CN102719475A - 一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于植物基因工程领域的一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法。该方法不经过棉花组织培养的步骤，直接将含有目的基因质粒载体的活化农杆菌浸沾在去除生长点的棉花植株上，诱导不定芽生发，直至不定芽开花结铃，用抗生素筛选转基因植株。利用该方法进行棉花遗传转化，分化率高，筛选方法简单，节约棉花遗传转化的成本、缩短棉花遗传转化的时间。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法。
背景技术
棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的纤维和油料作物，在我国的工农业生产中占有十分重要的地位。高效快速培养出多种优良性状于一体的棉花优良品种是棉花生产中急需解决的难题。现代生物技术的不断发展为棉花育种提供了新途径。现代生物技术在植物育种中的应用大多是在植物组织培养技术的基础上获得成功的，因此，棉花的组织培养研究在棉花育种中颇受重视。在20世纪70年代，人们开始了棉花的各种器官、组织和细胞的培养，并获得了成功。目前，已建立了体细胞培养、花药培养、茎尖培养、胚珠和胚培养、原生质体培养等方面的技术体系。
棉花组织培养再生的研究取得了很大进展，已建立起陆地棉、海岛棉、非洲棉、克劳茨基棉、拟似棉等多个棉种的再生体系，在珍稀种质资源及其种间杂种的繁殖和保存、优良突变体和新种质的筛选和创造、棉花细胞分化和胚胎发生的机理、细胞的基因表达和调控、杂种优势的固定和遗传转化等方面取得了极其重要的研究成果，并成为棉花遗传转化的主要途径和手段之一。但仍存在一些问题，主要表现为：(1)组织培养中基因型的依赖性强，种间、品种间的再生能力差异很大。品种局限性是棉花组织培养的一个难题，棉花组织培养以Coker棉系最为成功，而其它大部分种、品种的再生率低。(2)培养过程复杂，周期长，重复性差。棉花组织培养再生植株均是经过多次继代培养而成功的，由于棉花组织培养的再生需要经过愈伤组织的诱导和增殖、胚状体的发生、胚的萌发和生根成苗等复杂的阶段，而且每一阶段都需要特定的条件，因此，对棉花体细胞胚胎的诱导条件以及胚成苗技术尚需做进一步研究，缩短再生时间。(3)体胚发生率低、畸形胚频率很高。胚性愈伤组织在长期的继代培养过程中易产生染色体变异，在胚胎发生过程中伴随着产生大量的异常胚状体，因而目前大量获得正常的再生棉株仍存在困难。由于畸形胚在棉花组织培养中的发生频率极高，如何使畸形胚萌发并转化为正常苗，就成为提高棉花组织培养植株再生率的关键。(4)对试材内源激素含量水平与所需最适外源激素浓度之间的关系缺少探讨。激素的调控对植物离体培养器官的分化非常重要，外源激素必需通过内源激素的平衡调节来达到控制器官发生的目的，各种生长物质的水平和比例都能影响培养物的基因表达从而影响器官的分化。
解决上述问题，建立起简易、高效的离体再生体系，是培育棉花新种质资源的瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用棉花分生组织进行农杆菌介导的遗传转化的方法。
一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)在田间、温室或人工气候室，进行棉花栽培；
(2)将含目的基因质粒载体的农杆菌菌株活化；
(3)待棉花植株长出1片真叶、2片真叶或3片真叶时，用手术刀轻轻将生长点切去，用含目的基因质粒载体的活化农杆菌浸沾生长点伤口部位；
(4)在不添加外源植物激素，或添加细胞分裂素条件下，诱导植株长出不定芽；
(5)向不定芽施加100ppm的卡那霉素、100ppm草甘膦或者200ppmBasta，10天后变黄的去除，绿色的保留，直到绿色不定芽开花结铃；
或者，不经过抗生素处理，直至不定芽开花结铃；
(6)收获铃中的棉花种子，在选择培养基上发芽筛选出绿色苗；
或者在种子田间播种出苗后喷施100ppm的卡那霉素、100ppm草甘膦或200ppm Basta，10天后黄苗去除，保留绿苗；
(7)将绿苗移入田间培养或田间原地培养，直至开花结铃，收获种子。
所述抗性基因为卡那霉素抗性基因、草甘膦抗性基因或草丁膦抗性基因。
所述添加细胞分裂素的浓度为0.1mM。
所述选择性培养基为MS培养基中添加100mg/1的卡那霉素、0.2mM Basta或0.3mM草甘膦。
本发明的有益效果：本发明的遗传转化方法，无需经过组织培养步骤，为棉花的遗传转化节约了成本、缩短了时间。本发明的方法重复性好，获得的遗传转化株系能稳定遗传，为棉花的高效、大规模转化提供了一种新方法，有利于棉花优质种质资源的培育。
附图说明
图1为实施例3转基因棉花的PCR检测；
图中，1-Trans 5K Maker、2～16-转基因棉花株系、17-含卡那抗性基因的质粒载体pCAMBia2300、18-苏棉12、19-ddH2O。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书，实施例中所述百分浓度如无特别说明均为质量百分浓度。
实施例1：含有目的基因质粒载体的农杆菌的准备
1)根癌农杆菌LBA4404感受态的制备
(1)从平板上挑取单菌落，接种到5ml YEB液体培养基(1L YEB培养基由1克酵母提取物，5克蛋白胨，20克蔗糖，0.5克7水合硫酸镁，125毫克链霉素Strep和水组成，用水补足体积)，28℃、250rpm振荡培养过夜。
(2)取2ml菌液，加入50ml YEB液体培养基(含Strep125mg/L)中，28℃、250rpm振荡培养至OD600约0.6左右。
(3)将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min，5000rpm离心5min。
(4)弃上清，沉淀用2ml 20mM CaCl2重悬，每份100μl分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用。
2)重组质粒DNA转入农杆菌
(1)将约1μg的含卡那霉素抗性基因的植物表达载体pCAMBia2300加入到100μl LBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。
(2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min。
(3)加入1ml YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4-5h。
(4)取适量菌液涂布到含Strep 250-300mg/L、Rif(利福平)250-300mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24-48h。
实施例2：利用分生组织进行农杆菌介导法进行棉花遗传转化
所用受体品种为苏棉12。
(1)4月底-5月初，在中国农业科学院生物技术研究所廊坊基地播种。
(2)含目的基因质粒载体的农杆菌活化：从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEB液体培养基中(Kan 100mg/L，Strep 100mg/L，Rif 300mg/L)，振荡培养过夜；取1ml菌液接种到50ml YEB液体培养基(Kan 100mg/L，Strep100mg/L，Rif 300mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.6-0.8(约3-4h)；5,000rpm离心5min，菌体用溶液(1/2MS无机+1％蔗糖+0.1％Triton X-100+0.01％Silwet L-77+50mg/l AS)或(1/2MS无机+1％蔗糖+0.1％Triton X-100+0.01％Silwet L-77+50mg/l AS+0.1mm 6-BA)进行重悬，并使菌体浓度达到OD为0.2左右。
(3)待棉花植株长出1片真叶，2片真叶或3片真叶时用手术刀轻轻将生长点切去，并用浸沾了含目的基因质粒载体的活化农杆菌的卫生纸覆盖在伤口处。
(4)向伤口处施加0.1mM细胞分裂素(或不施加)，1周后，在伤口周围长出不定芽，统计不定芽的数量，发现随苗龄增大，伤口四周长出的不定芽的数量就越多(表1)。
(5)等到不定芽萌发的枝条上长出3-4片叶子时，用100ppm的卡那霉素涂抹叶片，变黄的为不抗卡那霉素，不变黄的为抗卡那霉素，通过筛选，保留抗性芽分枝，使其开花结铃(也可不涂抹卡那霉素，全部保留不定芽，直至开花结铃)。
(6)将收获的种子在含100mg/l卡那霉素的MS培养基上进行筛选，黄苗为不抗卡那霉素，绿色苗为抗卡那霉素转基因植株，去除黄苗，保留绿苗(或者在种子田间播种出苗后喷施100ppm的卡那霉素，10天后黄苗去除，保留绿苗)。
(7)将绿苗移入田间培养或田间原地培养，直至开花结铃，收获种子。
统计步骤(6)抗性苗与非抗性苗的数量，计算转化效率，并分析不同处理之间转化效率的差别，结果发现，利用植株分生组织进行农杆菌介导的棉花遗传转化效率可达到2％左右(表1)。随处理苗龄的增大，伤口四周长出的不定芽的数量越多，但最终的转化效率在3个处理时期之间没有差别(表2)。另外，在农杆菌重悬液中添加6-BA，可以促进不定芽的萌发，但对最终的转化效率影响不大(表3)。
表1棉花遗传转化效率分析(1叶期，不添加6-BA)
| 播种量 | 萌发苗数 | 抗性苗 | 非抗性苗 | 转化效率％ | |
| 重复1 | 1500 | 1437 | 29 | 1408 | 2.02 |
| 重复2 | 1500 | 1465 | 31 | 1434 | 2.12 |
| 重复3 | 1500 | 1423 | 27 | 1396 | 1.90 |
| 平均 | 2.01 |
表2不同苗龄对转化效率的影响
| 苗龄 | 不定芽产生数量 | 转化效率 |
| 1叶期 | 3-5 | 2.01 |
| 2叶期 | 7-8 | 1.97 |
| 3叶期 | 7-10 | 1.95 |
表3农杆菌重悬液对转化效率的影响(1叶期)
| 处理 | 不定芽产生数量 | 转化效率 |
| 添加6-BA | 5 | 2.11 |
| 不添加6-BA | 3-4 | 2.01 |
实施例3：转基因棉花的分子检测
提取16株由实施例2获得的转基因棉花的基因组DNA，以F1(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)和R1(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)为引物(引物F1、R1根据卡那霉素抗性基因序列设定)进行PCR扩增，反应条件为：先94℃变性4min；再94℃ 1m，58℃ 1min，72℃50s，30个循环；再72℃延伸5min。以苏棉12(非转基因棉花)和ddH2O为阴性对照，以含卡那抗性基因的质粒载体pCAMBia2300为阳性对照。PCR产物电泳检测，结果如图1所示，泳道2-16扩增到预期大小的DNA条带(700bp左右)，说明目的基因已经转入棉花株系中。
Claims (5)
1.一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)在田间、温室或人工气候室，进行棉花栽培；
(2)将含目的基因质粒载体的农杆菌菌株活化；
(3)待棉花植株长出1片真叶、2片真叶或3片真叶时，用手术刀轻轻将生长点切去，用含目的基因质粒载体的活化农杆菌浸沾生长点伤口部位；
(4)在不添加外源植物激素，或添加细胞分裂素条件下，诱导植株长出不定芽；
(5)向不定芽施加100ppm的卡那霉素、100ppm草甘膦或者200ppm Basta，10天后变黄的去除，绿色的保留，直到绿色不定芽开花结铃；
或者，不经过抗生素处理，直至不定芽开花结铃；
(6)收获铃中的棉花种子，在选择培养基上发芽筛选出绿色苗；
或者在种子田间播种出苗后喷施100ppm的卡那霉素、100ppm草甘膦或200ppm Basta，10天后黄苗去除，保留绿苗；
(7)将绿苗移入田间培养或田间原地培养，直至开花结铃，收获种子。
2.根据权利要求1所述一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，所述含目的基因质粒载体还包含抗性基因。
3.根据权利要求2所述一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因、草甘膦抗性基因或草丁膦抗性基因。
4.根据权利要求1所述一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，所述添加细胞分裂素的浓度为0.1mM。
5.根据权利要求1所述一种利用棉花分生组织进行遗传转化的方法，其特征在于，所述选择性培养基为MS培养基中添加100mg/l的卡那霉素、0.2mM Basta或0.3mM草甘膦。
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