362A (zh) * | 2003-07-10 | 2005-01-19 | 福建农林大学 | 甘蔗斑茅杂种的dna鉴定方法 |
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