CN105200080B - 一种番茄的高效快速稳定基因转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：1）菌种活化；2）植物材料准备；3）侵染；4）筛选培养。本发明的方法提高了番茄转基因效率，转化率可达到30%以上。将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对番茄叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。

Description

一种番茄的高效快速稳定基因转化方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种番茄的高效快速稳定基因转化方法。

背景技术

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界上重要的食用作物。它品种多，产量高，营养丰富，用途广泛。Micro-Tom是一种番茄突变体，它保留了普通番茄作为模式植物的基本特征，但植株矮小、生命周更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的巨大优势。随着近年来分子生物学和基因工程的飞速发展，研究热点转向番茄种质资源优良基因的深度挖掘，并进行分子标记和基因表达序列的鉴定和测定。同时在抗逆性、耐贮运、风味品质等遗传改良等方面的研究结果相继有所报道，番茄育种正朝着分子育种方向发展。而番茄分子育种的过程中最重要的手段就是番茄转基因。另一方面，对于Micro-Tom来说，从播种开花到结果，生命周期短，一年中能够多次成花，花序多，可以四季结果。该品种植株矮小，种植方便。可以作为一种模式植物来研究，尤其是在研究果实的生长发育方面，研究番茄的果实生长发育机理更容易，具有高效快速的优点。

目前常用的番茄基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是番茄遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常用的一种转基因方法。虽然番茄的遗传转化技术路线成熟，但是传统方法费事费力，耗时间长，操作繁琐而且效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来了障碍。传统的农杆菌介导法操作过程比较繁琐，在转基因的过程中容易出现许多问题，比如合适载体的选择、合适菌株的选择、杂菌的污染、农杆菌无法抑制、菌液浓度过高或者过低导致转基因不成功、侵染时间长短的控制等等，这些问题都会影响番茄转基因的效率以及速度，传统方法获得的番茄植株转基因效率不到百分之一。因此如何获得一个高效快速的番茄稳定转化体系，是番茄转基因中亟待解决的一个问题。本发明就将解决这一问题，建立了一个高效、快速、稳定的Micro-Tom番茄遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法改良番茄品种提供实践基础，有利于今后番茄分子育种工作的发展。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种番茄的高效快速稳定基因转化方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种番茄的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：

1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D的农杆菌EHA105在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3；

2）植物材料准备：番茄种子种植于S1培养基上，10天以后长出两片子叶，去子叶将子叶用剪刀剪成0.4 cm²的叶块用于菌液侵染；

3）侵染：悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染30～40 分钟，过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；

4）筛选培养：侵染后的叶片接种在番茄转基因培养基S2上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2℃，光照培养，培养20天左右，番茄叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量，保留下的抗性愈伤经过约40d左右的培养以后，可分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉，抗性植株生长60天需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。

如果需要获得果实进行果实的试验，可以继续培养，在瓶中番茄就能够开花结果。开花结果后为了进一步确定转基因的稳定性，可以在荧光显微镜下再次检测花和果实不同发育阶段的荧光。

以上步骤完成以后可以获得稳定遗传的转基因植株。此方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。

其中，所述S1培养基为MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5 g/L，pH5.8。

其中，所述S2培养基为MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，ZT1mg/L，NAA0.4 mg/L，卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L，pH5.8。

其中，所述番茄为番茄Micro-Tom种子。

MS：MS是MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。具体配方可参照此书：（曹孜义等，实用植物组织培养教程，1996，甘肃科学技术出版社）。在本转基因实验中我们使用由美国sigma公司生产MS培养基粉剂（Murashige and Skoog basal salt mixture），此MS培养基粉剂要求每配制一升培养基添加4.4克粉剂，在本培养基的配制中，每配制一升培养基需要加入MS培养基粉剂2.2克。

所说的继代培养基也就是MS固体培养基，就是在每升液体培养基上加入7克琼脂粉配成。

ZT：玉米素（Zeatin）是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化（侧端优势），促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。

NAA： 萘乙酸 (1-Naphthaleneacetic acid)，简称NAA，是一种有机化合物，它是一种植物激素生长素，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。

卡那霉素：卡那霉素是转基因中的植物筛选标记，通过在培养基中添加卡那霉素，可以剔除掉一部分非转基因的芽或者植株。转基因植株抗卡那霉素，因此可以在添加卡那霉素的培养基中成活，而普通植株不抗卡那霉素，会死亡。

羧苄青霉素：羧苄青霉素用于抑制转基因后期农杆菌的生长。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：

1、提高番茄转基因效率，转化率可达到30%以上。

2、将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。

3、侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对番茄叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。

4、使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1 本发明培养基、菌株和植物表达载体的准备

1、材料

（1）植物材料

番茄Micro-Tom种子和组培苗。

（2）主要溶液和培养基配制

培养基配制方法如下：

番茄种子培养基：S1

MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L， pH5.8，高压灭菌，备用。

番茄转基因苗培养基： S2

MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，ZT1mg/L，NAA0.4 mg/L,卡那霉素20mg/L,羧苄青霉素400 mg/L,pH5.8，高压灭菌，冷却备用。

（3）菌株和植物表达载体

本发明中使用的菌株是农杆菌菌株EHA105，该菌株是番茄转基因中常用菌株，侵染能力较强。该菌株购买于美国模式培养物集存库ATCC (American type culturecollection)。

植物表达载体选用基于Gateway™技术的pK7WG2D植物表达载体，Gateway™技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。此外pK7WG2D植物表达载体携带超强表达的报告基因Egfp，便于转基因植株的检测。载体购买于Invitrogen生物技术公司。

实施例2 一种番茄的高效快速稳定基因转化方法

（1）菌种活化

①将含质粒pK7WG2D的农杆菌EHA105在LB固体培养基上（含50 mg/L SPR（壮观霉素）和50 mg/L Rif（利福平））划线，28 ℃培养2天。

②挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL LB液体培养基中（含50 mg/LSPR（壮观霉素）和50 mg/L Rif（利福平）），28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4（约12-16 h）。

③常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2为最佳(这个值很重要，不能低于0.2，不能高于0.3，控制在0.2～0.3之间，要接近0.2)。活化好的菌液可以用来做下一步植物材料侵染。

（2）番茄转基因

植物材料准备

番茄种子种植于S1培养基上，10天以后长出两片子叶，去子叶将子叶用剪刀剪成大约0.4 cm²的叶块用于菌液侵染。尽量使得番茄叶片上四周都有伤口，这样剪容易长愈伤。

番茄的转基因操作方法

侵染：悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染30～40 分钟（过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积）。侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液。

筛选培养：侵染后的叶片接种在番茄转基因培养基S2上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，光照培养。培养20天左右，番茄叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出（这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下），而一部分没有发光（这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉），通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量。保留下的抗性愈伤经过约40 d左右的培养以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉。抗性植株生长60天需要再进行一次荧光检测。荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。

如果需要获得果实进行果实的试验，可以继续培养，在瓶中番茄就能够开花结果。开花结果后为了进一步确定转基因的稳定性，可以在荧光显微镜下再次检测花和果实不同发育阶段的荧光。

本实施例中的培养基采用的是实施例1中的培养基、菌株和植物表达载体。

本试验结果与常规的番茄转基因方法比较：

常规的番茄转基因方法如下：第一步将番茄种子在无菌条件下利用酒精和次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗涤；第二步将处理好的番茄种子播种于预先配制的培养基上，于25℃左右、黑暗条件下培养一天；第三步，待种子萌发后转移至光下继续培养，直至子叶完全展开；第四步，将子叶在无菌条件下剪下，去除两端，保留中间大约长部分叶背向下接种于预先配制的分化培养基，于黑暗条件下预培养一天；第五步，将农杆菌活化至一定浓度，离心收集菌体，以等体积的液体培养基进行稀释,将预培养的子叶放入菌液中，震荡培养之后，将其在无菌滤纸上吸干菌液，转接至分化培养基上，于25℃左右、黑暗条件下共培养一天；第六步，用抗生素溶液对共培养的子叶进行洗涤，之后无菌水洗涤，于无菌滤纸上吸干，转移至预先配制的筛选培养基上，每隔30天左右继代一次，待长出有生长点的小苗后，转移至生根培养基上；第七步，将生根的小苗通过染色的方法进行转基因检测，确定为转基因小苗进行炼苗后，移栽至营养钵中，于温室内进行培养。

传统方法与本方法比较：

1、步骤：传统方法从转化开始共七步，步骤繁琐，操作容易污染，操作时间长；本方法只需三步可完成所有转基因过程，操作方法简单易行。

2、转化效率：传统方法的转基因效率通常不到10%，而本方法转基因效率可达到30%，大大提高转基因效率。

3、检测，传统方法在后期检测时需要将所有植株进行染色检测，而染色检测的假阳性率比较高，并不能够保证所有染色的都是转基因植株，因此检测还需要提取DNA、RNA后用分子手段检测，该方法工作量极大。而本方法只需要在显微镜下观察颜色即可，不需要耗费太大人力物力就能够完成。

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种番茄的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D的农杆菌EHA105在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3；

2）植物材料准备：番茄种子种植于S1培养基上，10天以后长出两片子叶，去子叶将子叶用剪刀剪成0.4 cm²的叶块用于菌液侵染；

3）侵染：悬浮的菌液倒入剪好的叶片中，轻微摇匀，浸染30～40 分钟，过程中每隔5分钟摇动一次，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；

4）筛选培养：侵染后的叶片接种在番茄转基因培养基S2上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，光照培养，培养20天，番茄叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，大大减小下一步工作量，保留下的抗性愈伤经过40d的培养以后，可分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉，抗性植株生长60天需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的确定为转基因植株；

所述S1培养基为MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5 g/L，pH5.8；所述S2培养基为MS2.2g/L，蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，ZT1mg/L，NAA0.4 mg/L，卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L，pH5.8，所述番茄为番茄Micro-Tom种子。