CN114568309A - 花生组培方法和花生遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种花生组培方法和花生遗传转化方法。其中，该花生组培方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；b)将愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；c)将芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；d)将不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株。该花生组培方法能够解决现有技术中传统花生组培再生方法的再生体系不适宜进行农杆菌转化的问题，适用于花生培育领域。

Description

花生组培方法和花生遗传转化方法

技术领域

本发明涉及花生培育领域，具体而言，涉及一种花生组培方法和花生遗传转化方法。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内广泛种植的油料作物和经济作物，种子中含有丰富的脂肪、蛋白、矿物质及维生素，具有很高的经济和营养价值，是我国优质食用油的重要来源。

随着分子生物学的发展，组织培养技术日渐成熟和完善，已经渗透到生物学科的各个领域，为研究植物细胞、组织分化及器官形态建成的规律提供试验条件，在作物的遗传改良过程中发挥重要的。

基因工程育种技术的应用，促进了花生品种选育和改良、适应性筛选鉴定、种质创新和遗传转化的研究，而高效的植株再生体系是开展花生基因工程研究的必要条件之一。花生组培再生方面，经过科学家的不断努力，建立起了花生多种组织、器官的再生体系。20世纪90年代以来，花生再生技术取得了巨大进展，目前在花生组织培养过程中，子叶、幼胚、成熟胚、胚轴、花粉、胚小叶或叶片及茎尖等作为外植体培养诱导获得再生植株。由于受花生基因型、激素类型及各激素比例、培养基成分、外植体类型及生理状态等因素的影响，花生再生体系尚不成熟，不同类型花生组织培养的效率还有待进一步提高。

农杆菌介导法是花生遗传转化最常用的方法之一。由于双子叶植物是农杆菌的天然宿主，80％以上的双子叶植物遗传转化是通过农杆菌介导法进行的。由于农杆菌介导法具有操作简便、一般以单拷贝形式插入外源基因、费用低、遗传稳定性好等优点，该方法成为目前主流、首选的植物遗传转化方法。1994年，印度EaPen首次通过农菌介导法，获得β-葡糖甘酸酶(Gus)活性和抗卡那霉素的转基因花生。乔利仙等以胚小叶为外植体，利用农杆菌介导法，获得了转基因植株。丁霄等和宋汝涛等分别以花生幼叶和子叶为外植体，利用农杆菌介导法，将含木糖异构酶基因的表达载体导入花生，用木糖筛选获得转基因植株。

经过多年的研究，花生组培再生及农杆菌介导遗传转化方面取得了巨大的进展，但还存在诸多问题。花生组培再生方面，大多数为器官直接再生，虽然周期短、成苗快，但该再生体系用于农杆菌介导转化，出现嵌合体多、假阳性高、转化效率低、重复性差、有较强的基因型依赖性。虽然花生愈伤诱导比较容易，但转化成胚性愈伤比较难、成苗率低、发育成正常植株比较困难。因此，建立一种再生率高、适用于不同基因型花生品种、周期短、成熟可靠的花生植株再生和遗传转化体系具有重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种花生组培方法和花生遗传转化方法，以解决现有技术中传统花生组培再生方法的再生体系不适宜进行农杆菌转化的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种花生组培方法，该花生组培方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；b)将愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；c)将芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；d)将不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株；芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

进一步地，胚小叶通过如下步骤获取：从花生膨大期的荚果中剥离种子，去掉种皮，获取幼胚；从幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；从种胚基部处切断含有胚小叶的种胚，获得胚小叶；优选地，含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：1)从幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；2)对含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；3)将消毒后的含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得含有胚小叶的种胚；优选地，消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；优选地，酒精的浓度为60～80v/v％；优选地，酒精的浸泡时间为0.1～5min；优选地，HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；优选地，灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；优选地，培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

进一步地，a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得愈伤组织；优选地，b)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得芽丛；优选地，c)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，进行伸长培养，获得长度至3cm的不定芽；优选地，d)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得花生再生植株。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种花生遗传转化方法，该花生遗传转化方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织，并将愈伤组织切段获得外植体；b)将外植体置于农杆菌悬浮液中，振荡侵染，并在负压环境下真空处理，获得农杆菌侵染的外植体；c)将农杆菌侵染的外植体接种至芽丛诱导培养基，培养获得侵染愈伤组织；d)将侵染愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得第一不定芽；e)将第一不定芽接种至筛选培养基，培养获得抗性芽丛；f)将抗性芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得第二不定芽；g)将第二不定芽接种至生根培养基，培养获得转基因花生植株；利用MS悬浮培养基将农杆菌菌体重悬至OD₆₀₀为0.6～0.8，并加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度50～100μm/L，加入表面活性剂Silwet L-77至终浓度0.05～1v/v％，获得农杆菌悬浮液；MS悬浮培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖45～55g/L，6-BA 10～20μg/mL；芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；筛选培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，抗生素30～50mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

进一步地，胚小叶通过如下步骤获取：从荚果膨大期的花生中获取幼胚；从幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；从种胚基部处切断含有胚小叶的种胚，获得胚小叶；优选地，含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：1)从幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；2)对含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；3)将消毒后的含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得含有胚小叶的种胚。

进一步地，消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；优选地，酒精的浓度为60～80v/v％；优选地，酒精的浸泡时间为0.1～5min；优选地，HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；优选地，灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；优选地，培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

进一步地，a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得愈伤组织；优选地，振荡侵染时间为10～30min；优选地，负压环境的气压为0.06～1MP；优选地，真空处理时间为15～30min。

进一步地，c)包括：用滤纸吸净农杆菌侵染的外植体的表面菌液后，转接到芽丛诱导培养基上，在25～30℃、黑暗条件下共培养农杆菌侵染的外植体和农杆菌4天，培养获得侵染愈伤组织；优选地，d)包括：将侵染愈伤组织接种到芽丛诱导培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得第一不定芽；优选地，e)包括：将第一不定芽接种到筛选培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养10～20天，存活即为抗性芽丛；优选地，f)包括：将抗性芽丛接种到分化伸长培养基中，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养获得3cm长的第二不定芽；优选地，g)包括：将第二不定芽接种至生根培养基，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得转基因花生植株；优选地，抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或壮观霉素中的一种或多种。

进一步地，在e)和f)之间，取部分侵染愈伤组织浸没在GUS染色液中，37℃孵育1～24h后，用70v/v％乙醇脱去样本的叶绿素，鉴定农杆菌转化是否成功；优选地，GUS染色液为以体积比1:50混合X-Gluc母液和GUS缓冲液，X-Gluc母液包括溶剂为DMF或DMSO的20mM X-Gluc溶液，GUS缓冲液包括21.84g/L Na₂HPO₄·12H₂O和6.08g/L NaH₂PO₄·12H₂O、3.72g/LEDTA-Na₂、0.32g/L铁氰化钾、0.42g/L亚铁氰化钾和1mL/L Triton X-100；优选地，70v/v％乙醇处理时间为1～3h。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种上述花生组培方法，或花生遗传转化方法，在花生品种再生、遗传转化或育种上的应用。

应用本发明的技术方案，利用上述花生组培方法，利用该方法中的多种培养基和组培步骤，使花生组培方法的获得的再生体系适宜进行农杆菌转化。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例1的花生组织培养各分化时期形态特征的照片，其中：a，荚果膨大期的花生荚果及种子；b，花生种子、子叶及胚；c，花生含有胚小叶的种胚；d，胚小叶培养4天的愈伤组织；e，愈伤组织诱导培养24天的芽丛；f，芽丛分化形成的不定芽；g，生长到2～3cm的不定芽；h，生根的花生再生植株。

图2示出了根据本发明实施例2的不同花生品种组织培养的照片，其中a～i分别代表不同基因型品种。

图3示出了根据本发明实施例3的不同农杆菌侵染花生外植体效率的示意图。

图4示出了根据本发明实施例3的花生农杆菌遗传转化不同培养时期的组织GUS染色鉴定，其中：a，胚小叶GUS染色鉴定；b，芽丛GUS染色鉴定；c，组培苗GUS染色鉴定。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，由于受花生基因型、激素类型及各激素比例、培养基成分、外植体类型及生理状态等因素的影响，而使花生再生体系芽丛诱导率和成苗率较低、畸形苗多、生长慢、生根难、不易进行农杆菌转化的问题。因而，在本申请中发明人尝试开发了一种花生组培方法，能够克服传统花生组培再生方法的再生体系不适宜进行农杆菌转化的问题。因而提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种花生组培方法，该花生组培方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；b)将愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；c)将芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；d)将不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株；芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

MS液体培养基可以为市售的MS液体培养基；或利用市售的MS培养基(如PhytoTech M404、Phyto Tech M519等)，将干粉溶解后获得；也可以自行配置获得。自行配置的MS液体培养基包括母液Ⅰ50mL/L，母液Ⅱ、母液Ⅲ和母液Ⅳ分别5mL/L。其中，1L母液Ⅰ中包括NH₄NO₃ 33g、KNO₃ 38g、CaCl₂·2H₂O 0.8g、MgSO₄·7H₂O 7.4g和KH₂PO₄ 3.4g，母液Ⅰ也称为20×大量元素；1L母液Ⅱ中包括KI 16.6mg、H₃BO₃ 1.24g、MnSO₄·4H₂O 4.46g、ZnSO₄·7H₂O1.72g、Na₂MoO₄·2H₂O 50mg、CuSO₄·5H₂O 5mg和CoCl₂·6H₂O 5mg，母液Ⅱ也称为200×微量元素；1L母液Ⅲ包含FeSO₄·7H₂O 5.56g和EDTA-Na₂·2H₂O 7.46g，母液Ⅲ也称为200×铁盐；1L母液Ⅳ中包括肌醇20g、烟酸100mg、盐酸吡哆醇(维生素B6)100mg、盐酸硫胺素(维生素B1)20mg和甘氨酸400mg，母液Ⅳ也称为200×有机成分。

利用上述花生组培方法，利用芽丛诱导培养基、分化伸长培养基和生根培养基，将花生从胚小叶逐步培养为愈伤组织、芽丛、不定芽和花生再生植株。利用此种花生组培方法，操作简单、取材容易，通过花生胚小叶再分化的方法，能够短时间内获得大量优良的花生再生植株。能够解决由于受花生基因型、激素类型及各激素比例、培养基成分、外植体(愈伤组织)类型及生理状态等因素的影响，而使花生再生体系芽丛诱导率和成苗率较低、畸形苗多、生长慢和生根难的问题。使用芽丛诱导培养基来诱导不定芽的形成，能够大大提高了愈伤组织的再分化率，芽丛诱导率是57.36～95.36％，多数品种的诱导率达到80％以上，而现有的花生芽丛培养方法中芽丛诱导率为25.51～93.01％，本专利中使用的方法芽丛诱导率比现有的方法明显提高。

在现有技术中，诱导形成的芽丛如果继续放在芽丛诱导培养基上，芽丛则不再伸长生长，最终形成畸形芽。在上述花生组培方法中，将已形成的芽丛放到伸长培养基上继续培养，能够形成正常的不定芽，进而形成正常的组培苗，成苗率达到了15％以上，大大提高了芽丛的生长成正常化生植株的概率。该花生组培方法操作简单，重复性好，能够适用于不同基因型的花生品种。该花生组培方法和利用花生组培方法获得的植物组织，均属于花生的再生体系。

在一种优选的实施例中，胚小叶通过如下步骤获取：从花生膨大期的荚果中剥离种子，去掉种皮，获取幼胚；从幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；从种胚基部处切断含有胚小叶的种胚，获得胚小叶；优选地，含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：1)从幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；2)对含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；3)将消毒后的含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得含有胚小叶的种胚；优选地，消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；优选地，酒精的浓度为60～80v/v％；优选地，酒精的浸泡时间为0.1～5min；优选地，HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；优选地，灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；优选地，培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

利用新鲜的花生种子幼胚作为外植体，由于种子活力较高，可以在使用较少种子的情况下获得大量优良的花生再生植株。利用上述方法，能够从花生中获得胚小叶。利用多种消毒方法，对胚小叶进行处理，防止在后续花生组织培养中，由于杂菌污染导致的组织培养失败。对消毒后的胚小叶进行清洗，能够防止胚小叶上残留的消毒试剂影响胚小叶的活性。在消毒和清洗后，对胚小叶进行培养孵育，能够提高胚小叶的细胞活性，利于后续胚小叶的细胞增殖，减少培养所需时间。

在一种优选的实施例中，a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得愈伤组织；优选地，b)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得芽丛；优选地，c)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，进行伸长培养，获得长度至3cm的不定芽；优选地，d)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得花生再生植株。

利用上述优化的组培条件，能够在适宜的条件下对胚小叶进行培训，促进胚小叶逐步向愈伤组织、芽丛、不定芽和花生再生植株增殖分化。各步骤的培养条件为针对花生优化的组织培养条件，也可以在实际应用中根据实际条件的不同进行灵活调整。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种花生遗传转化方法，该花生遗传转化方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织，并将愈伤组织切段获得外植体；b)将外植体置于农杆菌悬浮液中，振荡侵染，并在负压环境下真空处理，获得农杆菌侵染的外植体；c)将农杆菌侵染的外植体接种至芽丛诱导培养基，培养获得侵染愈伤组织；d)将侵染愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得第一不定芽；e)将第一不定芽接种至筛选培养基，培养获得抗性芽丛；f)将抗性芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得第二不定芽；g)将第二不定芽接种至生根培养基，培养获得转基因花生植株；利用MS悬浮培养基将农杆菌菌体重悬至OD₆₀₀为0.6～0.8，并加入AS(乙酰丁香酮，Acetosyringone)至终浓度50～100μM/L，加入表面活性剂Silwet L-77使终浓度是0.05～1v/v％，获得农杆菌悬浮液；MS悬浮培养基为：每1L MS液体培养基中加入45～55g蔗糖和10～20μL 6-BA(1mg/mL)；芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；筛选培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，抗生素30～50mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

利用上述花生遗传转化方法，将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织后，将愈伤组织切段获得外植体。将外植体置于农杆菌悬浮液中进行侵染，利用农杆菌向外植体中转化外源基因。农杆菌中可以包括质粒载体，质粒载体上可以带有用于筛选的抗性基因和用于表达的外源基因。在适宜带有相应抗生素的培养基中培养农杆菌，农杆菌包括但不限于LBA4404、GV3101、AGL1、EHA101或EHA105等常用农杆菌。在适宜条件下培养并离心收集农杆菌菌体，并利用液体培养基重悬，以获得农杆菌悬浮液。在农杆菌转化的过程中，利用真空处理的方法，能够增加农杆菌侵染外植体的效率。在农杆菌转化后，通过带有相应抗生素的筛选培养基对转化有质粒载体或外源基因的不定芽进行筛选，获得农杆菌转化成功的抗性芽丛。利用分化伸长培养基和生根培养基对抗性芽丛进行逐步培养，最终获得转基因花生植株。

AS(乙酰丁香酮)能够诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA(转移DNA)的加工与转移，从而使农杆菌T-DNA更易进入植物基因组并与其整合。Silwet L-77为一种高效有机硅表面活性剂，能够极大降低水的表面活性剂，从而增加农杆菌与外植体的接触面积，提高农杆菌转化的效率。上述花生遗传转化方法通过在农杆菌悬浮液中加入AS和Silwet L-77，并采用真空处理，能够极大地提高农杆菌转化效率。

使用芽丛诱导培养基来诱导不定芽的形成，能够大大提高了愈伤组织的再分化率，芽丛诱导率是57.36～95.36％，多数品种的诱导率达到80％以上，而现有的花生芽丛培养方法中芽丛诱导率为25.51～93.01％，本专利中使用的方法芽丛诱导率比现有的方法明显提高。在现有技术中，诱导形成的芽丛如果继续放在芽丛诱导培养基上，芽丛则不再伸长生长，最终形成畸形芽。在上述花生遗传转化方法中，将已形成的芽丛放到伸长培养基上继续培养，能够形成正常的不定芽，大大提高了芽丛的生长效率。该花生遗传转化方法操作简单，重复性好，能够适用于不同基因型的花生品种。

在一种优选的实施例中，胚小叶通过如下步骤获取：从荚果膨大期的花生中获取幼胚；从幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；从种胚基部处切断含有胚小叶的种胚，获得胚小叶；优选地，含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：1)从幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；2)对含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；3)将消毒后的含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得含有胚小叶的种胚。

在一种优选的实施例中，消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；优选地，酒精的浓度为60～80v/v％；优选地，酒精的浸泡时间为0.1～5min；优选地，HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；优选地，灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；优选地，培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

利用上述方法，能够从花生中获得胚小叶。利用多种消毒方法，对胚小叶进行处理，防止在后续花生组织培养和遗传转化中，由于杂菌污染导致的失败。对消毒后的胚小叶进行清洗，能够防止胚小叶上残留的消毒试剂影响胚小叶的活性。在消毒和清洗后，对胚小叶进行培养孵育，能够提高胚小叶的细胞活性，利于后续胚小叶的细胞增殖，减少培养所需时间。

在一种优选的实施例中，a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得愈伤组织；优选地，振荡侵染时间为10～30min；优选地，负压环境的气压为0.06～1MP；优选地，真空处理时间为15～30min。

在一种优选的实施例中，c)包括：用滤纸吸净农杆菌侵染的外植体的表面菌液后，转接到芽丛诱导培养基上，在25～30℃、黑暗条件下共培养农杆菌侵染的外植体和农杆菌4天，培养获得侵染愈伤组织；优选地，d)包括：将侵染愈伤组织接种到芽丛诱导培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得第一不定芽；优选地，e)包括：将第一不定芽接种到筛选培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养10天，存活即为抗性芽丛；优选地，f)包括：将抗性芽丛接种到分化伸长培养基中，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养获得3cm长的第二不定芽；优选地，g)包括：将第二不定芽接种至生根培养基，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得转基因花生植株；优选地，抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或壮观霉素中的一种或多种。

利用上述优化的遗传转化条件，能够在适宜的条件下对胚小叶进行培训，促进胚小叶生成愈伤组织，高效地被农杆菌侵染后逐步向花生再生植株增殖分化。各步骤的培养条件为针对花生所优化的遗传转化条件，也可以在实际应用中根据实际条件的不同进行灵活调整。

在一种优选的实施例中，在e)和f)之间，取部分侵染愈伤组织浸没在GUS染色液中，37℃孵育1～24h后，用70v/v％乙醇脱去样本的叶绿素，鉴定农杆菌转化是否成功；优选地，GUS染色液的配方为以体积比1:50混合X-Gluc母液和GUS缓冲液，其中，X-Gluc母液包括溶剂为DMF或DMSO的20mM X-Gluc溶液，GUS缓冲液包括21.84g/L Na₂HPO₄·12H₂O和6.08g/LNaH₂PO₄·12H₂O、3.72g/L EDTA-Na₂、0.32g/L铁氰化钾、0.42g/L亚铁氰化钾和1mL/LTriton X-100；优选地，70v/v％乙醇处理时间为1～3h。

X-Gluc母液是用N-N-二甲基酰胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)将X-Gluc粉末溶解配成20mM的贮存液；GUS缓冲液(500mL)配方是首先分别称取10.92g Na₂HPO₄·12H₂O和3.04g NaH₂PO₄·12H₂O溶于400mL去离子水中，然后依次加入1.86g EDTA-Na₂、0.16g铁氰化钾、0.21g亚铁氰化钾和500μL Triton X-100，完全溶液后，定容至500mL。

在上述质粒载体上可以带有GUS基因，即β-葡萄糖苷酸酶基因，能够在农杆菌和转化有农杆菌的植物组织中表达β-葡萄糖苷酸酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物。由于绝大多数植物中没有葡萄糖苷酸酶，因此利用该基因和其代谢的产物，能够检测质粒载体上的外源基因是否转化进入农杆菌中。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种花生组培方法，或花生遗传转化方法，在花生品种再生、遗传转化或育种上的应用。此外，也可以用于其他可能的应用，比如，利用该组培方法获得的再生植株进行突变体的筛选等。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

实施例1：花生品种山花9号的诱导幼胚再分化形成花生再生植株

(1)花生无菌幼胚消毒浸种：选取花生品种山花9号荚果膨大期鲜嫩幼胚，将含有胚小叶的种胚小心剥离，放置到50mL小烧杯中，加入适量70v/v％酒精浸泡种胚1min；倒掉酒精后加入适量的0.1wt％HgCl₂溶液，将烧杯转移至超净工作台利用HgCl₂溶液消毒15min。灭菌水冲洗5次，每次冲洗5min。冲洗完后，将种胚转移至三角瓶中，加入适量无菌水封口浸泡，27℃培养箱中孵育16h-18h。

(2)花生无菌外植体的获取：在超净工作台里，将步骤(1)获得的胚小叶从靠近种胚基部的地方切下，接种到芽丛诱导培养基上，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h循环的条件下，预培养4天，诱导愈伤分化，获得愈伤组织。芽丛诱导培养基的配方包括：MS培养基、蔗糖25～35g/L、6-BA 3.5～4.0mg/L、NAA 0.65～0.75mg/L、琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(3)花生不定芽的诱导分化：将步骤(2)中获得的愈伤组织接种到芽丛诱导培养基上，在27℃、光照16h、黑暗8h循环的条件下，培养20～30天。芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(4)花生芽丛的分化伸长培养：将步骤(3)中获得的芽丛接种到分化伸长培养基中，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h条件下，进行不定芽的伸长培养。分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(5)生根培养：当步骤(4)中不定芽伸长至3cm时，转移至生根培养基中，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h条件下，培养20～30天。生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。花生组织培养各分化时期的形态特征参见图1。

利用本再生体系进行花生组织培养，其芽丛最高诱导率是95.36％，平均芽丛诱导率是81.90％；再生苗的成苗率为15.87～29.28％，平均成苗率是23.37％。

实施例2：不同基因型的花生品种的再生体系建立

具体操作同实施例1，不同花生品种的芽丛诱导时期的形态如图2所示，其中，a为狮头企品种，b为海花1品种，c为鲁花14品种，d为伏花生品种，e为山花9品种，f为丰花1号品种，g为潍花8品种，h为四粒红品种，i为花育31品种。

芽丛诱导率如表1所示：芽丛诱导率大于80％的品种有狮头企、海花1、鲁花14、伏花生、山花9、丰花1号，最高为狮头企，达到95.36％。

表1不同基因型花生品种的芽丛诱导率

诱导分化成苗的概率如表2所示：成苗率大于25％的品种有狮头企、海花1和伏花生，最高为狮头企，达到29.28％。

表2不同基因型花生品种的成苗率

利用本再生体系进行花生组织培养，芽丛诱导率是57.36～95.36％，最高诱导率是95.36％；由芽丛诱导分化形成正常组培苗的成苗诱导率是15.87～29.28％，显著提高了芽丛诱导率和成苗率。

实施例3：花生品种山花9号的农杆菌介导遗传转化

(1)消毒浸种：选取花生品种山花9号荚果膨大期鲜嫩幼胚，将含有胚小叶的种胚小心剥离，加入适量70v/v％酒精浸泡种胚1min；倒掉酒精后，加入适量0.1％HgCl₂溶液，转移至超净工作台消毒15min；灭菌水冲洗5次，每次冲洗5min。冲洗完后，转移至三角瓶中，加入适量无菌水封口浸泡，27℃培养箱中孵育16h-18h。

(2)预培养：在超净工作台里，将步骤(1)获得的胚小叶从靠近种胚基部的地方切下，接种到芽丛诱导培养基上，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h条件下，预培养4天，诱导愈伤分化，将培养获得的愈伤组织切段，获得外植体。

(3)农杆菌悬染液的制备：利用含有卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因的质粒载体，构建2×35S-GUS的表达载体，并分别转入农杆菌LBA4404、GV3101、AGL1、EHA101和EHA105中。取200μL活化的农杆菌加入至30mL含抗生素Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)新鲜YEP液体培养基中，相同条件下过夜培养。5000rpm、4℃下将菌液离心10min，用MS液体培养基将菌液悬浮至OD₆₀₀为0.8，并加入终浓度为100μM AS和0.05v/v％Silwet L-77。MS液体培养基配方：MS(2.215g)+蔗糖(45～55g)+1mg/ml 6-BA(10μL)。

(4)农杆菌侵染外植体：在超净工作台中，将步骤(2)中的外植体置于含有100μMAS和0.05v/v％Silwet L-77的含有2×35S-GUS的表达载体的农杆菌悬浮液中，振荡侵染10～30min，然后在真空0.06～1MP的条件下，真空处理15～30min。

(5)共培养：用滤纸将步骤(4)中农杆菌侵染过的外植体表面菌液吸净，将其转接到芽丛诱导培养基上，在27℃、黑暗条件下共培养4天。

(6)花生不定芽的诱导分化：将步骤(5)中获得的愈伤组织接种到芽丛诱导培养基上，在27℃、光照16h、黑暗8h循环的条件下，培养20～30天。芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(7)花生芽丛的分化伸长培养：将步骤(6)中获得的芽丛接种到分化伸长培养基中，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h条件下，进行不定芽的伸长培养。分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(8)生根培养：当步骤(4)中不定芽伸长至3cm时，转移至生根培养基中，在27℃、光照强度1500～3000Lux、光照16h、黑暗8h条件下，培养20～30天。生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

(9)GUS染色鉴定：取步骤(5)、(6)和(8)中获得的的愈伤组织和组培苗加入适量GUS染色液(X-Gluc:GUS缓冲液＝50μl：450μl)，使GUS染色液完全浸没组织，37℃孵育1-24h。用70v/v％乙醇脱去样本的叶绿素，一般浸没于乙醇1-3h，至阴性对照成白色。通过肉眼观察，染色后的愈伤组织为蓝色，即表示农杆菌成功转入花生组织中，获得阳性愈伤组织。

利用上述农杆菌侵染方法，筛选出转化效率最佳的农杆菌菌种。我们选择了LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105和AGL1五个农杆菌菌种，利用GUS染色来计算农杆菌转化率。5个农杆菌菌种的转化效率参见图3，分别是62.76％、57.20％、52.815％、45.895％和40.26％。

花生遗传转化过程中，不同培养时期的组织GUS染色鉴定参考图4。

用于GUS染色的胚小叶是农杆菌侵染后，共培养4天后的胚小叶。也就是上述侵染愈伤组织；用于GUS染色的芽丛是芽丛诱导培养14天的愈伤组织；用于GUS染色的组培苗是芽丛在分化伸长培养基上培养28天分化出来的组培苗。

本申请在农杆菌介导遗传转化的过程中，制备农杆菌悬浮液时添加了AS和SilwetL-77以及在侵染过程中使用负压处理，农杆菌转化率达到60％，是传统的方法(农杆菌悬浮液中不含AS和Silwet L-77，无负压处理，农杆菌转化率23.07％)转化效率的2.6倍，农杆菌转化效率大大提高。

使用本申请中农杆菌介导遗传转化的方法，利用农杆菌LBA4404侵染花生，比较了侵染后共培养天数对农杆菌转化率的影响，不同培养天数农杆菌转化率参考表3，农杆菌转化率为10％～57.89％，其中暗培养4天时农杆菌的转化效率最高，达到57.89％。由此可见，农杆菌侵染后最佳暗培养天数是4天。

表3不同暗培养天数的农杆菌侵染效率(％)

从表3中可知，通过实验验证，培养时间短或者时间过长对都不利于愈伤的生长，培养4天是共培养的最佳天数。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用本申请的花生组培方法和花生遗传转化方法，能够短时间内获得大量优良的花生组培苗，且操作简单、转化效率高，为深入进行花生遗传转化、性状改良及分子育种提供技术支撑。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种花生组培方法，其特征在于，所述花生组培方法包括：

a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；

b)将所述愈伤组织接种至所述芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；

c)将所述芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；

d)将所述不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株；

所述芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；

所述分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；

所述生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

2.根据权利要求1所述的花生组培方法，其特征在于，所述胚小叶通过如下步骤获取：

从花生膨大期的荚果中剥离种子，去掉种皮，获取幼胚；

从所述幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；

从种胚基部处切断所述含有胚小叶的种胚，获得所述胚小叶；

优选地，所述含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：

1)从所述幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；

2)对所述含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；

3)将消毒后的所述含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得所述含有胚小叶的种胚；

优选地，所述消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；

更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；

优选地，所述酒精的浓度为60～80v/v％；

优选地，所述酒精的浸泡时间为0.1～5min；

优选地，所述HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；

优选地，所述灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；

优选地，所述培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

3.根据权利要求1所述的花生组培方法，其特征在于，所述a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得所述愈伤组织；

优选地，所述b)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得所述芽丛；

优选地，所述c)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，进行伸长培养，获得长度至3cm的所述不定芽；

优选地，所述d)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得所述花生再生植株。

4.一种花生遗传转化方法，其特征在于，所述花生遗传转化方法包括：

a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织，并将所述愈伤组织切段获得外植体；

b)将所述外植体置于农杆菌悬浮液中，振荡侵染，并在负压环境下真空处理，获得农杆菌侵染的外植体；

c)将所述农杆菌侵染的外植体接种至所述芽丛诱导培养基，培养获得侵染愈伤组织；

d)将所述侵染愈伤组织接种至所述芽丛诱导培养基，培养获得第一不定芽；

e)将所述第一不定芽接种至筛选培养基，培养获得抗性芽丛；

f)将所述抗性芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得第二不定芽；

g)将所述第二不定芽接种至生根培养基，培养获得转基因花生植株；

利用MS悬浮培养基将农杆菌菌体重悬至OD₆₀₀为0.6～0.8，并加入乙酰丁香酮至终浓度50～100μm/L，加入表面活性剂Silwet L-77至终浓度0.05～1v/v％，获得所述农杆菌悬浮液；

所述MS悬浮培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖45～55g/L，6-BA 10～20μg/mL；

所述芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；

所述筛选培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，抗生素30～50mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；

所述分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；

所述生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。

5.根据权利要求4所述的花生遗传转化方法，其特征在于，

所述胚小叶通过如下步骤获取：

从荚果膨大期的花生中获取幼胚；

从所述幼胚中剥离含有胚小叶的种胚；

从种胚基部处切断所述含有胚小叶的种胚，获得所述胚小叶；

优选地，所述含有胚小叶的种胚通过如下步骤获取：

1)从所述幼胚中剥离获得含有胚小叶的未处理种胚；

2)对所述含有胚小叶的未处理种胚进行消毒处理；

3)将消毒后的所述含有胚小叶的未处理种胚浸泡于灭菌水中培养孵育，获得所述含有胚小叶的种胚。

6.根据权利要求5所述的花生遗传转化方法，其特征在于，所述消毒包括依次进行的酒精消毒、HgCl₂溶液消毒以及紫外消毒；

更优选地，消毒后还包括灭菌水冲洗的步骤；

优选地，所述酒精的浓度为60～80v/v％；

优选地，所述酒精的浸泡时间为0.1～5min；

优选地，所述HgCl₂溶液的浓度为0.05～0.5wt％；

优选地，所述灭菌水冲洗包括利用灭菌水冲洗2～5次，每次冲洗3～5min；

优选地，所述培养孵育的条件为：25～30℃孵育16～18h。

7.根据权利要求4所述的花生遗传转化方法，其特征在于，所述a)包括：在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，预培养4天，获得所述愈伤组织；

优选地，振荡侵染时间为10～30min；

优选地，所述负压环境的气压为0.06～1MP；

优选地，真空处理时间为15～30min。

8.根据权利要求4所述的花生遗传转化方法，其特征在于，所述c)包括：用滤纸吸净所述农杆菌侵染的外植体的表面菌液后，转接到所述芽丛诱导培养基上，在25～30℃、黑暗条件下共培养所述农杆菌侵染的外植体和所述农杆菌4天，培养获得所述侵染愈伤组织；

优选地，所述d)包括：将所述侵染愈伤组织接种到所述芽丛诱导培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得所述第一不定芽；

优选地，所述e)包括：将所述第一不定芽接种到所述筛选培养基上，在25～30℃、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养10～20天，存活即为所述抗性芽丛；

优选地，所述f)包括：将所述抗性芽丛接种到所述分化伸长培养基中，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养获得3cm长的所述第二不定芽；

优选地，所述g)包括：将所述第二不定芽接种至所述生根培养基，在25～30℃、光照强度1500～3000Lux、光照14～18h、黑暗10～6h条件下，培养20～30天，获得所述转基因花生植株；

优选地，所述抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或壮观霉素中的一种或多种。

9.根据权利要求4所述的花生遗传转化方法，其特征在于，在所述e)和所述f)之间，取部分所述侵染愈伤组织浸没在GUS染色液中，37℃孵育1～24h后，用70v/v％乙醇脱去样本的叶绿素，鉴定农杆菌转化是否成功；

优选地，所述GUS染色液为以体积比1:50混合X-Gluc母液和GUS缓冲液，

X-Gluc母液包括溶剂为DMF或DMSO的20mM X-Gluc溶液，

GUS缓冲液包括21.84g/L Na₂HPO₄·12H₂O和6.08g/L NaH₂PO₄·12H₂O、3.72g/L EDTA-Na₂、0.32g/L铁氰化钾、0.42g/L亚铁氰化钾和1mL/L Triton X-100；

优选地，所述70v/v％乙醇处理时间为1～3h。

10.权利要求1至3中任一项所述的花生组培方法，或权利要求4至9中任一项所述的花生遗传转化方法，在花生品种再生、遗传转化或育种上的应用。

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