CN103060369A - 杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杂交作物转基因安全控制的方法，其中构建包括重组酶系统、转录激活系统以及外源基因表达控制系统的转基因植物自动删除双元系统，通过将植物花原基细胞特异启动子作为所述转基因植物自动删除双元系统中的启动子控制转录激活系统，所述转录激活系统控制重组酶系统的启动，使导入到植物中的外源基因在F1代植株杂交种中以及根、茎、叶等非删除组织中稳定存在，但在F1代植株的花粉和种子中所述外源基因被删除，以实现杂交作物转基因安全控制。

Description

杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及用于转基因杂交作物安全控制的方法和实现该方法的系统。

背景技术

植物转基因技术已经在农业生产中掀起一场新的绿色革命。据估计，到2015年，全球种植转基因作物的农民数量在40个国家内将达到2000万以上，种植面积将达到2亿公顷(James，2011)。另一方面，在转基因作物中导入的抗虫、抗病、抗除草剂及抗生素等基因已引起了公众的担忧，人们担忧这些基因的存在可能会对生态环境和人类健康带来潜在的危害，甚至带来灾难性的后果。这种担心和顾虑越来越加剧公众在购买转基因产品时的犹豫，当被告之时，公众更愿意选择非转基因产品。人们对转基因作物生物安全性的担忧主要集中在两个方面：一方面是转基因食品可能对人类健康带来不利影响(Key et al.，2008)；另一个方面是转基因植物通过花粉和种子扩散等方式，可能对生态环境造成危害(Ramessar et al.，2007)。这些担忧不断干扰着转基因产品的进一步商业化发展。

许多分子生物技术已被成功用于控制外源基因生物安全的研究中(Tuteja etal.，2012)。其中，基于位点特异性重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT的基因删除技术因具有操作简单易行，删除效率高等优点，近年来已被广泛应用到转基因植物生物安全控制中。2002年，Keenan(2002)等提出了一种从转基因植物生产非转基因食品的技术思路：即将所有外源基因置于重组酶识别位点之间，用化学诱导或组织特异启动子控制重组酶基因的表达。根据该思路，本申请人与美国康涅狄格大学合作，成功构建了“基因删除系统”(“GM-gene-deletor”)，该技术能将所有外源基因从T₀代烟草种子和花粉中彻底删除(Luo et al.，2007)。但该技术不能直接用于水稻、玉米、油菜等有性繁殖植物中。这是因为外源基因一旦从转基因植物T₀代的花粉和种子中去除，无法通过有性繁殖的途径传给下一代，在杂种后代中不能实现外源基因的功能。针对这一问题，在本申请人的另一专利申请(申请号201110179613.2)中，本申请人利用转录激活系统控制重组酶系统的表达，构建了一套用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元系统，简称“GAEBS”，实现了重组酶介导基因删除系统中外源功能基因在有性繁殖世代中的稳定遗传；同时，当需要删除外源基因时，可通过有性杂交，使原本分别于不同植株的重组酶基因和控制其表达的转录激活子基因合拢，转录激活子启动重组酶基因的表达，进而重组酶将来源于双亲的所有外源基因(包括重组酶基因本身)从杂交后代中彻底删除。然而，由于转录激活子置于组成型启动子(CaMV35S)控制之下，杂交发生的同时基因删除也就立即开始，所以产生的F1代杂交种子是不含有外源基因的，即非转基因种子，尚不能在杂交作物的生产中应用。在此，将申请号为201110179613.2的专利申请所公开的内容全文引入本申请中作为参考。

然而，在现代农业中，杂交优势利用已经成为增加产量、改进品质的重要途径。如在中国和美国的玉米生产中，几乎全部为杂交玉米；而杂交水稻已占我国水稻栽种面积的50％和产量的60％以上。要在转基因杂交作物中建立基因删除技术，必须避免杂交种子中的基因删除，以保证杂交F₁代植株中的外源基因稳定发挥其功能和作用(如抗虫、抗病、抗除草剂等)；同时又要使杂交F₁代植株产生的花粉和种子中的外源基因被彻底删除，使通过花粉和种子途径的“基因逃逸”途径可以得到有效阻断。更重要的是，可以使作物(特别是像水稻、玉米等这类作为主食的作物)的种子或果实(Fruits)中没有任何外源基因及其编码产物的存在，可以消除转基因生物存在的食品安全隐患以及公众对转基因食物安全性的忧虑和反对。但目前还没有解决上述问题的有效方案。

发明内容

本发明的一个目的在于提供杂交作物转基因安全控制的方法，通过将植物花原基细胞特异启动子引入基因删除系统，通过该启动子控制基因删除系统中的转录激活系统，而实现了杂交作物中外源基因在杂交种子中以及F1代的根、茎、叶等非删除组织中稳定存在，不被删除、而在杂交F₁代植株产生的花粉和种子中被彻底删除，达到杂交作物转基因安全控制的目的。

本发明的另一个目的在于提供植物花原基细胞特异启动子在制备安全的转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种用于杂交作物转基因安全控制的基因自动删除双元系统，该双元删除系统包含由植物花原基细胞特异启动子控制的转录激活系统、由所述转录激活系统控制的重组酶系统以及外源基因表达控制系统。

本发明还提供一种利用上述基因自动删除双元系统制备转基因植物的方法。

本发明的技术关键是：构建包括重组酶系统、转录激活系统以及外源基因表达控制系统的转基因植物自动删除双元系统，在此删除系统中筛选获得适宜的植物组织特异启动子，确定启动子的组织特异性和活性时间窗，该启动子控制转录激活系统，转录激活系统控制重组酶系统的启动，重组酶系统的启动删除位于重组酶特异识别位点之间的所有导入的外源基因。作为该删除系统启动关键的植物特异性启动子，本申请利用花原基特异启动子控制转录激活系统，受转录激活系统控制的重组酶介导的基因删除在植物特定的部位和时间打开，既使转基因杂交种子中的外源基因得以保留，转基因杂交F1代植株的营养组织与器官中(如根、茎、叶等)发挥外源目的基因的功能(如抗虫、抗病、抗除草剂等)，又使所有外源基因(包括重组酶本身)在F1植株产生的花粉和种子(或果实)中被彻底删除。

根据本发明的一方面，为了实现杂交作物中转基因安全控制的目的，满足用转基因杂交作物产生非转基因花粉和种子的需要，本发明是在申请号为201110179613.2的发明专利申请的基础上进行了进一步的研究的成果。若要实现外源基因在杂交种子中不被删除、而在杂交F₁代植株产生的花粉和种子中被彻底删除，其关键取决于控制转录激活系统的组织特异启动子的组织特异性、启动时间窗和强度。适用于本发明的启动子应具有下述特点：①控制转录激活系统的启动子应为性细胞(germline cells)特异启动子，而且必须同时具有雌性细胞和雄性细胞特异性(如：花原基、雌蕊和雄蕊原基等特异启动子)；②启动子活性的“时间窗口”应在减数分裂前的二倍体细胞中，并在授粉后停止工作，以避免杂交制种时，外源基因被提前删除；同时防止F₁代植株外源基因删除效率的下降(如果启动子活性发生在减数分裂，将导致二元系统因减数分裂而分离)。通过大量的启动子分析筛选，最终获得了适宜的花原基特异启动子，用所述花原基特异启动子控制转录激活系统，而转录激活系统控制重组酶系统，实现了外源基因在F₁杂交种中稳定存在，仅在F₁代植株的花粉和种子中被自动删除，从而满足杂交作物转基因安全控制的需要。

本发明中用于控制转录激活因子基因的组织特异启动子包括来自植物、动物、微生物的天然启动子，或人工改造或合成的启动子；作为本发明概念性(conceptual)描述的此类启动子是烟草花发育C基因ntAG(tobacco AGAMOUShomologs)的启动子ntAGIP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

根据本发明的另一方面，为实现杂交作物转基因安全控制目的，将上述植物花原基特异启动子应用于基因自动删除双元系统(也称基因删除系统)中，所述基因删除系统包括分别位于第一植物表达载体和第二植物表达载体且相互配合的重组酶系统、转录激活系统和外源基因表达控制系统；所述重组酶系统包括重组酶和该重组酶的特异识别位点；所述转录激活系统包括转录激活因子基因、由该转录激活因子控制的靶标启动子和控制该转录激活因子基因的植物花原基细胞特异启动子；所述外源基因表达控制系统包括控制外源基因表达的启动子和导入的外源基因。二个植物表达载体的构成为：第一植物表达载体(也称Trigger植物表达载体，其中所包含的各控制元件称Trigger元件)包括两个同向的重组酶特异识别位点以及在所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子；用于导入外源基因的多克隆位点；转录激活因子基因；以及植物花原基细胞特异启动子，用于控制转录激活因子基因的启动。第二植物表达载体(也称Deleter植物表达载体，其中所包含的各控制元件称Deleter元件)，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及在所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子；用于导入外源基因的多克隆位点；重组酶基因；以及靶标启动子，所述靶标启动子由所述转录激活因子基因控制，当被激活时，启动重组酶基因表达。

在上述植物表达载体中，优选的重组酶特异性识别位点选自loxP，lox2272，lox5171和FRT识别位点，重组酶基因选自FLP、Cre和Cre^int重组酶基因，由靶标启动子及与之配合的转录激活因子基因组成的转录激活系统为pOp/LhG4转录激活系统。

根据本发明的又一个方面，本发明也提供了制备安全的转基因植物的方法，当分别携带Deleter元件和Trigger元件的植物作为亲本相互杂交，获得具有目标性状的杂交种，大田生产体现目标性状在根、茎、叶等组织中的生物学功能，而仅在F₁代减数分裂发生之前的花原基细胞中高效启动系统的删除功能，实现包括重组酶基因在内的所有外源基因的删除，达到控制杂交作物外源基因生物安全性的目的，可制备安全的转基因植物。

本发明用于转基因杂交作物生产非转基因花粉和种子的基因自动删除双元系统及其制备安全的转基因杂交作物的方法具有以下有益效果：

本发明针对“GAEBS”基因自动删除双元系统无法维持外源基因在杂交作物杂交制种中稳定遗传的缺点，根据杂交作物的特点并结合三系、两系等杂交制种技术要求，创造性地提出选取植物花原基细胞特异启动子控制“GAEBS”系统转录激活子基因的表达，进而实现“GAEBS”系统仅在F₁代植株减数分裂发生之前高效开启，将所有外源基因从花原基细胞中彻底删除，产生无任何外源基因的花粉和安全食用种子。

本发明适用于玉米、水稻、油菜以及蔬菜等通过三系或两系法制种的杂交作物，将第一植物表达载体和第二植物表达载体分别导入作物的保持系/不育系和恢复系中，转基因不育系和恢复系材料经传代选育和纯化，用于杂交制种。由于杂交制种需要的面积远小于杂交F₁植株的栽种面积，可以由种子公司在封闭的环境中进行，可大大降低外源基因“飘逸”带来的生态隐患。大面积栽种的杂交F₁植株的营养器官由于外源基因的存在继续发挥转基因的功效(抗虫、抗病、抗除草剂等)，但其产生的花粉和种子中的外源基因则被全部删除，通过花粉和种子途径的“基因逃逸”途径可以得到有效阻断。更重要的是，由于作物(特别是像水稻、玉米等这类作为主食的作物)的种子或果实(Fruits)中已经没有任何外源基因及其编码产物的存在，转基因生物存在的食品安全隐患得以消除，公众对转基因食物安全性的忧虑和反对，也会被打消。

转基因烟草实验结果表明，通过第一转基因植物与第二转基因植物的有性杂交，在植物组织特异性启动子ntAGIP1调控的基因自动删除系统的指导下，杂交制种不但能高效获得杂交种，而且能有效保证大田生产中外源功能基因在根、茎、叶等目标组织中有效表达，实现其生物学功能；同时，能100％地将来源于双亲的所有外源基因从杂交后代的花原基细胞中彻底删除，生产无任何外源基因的花粉和食用种子。

附图说明

图1：ntAGIP1启动子控制LhG4^ATO表达的Trigger植物表达载体的结构示意图。

NPTIII，卡那霉素抗性基因；2×35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；GUS：NPTII，β-葡萄糖酸苷酶基因(GUS)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)融合基因，用于转基因植株的筛选与鉴定；nos，冠瘿碱合成酶基因转录终止序列；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界；loxp，cre/loxp重组酶系统的识别位点序列。用于构建植物表达载体的骨架载体pL35SLhG4参见201110179613.2号申请。

图2：F1代植株叶片中外源基因非特异性删除的PCR分析。

检测的目的基因为cre^int和LhG4^ATO基因。杂交F₁代植株中应同时检测到约1.2kb的cre^int和约1.4kb的LhG4^ATO特异条带。M泳道：DNA分子marker；H泳道：水为模板；WT泳道：野生型烟草DNA为模板；1，2，4-11，13-17泳道：杂交F₁代根、茎、叶的总DNA为模板；3泳道：Trigger亲本DNA为模板；12泳道：D198亲本DNA为模板。

图3：杂交途径中GUS和GFP的表达分析。

A.GUS和GFP在亲本Deleter和Trigger中的表达分析。在幼苗(A-i)、茎(A-ii)、叶(A-iii)、花(A-iv)和花粉(A-v)中均检测到GUS和GFP基因的表达。B.GUS和GFP在亲本Deleter和Trigger杂交F₁代中的表达分析。F₁代花粉(B-v)和花原基中心(雌蕊和雄蕊)(B-iv)中没有检测到GUS和GFP基因的表达，而在F1茎(B-ii)、叶(B-iii)和幼苗(B-i)非删除组织中检测到GUS和GFP基因的表达；C.GUS和GFP在杂交F₂代中的表达分析.在来自F2代幼苗、茎、叶、花和花粉中均未检测到GUS和GFP基因的表达。P：纯合亲本；GUS：GUS组织化学染色检测；GFP：绿色荧光显微检测；F1：Deleter与Trigger的杂交F1代植株；F2：F1代自交后代；i：幼苗；ii：茎横切；iii：叶；iv：2-3时期花纵切；v：成熟花粉。

图4：ntAGIP1指导系统删除外源基因时空特点的GFP荧光检测

A-C、杂交F₁代花器官GFP绿色荧光检测结果。a：-7时期以前的花；b：约-7--6时期的花；c：约-4时期的花：；B：-2时期的花；C：-1时期的花。D和E、Deleter转基因植株花器官GFP绿色荧光检测结果。d：-7时期以前的花；e：约-5时期的花；f：约-2时期的花；g：-1时期的花。E：2-3时期花。Bar＝3mm.

图5：用于控制杂交作物外源基因生物安全的基因自动删除双元系统的工作原理图

利用转录激活系统的反式作用原理，将重组酶删除系统一分为二，产生两个元件：Deleter和Trigger。Deleter元件包括“Target promoter”(pOp)控制的重组酶基因(Cre)和外源基因(trait gene)；Trigger元件包括种系细胞特异启动子(germline P，如花原基组织特异启动子)控制的杂合转录因子(LhG4)基因以及外源基因。将两个元件中的所有基因都置于重组酶识别位点(L)之间，构建植物表达载体。将Trigger和Deleter分别导入植物基因组中。在Trigger转基因植株中，由于没有重组酶基因，外源基因不会被删除；在Deleter转基因植株中，由于没有杂合转录因子基因，pOp启动子关闭，所控制的重组酶基因不表达，外源基因也不会被删除。这样就可以确保外源基因在植物有性世代中稳定遗传(I)。当生产杂交种子时，通过有性杂交，Trigger和Deleter在合子中重新组合在一起。在germline P启动子控制下，Trigger在合子、杂交种子及F1代营养体根、茎、叶保持沉默，基因删除继续关闭，保证目标性状基因(如抗虫、抗除草剂等基因)在杂交F₁代营养体根、茎、叶等中实现其生物学功能(II)。当F1代植株进入开花期时，germline P启动子在花原基细胞中启动Trigger，LhG4基因表达，特异激活pOp启动子，开启重组酶基因表达，进而删除所有外源基因，随后，无外源基因的花原基细胞分化产生不再具有任何外源基因的花粉和种子，控制大田生产中花粉和种子可能带来的生物安全隐患(III)。

图6是按照申请号201110179613.2所述的方法构建的Deleter植物表达载体的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不意味着对本发明进行限定。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》。

【实施例1】DNA的提取和目的片段序列的扩增

1.DNA的提取

选取烟草(Nicotiana tabacum，Xanthin)幼嫩叶0.3-0.5g，在液氮中迅速磨成白色粉末，转入10mL离心管，加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀。65℃水浴45min，期间混匀2-3次。然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min。用等体积(4mL)的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，25℃离心10min)。取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，室温静置约30min。挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗两次，再用无水乙醇漂洗1次。室温吹干，重悬于600μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h去除样品中的RNA。再用酚(Ph8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，离心10min)，取上清，2.5倍体积无水乙醇于-20℃沉淀30min以上。13,000r/min，离心10min收集沉淀，弃上清，沉淀用75％的乙醇漂洗。减压离心干燥，沉淀最终溶于50-200μL TE中，-20℃保存备用。

2.目的片段序列的PCR扩增

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1～4min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌。

紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块。回收方法参照试剂盒(Roche公司)的使用说明书进行。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

酶切体系的建立和反应条件均参考Roche公司限制性内切酶试剂盒的说明书进行。酶切回收的片段，或者扩增获得的回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pUCm-T(上海Sangon)或pGEM-T/pGEM-T Easy(Promega)载体上。连接反应体系如下：

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比＝1∶3。

16℃连接2-8h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37℃培养。

【实施例2】花原基细胞特异启动子控制转录激活因子基因的Trigger植物表达载体的构建

1.植物花原基细胞特异启动子的获得

根据质粒pER8(GenBank登录号：AF309825.2)上CaMV 35S最小核心启动子序列，设计引物(SEQ ID NO.1和2)，以质粒pER8为模板，PCR扩增得到长约600bp的序列。测序结果表明该序列全长602bp，含有58bp长的CaMV 35S(-46to+12)核心启动子(简称minP)、多克隆位点MCS和豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基rbcS-3A基因的polyA序列(简称“T3A”)。

根据烟草花发育AGAMOUS(AG)同源基因1的第二内含子序列(GenBank登录号：GU143404.1)，设计引物(SEQ ID NO.3，4)，从烟草基因组中PCR扩增获得一个约4.1kb的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为烟草AG同源基因1的第二内含子调控序列。将该序列反向插入上述克隆的CaMV 35S minP启动子上游，构建融合启动子，命名为ntAGIP1(SEQ ID NO.5)。

根据烟草花发育AGAMOUS(AG)同源基因2的第二内含子序列(GenBank登录号：GU143405.1)，设计引物(SEQ ID NO.6，7)，从烟草基因组中PCR扩增获得一个约4.1kb的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为烟草AG同源基因2的第二内含子序列。将该序列反向插入上述克隆的CaMV 35S minP启动子上游，构建融合启动子，命名为ntAGIP2(SEQ ID NO.22)。

根据拟南芥花发育AGAMOUS(AG)基因的第二内含子调控序列(GenBank登录号：AT4G18960)，设计引物(SEQ ID NO.8，9)，从拟南芥基因组中PCR扩增获得一个约1.7kb的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥AG基因的第二内含子的核心调控序列。同样，将该序列反向插入上述克隆的CaMV35S minP启动子上游，构建融合启动子，命名为AGIP(SEQ ID NO.23)。

根据拟南芥花原基发育特异启动子AP1的序列(GenBank登录号：AT1G69120)，设计引物(SEQ ID NO.10，11)，以拟南芥基因组DNA为模板扩增AP1启动子，获得了一个约1.8kb长的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥的AP1特异启动子，命名为AP1。

根据拟南芥孢子母细胞发育特异启动子SPL(GenBank登录号：AT4G27330)的序列，设计引物(SEQ ID NO.12，13)，以拟南芥基因组DNA为模板PCR扩增SPL启动子，获得了一个约2.7kb长的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥的SPL特异启动子，命名为SPL。

根据拟南芥孢子母细胞特异启动子EMS1的序列(GenBank登录号：AT5G07280)，设计引物(SEQ ID NO.14，15)，以拟南芥基因组DNA为模板扩增EMS1启动子，获得了一个约3.0kb长的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥的EMS1特异启动子，命名为EMS1。

根据番茄果实发育早期特异启动子Lefsm1的序列(GenBank登录号：AJ583670.1)，设计引物(SEQ ID NO.16，17)，以番茄基因组DNA为模板扩增Lefsm1启动子，获得了一个约1.0kb长的片段，将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为番茄的Lefsm1特异启动子，命名为Lefsm1。

2.花原基细胞特异启动子控制转录激活子基因Trigger植物表达载体的构建

简单地说，用酶切连接技术将pL35SLhG4载体(参见申请号为201110179613.2的专利申请所公开的相关内容)中的35S启动子分别替换为上述花原基细胞特异启动子，构建不同花原基细胞特异启动子控制LhG4^ATO转录因子基因的植物表达载体，分别命名为ntAGIP1::Trigger，ntAGIP2::Trigger，AGIP::Trigger，AP1::Trigger，SPL::Trigger，EMS1::Trigger，Lefsm1::Trigger植物表达载体。其中，ntAGIP1::Trigger植物表达载体的结构示意图见图1，其余Trigger植物表达载体的结构与之相似。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。

3.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105中。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌EHA105。

【实施3】农杆菌介导的烟草遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行烟草的遗传转化所用培养基见表1

表1：根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962

B5：Gamborg，1986

农杆菌介导叶盘的方法导入烟草。具体方法如下：

烟草种子用1％的次氯酸钠消毒后，在固体培养基MSB₀上萌发，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可用作转化外植体。

选取健壮叶片，超净工作台上切成约0.5cm×0.5cm的叶盘，保持湿润备用。牙签挑取YEB平板上培养的转化用农杆菌单菌落，液体培养活化，再转入三角瓶中培养至OD₆₀₀＝0.5。把切好的叶盘浸泡于MSB液体基本培养基重悬的农杆菌菌液中，静止浸染10-20min。倾去菌液，用无菌的吸水纸吸去叶盘表面多余的菌液，将叶盘接入共培养基MSB₁上，24℃暗培养2d。共培养完成后，将叶盘接入筛选培养基MSB₂中进行分化培养2周，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。出现再生绿色愈伤后，转入诱芽培养基MSB₃促进芽的产生。当抗性苗生长到3-4cm长时，切下转入生根培养基MSB₄中，诱导生根。当抗性苗的根生长到2-3cm长时，洗净培养基，并水培炼苗2-3d，移栽到营养钵中，于温室生长。

【实施例4】Trigger植株的获得

参照实施例3，利用农杆菌介导法将实施例2构建的Trigger植物表达载体转化烟草，GUS组织化学染色和PCR筛选鉴定转基因植株，并利用GUS组织化学染色等技术分析和筛选单拷贝Trigger转基因植株的后代纯合株系，用于进一步研究。

【实施例5】Deleter植物表达载体及Deleter植株的获得

按照申请号201110179613.2的发明专利申请中所述的方法构建本发明所称的第二植物表达载体Deleter(如图6)，并获得Deleter转基因植物。

【实施例6】转基因烟草的杂交试验

为了评价不同花原基细胞特异启动子指导GAEBS系统通过杂交途径删除外源基因的特点和效率，首先，按照申请号201110179613.2的发明专利申请中所述的方法筛选获得具有100％删除效率的高效Deleter转基因株系：D198(即实施例5所制备的Deleter植株)；然后，以D198后代纯合株系为父本，分别与Trigger激活子纯合株系杂交。杂交方法参见刘仁祥等(刘仁祥et al.，2000)所述，在烟草盛花期，每天下午采集第2天要裂开的花药存于实验室，待第2天早上，花药已裂开，用毛笔粘取花粉涂于要授粉的柱头(去雄蕊)上，即完成授粉过程。

【实施例7】不同花原基细胞特异启动子控制的GAEBS系统删除外源基因效率的统计分析

选取花原基细胞特异启动子指导GAEBS系统从F1代种系细胞中删除外源基因，进而产生无任何外源基因的种子和花粉是本发明的最终目的。因此，通过该系统创制的转基因植株杂交后，系统在F1代植株中合拢后，花原基细胞特异启动子开启系统在种系细胞中删除外源基因，产生无外源基因的种子和花粉的频率是评价花原基细胞特异启动子控制的GAEBS系统删除效率的关键。为此，首先以F₁代自交种子萌发产生的F₂代幼苗中GFP和GUS基因的表型为标准分别统计系统对Deleter和Trigger的删除效率。根据孟德尔遗传分离规律，在没有任何外源基因删除时，F₂代植株应有四种表型：GFP⁺/GUS⁺、GFP⁺/GUS^-、GFP^-/GUS⁺和GFP^-/GUS^-，分离比为9∶3∶3∶1。其中以GFP为标准的Deleter外源基因的分离比为GFP⁺∶GFP^-＝3∶1；以GUS为标准的Trigger外源基因的分离比为GUS⁺∶GUS^-＝3∶1。通过统计不同表型的植株数，根据单基因3∶1的分离规律，得到了系统删除Trigger和Deleter转基因的效率，统计结果见表2所示。从表中可以看出，不同启动子指导系统的删除效率存在明显的差异。其中，ntAGIP1启动子指导系统删除Trigger和Deleter外源基因的最高效率均可达100％，系统的平均效率为68.6％，显著高于其他启动子控制的系统的删除效率。因此，选取来自烟草的ntAGIP1启动子用于进一步研究。

表2不同花原基细胞特异启动子指导GAEBS系统删除外源基因效率的统计分析

^a每个启动于平均选取15株独立的Trigger转基因植株作为父本与D198 Deleter杂交，获得杂交种(F1代)，种植F1代植株，分析F1代自交种子中GFP和GUS的酶活。所有Trigger转基因植株均为单拷贝纯合植株。

^a删除Deleter效率(％)＝(4×GFP^-幼苗数-分析幼苗总数)/3×分析幼苗总数×100；

^b删除Trigger效率(％)＝(4×GUS^-幼苗数-分析幼苗总数)/3×分析幼苗总数×100；

^c平均删除效率(％)＝(删除Deleter效率+删除Trigger效率)/2。

^e100％删除效率是指来自双亲的所有外源基因(包括Trigger和Deleter)均100％从F1代自交种子中删除。

χ²分析F2代幼苗中GUS^-和GFP^-表型幼苗分离比对3∶1比例的适合度。当GUS^-或GFP^-幼苗分离比显著偏离3∶1时，表明外源基因删除发生，并计算删除效率；否则，删除效率记为0。

进一步分析发现，在ntAGIP1指导的GAEBS系统中，以GUS为标准统计的系统对Trigger的平均删除效率为71％；以GFP为标准统计的系统对Deleter的删除效率为66％。在25株独立ntAGIP1::Trigger与D198杂交组合中，系统在3株ntAGIP1::Trigger(ntAGIP1-85，-126，-137)与D198杂交F1代种子中删除效率均为100％(平均统计约2,000颗种子中)，能100％产生无任何外源基因的F1代种子(表3)。

表3ntAGIP1指导系统删除效率的统计分析

只有当χ₁ ²和χ₂ ²大于3.84时，才分别估测GFP和GUS外源基因被删除的效率。

^a删除Deleter效率(％)＝(4×GFP^-幼苗数-分析幼苗总数)/3×分析幼苗总数×100；

^b删除Trigger效率(％)＝(4×GUS^-幼苗数-分析幼苗总数)/3×分析幼苗总数×100；

^c平均删除效率(％)＝(删除Deleter效率+删除Trigger效率)/2。

χ²分析F₂代幼苗中GUS^-和GFP^-表型幼苗分离比对3∶1比例的适合度。当GUS^-或GFP^-幼苗分离比显著偏离3∶1时，表明外源基因删除发生，并计算删除效率；否则，删除效率记为0.

另外，田间生产中，F1花粉是带来转基因生物安全隐患的主要途径。为此，进一步检测了F1代成熟花粉中GUS和GFP的表达活性，结果表明，在ntAGIP-85，-126，-137三株Triggers分别与D198 Deleter杂交F1代的花粉中，均未检测到GUS和GFP的表达活性(评价统计花粉数20,000以上)(图3)。这些结果表明，系统能100％将外源基因从F1代花粉中删除，产生无任何外源基因的花粉。

【实施例8】ntAGIP1启动子控制的GAEBS系统通过杂交途径维持外源基因稳定传递的分析

1.ntAGIP1指导的GAEBS系统维持外源基因在杂交种中稳定传递的分析

为了分析外源基因在杂交当代种子中的非特异性删除情况，实验条件下，萌发杂交种子，利用GFP荧光检测法和GUS组织化学染色法检测7d龄幼苗中GFP和GUS基因的表达。根据孟德尔遗传规律，如果没有发生外源基因的删除，应该只观察到一种表型的幼苗：GFP⁺/GUS⁺(即同时含绿色荧光和GUS蓝色信号的幼苗)，如果发生删除，有可能观察到以下三种表型的幼苗：GFP⁺/GUS^-、GFP^-/GUS⁺和GFP^-/GUS^-。统计分析结果见表4所示。从表中可以看出，在D198与25株Trigger转基因植株的杂交组合中，系统仅在2个杂交组合中删除外源基因，其余杂交组合中，没有检测到外源基因的删除，结果表明ntAGIP1启动子指导的GAEBS系统能高效维持外源功能基因在杂交种中的传递，杂交制种能获得杂交种。

表4系统在杂交种中非特异删除外源基因的统计分析

^eN：无外源基因删除发生；Y：有外源基因删除发生。

2.ntAGIP1指导的GAEBS系统维持外源功能基因在F1代非删除组织中有效表达的分析

系统在F₁代营养体组织中的稳定性是实现外源性状基因(如抗虫、抗病等)在这些组织中生物学功能的关键。为此，首先用PCR检测了系统在F1代植株中的稳定性，扩增的目标基因为cre^int和LhG4^ATO基因。提取植物叶片的基因组DNA，用引物对(SEQ ID No.18，19和SEQ ID No.20，21)分别检测cre^int和LhG4^ATO基因在这些组织基因组中的稳定性。PCR检测结果显示，所有F1代植株基因组中均同时检测到长约1.2kb cre^int和长1.3kb LhG4^ATO基因的存在，表明这些植株同时含有Deleter和Trigger转基因，外源基因在这些组织中没有被删除(图2)。

进一步，利用GFP荧光检测法和GUS组织化学染色法分析了F₁代根、茎、叶等组织中GFP和GUS报告基因的表达情况。结果表明，在F1代植株根、茎、叶和花等非删除组织中均检测到GFP和GUS基因的高效表达(图3-B)。

上述结果表明，在ntAGIP1启动子调控下，GAEBS系统在杂交后代合拢后，依然能有效维持外源功能基因(GFP和GUS)在F1代非删除组织(根、茎、叶和花)中的稳定表达，实现外源功能基因的生物学功能。

【实施例9】ntAGIP1启动子控制的GAEBS系统在F₁代花发育时期删除外源基因的时空特点分析

为了分析ntAGIP1启动子控制的GAEBS系统在F₁代花发育时期删除外源基因的时空特点，参见Koltunow等(1990)关于烟草花发育时期的划分，我们分析了F₁代花发育2-3时期(stage 2-3)GUS和GFP的表达特征。结果显示，GUS和GFP活性均特异地从雄蕊和雌蕊中消失，表明外源基因已从这些组织中被彻底删除(图3-B)。而且，在F₂代幼苗、茎、叶和花中均未检测到GUS和GFP基因的表达活性，表明由外源基因已被删除的花原基细胞发育能产生无外源基因的非转基因植株(图3-C)。

ntAGIP1启动子在烟草花发育-7时期以前就开始启动靶标基因在烟草花原基中心(包括雌蕊原基和雄蕊原基)强烈持续表达，直到开花前(Yang et al.，2010)。因此，理论上，系统在F₁代细胞中合拢后，ntAGIP1启动子将特异启动系统从F₁代花原基发早期开始将外源基因从花原基中心删除，据此，进一步利用GFP绿色荧光检测技术追踪了F₁代花器官中外源基因删除的时间窗。图4显示，GFP绿色荧光从杂交后代-7时期以前花原基中心特异性消失，在随后的-6--1时期的雄蕊和雌蕊群中均没检测到绿色荧光信号，而只检测到红色的荧光信号(图4A，B，C)。而亲本D198中，荧光信号在各时期的花中均一强烈出现(图4D，E)。这些结果表明，ntAGIP1启动子在F1代-7时期以前的早期花原基中心就开始启动基因自动删除双元系统高效删除外源基因。

上述实例表明，本发明利用ntAGIP1等花原基细胞特异启动子控制GAEBS系统的时空删除，成功构建了用于控制杂交作物外源基因生物安全的基因自动删除双元系统GAEBS，其工作原理见图5。目标性状基因通过该系统导入杂交作物中，从而实现：(1)维持了目标性状基因在亲本有性世代中的稳定遗传，便于优良转基因株系的筛选；(2)维持了目标性状基因在杂交种中的稳定传递，杂交制种能获得生产用转基因杂交种子；(3)大田生产中，能有效保证目标性状基因在F₁代非删除组织(如根、茎和叶)中实现其功能(如抗虫、抗病和抗除草剂等)；(4)基因自动删除双元系统在F₁代植物减数分裂发生之前的性细胞中启动将包括重组酶系统在内的所有外源基因100％删除，产生不含有任何外源基因的花粉和种子。

本发明方法简便易行，在需要删除外源基因时，能100％删除所有外源基因，效果显著，具有很好的应用前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

参考文献

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Claims (11)

1.一种杂交作物转基因安全控制的方法，其中构建包括重组酶系统、转录激活系统以及外源基因表达控制系统的转基因植物自动删除双元系统，通过将植物花原基细胞特异启动子作为所述转基因植物自动删除双元系统中控制转录激活系统的启动子，所述转录激活系统控制重组酶系统的启动，使导入到植物中的外源基因在F1代杂交种中以及F1代的根、茎、叶等非删除组织中稳定存在，但在F1代植株的花粉和种子中所述外源基因被删除，以实现杂交作物转基因安全控制。

2.权利要求1所述的方法，其中所述转基因植物自动删除双元系统包括分别位于第一植物表达载体和第二植物表达载体且相互配合的重组酶系统、转录激活系统和外源基因表达控制系统；

所述重组酶系统包括重组酶和该重组酶的特异识别位点；

所述转录激活系统包括转录激活因子基因、由该转录激活因子基因控制的靶标启动子和控制该转录激活因子基因的植物花原基细胞特异启动子；

所述外源基因表达控制系统包括控制外源基因表达的启动子和导入的外源基因。

3.权利要求2所述的方法，其中所述转基因植物自动删除双元系统包括：

第一植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

转录激活因子基因；以及

植物花原基细胞特异启动子，用于控制转录激活因子基因的启动；

第二植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

重组酶基因；以及

控制重组酶基因的靶标启动子，所述靶标启动子由所述转录激活因子基因控制，当被激活时，启动重组酶基因表达。

4.权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述植物花原基细胞特异启动子为烟草花发育C基因ntAG的启动子ntAGIP1。

5.植物花原基细胞特异启动子在制备安全的转基因植物中的应用，其中通过将所述植物花原基细胞特异启动子作为转基因植物自动删除双元系统中控制转录激活系统的启动子，所述转录激活系统控制重组酶系统的启动，使导入到植物中的外源基因在杂交种以及F1代的根、茎、叶等非删除组织中稳定存在，但在F1代植株的花粉和种子中所述外源基因被删除，以实现在转基因杂交作物中生产非转基因花粉和种子。

6.权利要求5所述的应用，其中所述转基因植物自动删除双元系统包括：

第一植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

转录激活因子基因；以及

植物花原基细胞特异启动子，用于控制转录激活因子基因的启动；

第二植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

重组酶基因；以及

控制重组酶基因的靶标启动子，所述靶标启动子由所述转录激活因子基因控制，当被激活时，启动重组酶基因表达。

7.权利要求5或6所述的应用，其中所述植物花原基细胞特异启动子为烟草花发育C基因ntAG的启动子ntAGIP1。

8.一种用于杂交作物转基因安全控制的基因自动删除双元系统，包括

第一植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

转录激活因子基因；以及

植物花原基细胞特异启动子，用于控制转录激活因子基因的启动；

第二植物表达载体，所述表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点以及位于所述两个重组酶特异性识别位点之间的下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

重组酶基因；以及

控制重组酶基因的靶标启动子，所述靶标启动子由所述转录激活因子基因控制，当被激活时，启动重组酶基因表达。

9.权利要求8所述的基因自动删除双元系统，其中所述植物花原基细胞特异启动子为烟草花发育C基因ntAG的启动子ntAGIP1。

10.权利要求8或9所述的基因自动删除双元系统，其中所述重组酶特异性识别位点选自loxP，lox2272，lox5171和FRT识别位点，所述重组酶基因选自FLP、Cre和Cre^int重组酶基因，所述靶标启动子及与之配合的转录激活因子基因为pOp/LhG4转录激活系统。

11.一种制备转基因植物的方法，包括下述步骤：

1)构建权利要求7所述的基因自动删除双元系统；

2)将权利要求7所述的第一植物表达载体导入植物基因组，制备第一转基因植物；

3)将权利要求7所述的第二植物表达载体导入植物基因组，制备第二转基因植物；

4)将第一转基因植物和第二转基因植物作为亲本相互杂交，获得F1代转基因植物。

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