CN106922525A - 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 - Google Patents
一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106922525A CN106922525A CN201710090814.2A CN201710090814A CN106922525A CN 106922525 A CN106922525 A CN 106922525A CN 201710090814 A CN201710090814 A CN 201710090814A CN 106922525 A CN106922525 A CN 106922525A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- screening
- culturing
- callus
- corn
- cuso
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 42
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 34
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 23
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims 4
- VEWUNRJQQRKSCB-UHFFFAOYSA-N 6-benzylpurine-2,6-diamine Chemical class C12=NC=NC2=NC(N)=NC1(N)CC1=CC=CC=C1 VEWUNRJQQRKSCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 claims 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 claims 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 abstract description 24
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 abstract description 24
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 23
- CGIDKJRJBMFXKV-UHFFFAOYSA-N 6-n'-benzylpurine-6,6-diamine Chemical compound N1=CN=C2N=CN=C2C1(N)NCC1=CC=CC=C1 CGIDKJRJBMFXKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 12
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 abstract description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N cephamycin Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](C)[C@]21OC UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及转基因植物的培养，具体公开了一种通过弱光培养体系快速获得转基因玉米的方法。具体为：将农杆菌侵染的玉米幼胚恢复培养后，置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养，将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件下进行苗再生，即得转基因玉米；所述筛选培养时间为25‑30天；所述弱光条件为光照强度1‑20μmol/m2.s；所述筛选培养基含有1‑10mg/L的CuSO4与0.1‑1mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤。本发明提供的转化方法通过筛选培养基添加CuSO4、6‑苄氨基腺嘌呤、愈伤筛选阶段进行弱光处理，愈伤仅筛选两轮，即可使得玉米转化效率提高到10％，从玉米幼胚侵染到得到再生苗周期缩短到2个月，大大缩短了获得转基因玉米再生苗的时间。本发明方法简单，操作方便，宜于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及转基因植物的培养，具体地说，涉及通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法。
背景技术
自上世纪90年代开始，科学家就开始转基因玉米相关的研究。Gordon-Kamm等(Gordon-Kammet al.Plant Cell,1990,2(7):603-618)和Fromm等(Fromm etal.Biotechnology(NY),1990,8(9):833-839)最先报道通过基因枪轰击法转化玉米悬浮细胞并获得再生植株。Grimsley等(Grimsley et al.Nature,1987,325(1):177-179)最早尝试通过使用根癌农杆菌作为介质将玉米条纹病毒浸染玉米。Gould等(Gould et al.PlantPhysiol,1991,95(2):426-434)和Shen等(Shen et al.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(4):1488-1492)用根癌农杆菌浸染玉米茎尖并获得少量转基因玉米植株。相对于基因枪法，农杆菌转化法的优点是节省成本，外源基因多以单拷贝或低拷贝整合到植物基因组中，外源基因不易发生沉默，能稳定遗传表达。农杆菌介导的玉米转化里程碑式的工作来自于Ishida等(Ishida et al.Nat Biotechnol,1996,14(6):745-750)，他们使用超双元载体通过农杆菌浸染玉米自交系A188幼胚，转化效率达到5-30％，真正使通过农杆菌法获得转基因玉米成为可能。Zhao等(Zhao et al.Maize Genet Coop Newslett,1998,72:34-37)使用普通双元载体通过农杆菌转化法浸染玉米杂交种HiII，获得了较高的遗传转化效率。Frame等(Frame et al.Plant Physiol,2002,129(1):13-22)使用普通双元载体转化玉米HiII幼胚，其转化效率稳定在5％左右。
但上述转化方法需要对转化愈伤在黑暗条件先进行长时间的筛选，并使筛选的抗性愈伤再生成苗，一般计算，从农杆菌侵染玉米幼胚到获得转基因再生苗至少需要3个月以上的时间。提高转化效率并缩短获得转基因玉米再生苗的时间，将大大有助于通过转基因技术手段快速鉴定基因功能、更快培育有育种价值转基因玉米材料。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种转化效率高、转化周期短的获得转基因植物的方法。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法，在农杆菌侵染植物组织后，恢复4-7天(优选7天)，置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养，将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件下进行苗再生；所述筛选培养时间为25-30天；所述弱光条件为光照强度1-20μmol/m2.s；所述筛选培养基含有1-10mg/L的CuSO4与0.1-1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。本方法的遗传转化效率能稳定在10％左右。
以玉米为例，在农杆菌侵染玉米幼胚后，置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养，将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件下进行苗再生，即得转基因玉米。
本发明通过在筛选培养基中添加CuSO4与6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，配合弱光条件可以诱导绿色愈伤，使得玉米愈伤可以快速生长为具有高分化再生能力的绿色愈伤，提高阳性愈伤的筛选效率并缩短愈伤再生成苗的周期。
本发明中愈伤筛选阶段的弱光培养可以使玉米愈伤迅速长成具有可再生能力的愈伤，提高抗性愈伤的再生能力。但是光照强度过高，玉米愈伤会产生芽从而不利于愈伤生长，因此经大量实验优化后，优选弱光光照强度为5-10μmol/m2.s，最优选弱光光照强度为5μmol/m2.s。
本发明筛选培养基中的CuSO4，有助于提高抗性愈伤的分化能力。作为优选，所述CuSO4添加量为5mg/L。
本发明筛选培养基中的6-苄氨基腺嘌呤，有助于提高抗性愈伤的分化、再生能力。作为优选，所述6-苄氨基腺嘌呤添加量为0.5mg/L。
更为具体地，本发明提供所述筛选培养基的配方为：
MS培养基4.3g/L，蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L，肌醇0.25g/L，L-脯氨酸0.69g/L，CuSO4·5H2O 5mg/L，2,4-D 3mg/L，6-BA 0.5mg/L，噻孢霉素(Cefotaxime)250mg/L，双丙氨膦(Bialaphos)3-5mg/L，3g/L植物凝胶，pH5.8。用水定容。
进一步地，所述筛选培养分为两轮进行，在本发明的一个具体实施方式中，每轮筛选14天。实际应用中，每轮筛选的时间可依据情况进行适当调整。常规技术中，筛选培养需要至少3-4轮才能完成，筛选得到的愈伤一般为黄色愈伤，强光下再生成苗比绿色再生愈伤慢，而本发明两轮筛选后的愈伤为绿色再生愈伤，强光下再生成苗快，显著缩短了筛选培养的时间和次数。
进一步地，苗再生时，所述较强光条件为光照强度60-150μmol/m2.s，优选为100μmol/m2.s。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明在具体实施方式中以玉米为例进行说明，但本发明所述方法并不限于玉米，其他可通过本发明所述方法获得绿色愈伤进而获得转基因植株的植物均在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的转化方法通过筛选培养基添加CuSO4、6-苄氨基腺嘌呤、愈伤筛选阶段进行弱光处理，愈伤仅筛选两轮，每轮两周，使得玉米转化效率提高到10％，从玉米幼胚侵染到得到再生苗周期缩短到2个月，大大缩短了获得转基因玉米再生苗的时间。本发明方法简单，操作方便，宜于推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例5经二轮筛选后的抗性愈伤。
图2为本发明实施例7中T0代转化体Bar蛋白的检测图；1，非转基因玉米；2-6，转基因玉米。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1玉米受体材料准备
温室或田间种植玉米自交系综31，用玉米自交系A188的花粉进行授粉，取授粉后9-12天的玉米穗(幼胚约1.0-1.2mm)，去掉外苞叶，用镊子穿在穗子顶部在70％的乙醇中灭菌1分钟，然后放在超净台上吹干，从穗上剥离1mm左右新鲜的幼胚，作为受体材料，备用。
实施例2农杆菌侵染
将植物表达载体pCambia3301通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，-70℃保存菌株。将保存菌株在含100μg/mL卡那霉素和250μg/mL塞孢霉素的YEB固体培养基上划线，28℃暗培养，至长出单菌落。
第一天，挑取单菌落接种到5-10mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡培养8小时；再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡过夜。
第二天，将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中，于5000rpm、离心5min；用含200μM乙酰丁香酮的侵染培养基(配方见表1)重悬，调整O.D.600＝0.3，备用。
将受体材料玉米幼胚放到含1mL侵染培养基溶液的1.5mL离心管中，一个小时后用移液器吸去侵染培养基并加入1mL新的侵染培养基，颠倒混匀1分钟，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入0.2mL新的侵染培养基溶液。将装有玉米幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司,型号CHB-100)上用48℃热激5分钟；用移液器吸去侵染培养基溶液，加入1mL含40mg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液，并放置5分钟；取出用灭菌滤纸吸干，放到添加300mg/L半胱氨酸的共培养培养基(配方见表2)上，在23℃黑暗条件下共培养3天。
表1侵染培养基配方
表2共培养培养基配方
实施例3幼胚恢复
共培养完后的幼胚转移到恢复培养基中(表3)，黑暗条件下培养7天。
表3恢复培养基
实施例4愈伤筛选条件优化
1)光照条件优化
恢复7天后的幼胚转移到筛选培养基(配方见表4)上，在26℃弱光条件下培养，光照强度为1-10μmol/m2.s。试验过程中发现过低的光照强度条件下，幼胚不能形成绿色再生愈伤；而过高的光照强度条件下，幼胚形成愈伤的能力变差。因此，弱光培养条件优选光照强度为5μmol/m2.s(表5)。
表4筛选培养基配方
表5不同光照条件下绿色愈伤发生率
2)培养基配方优化
弱光培养条件下，培养基中的CuSO4和6-BA浓度对绿色愈伤的质量起到至关重要的作用，试验了不同浓度的CuSO4和6-BA对转化效率的影响，优选CuSO4添加量为5mg/L，6-BA添加量优选为0.5mg/L(表6)。
表6不同培养基下遗传转化率
实施例5植株再生
筛选两轮后，获得抗性愈伤(图1)，此时获得的抗性愈伤为绿色再生愈伤，具有高分化再生能力。将此愈伤转移到再生培养基(配方见表7)，强光照下使植株再生。培养条件为28℃，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。
表7再生培养基配方
实施例6植株生根移栽
再生的幼苗长到3片叶时，可将幼苗移植到生根培养基(配方见表8)中，并在室内培养。待幼苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3)的小花盆中。当幼苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。
表8生根培养基配方
实施例7转基因植株检测
取约0.05g左右新鲜幼嫩叶片放在1.5mL的Eppendorf管中，用研磨棒研磨成液体状，向管中加入200μL水。取出Bar蛋白检测条(北京乐士宁科技有限公司货号：AQ014BG)，手持检测条顶端，保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管,插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。1-3分钟内出现质控线。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。检测结果如图2所示。其中1为非转基因阴性苗对照；2到6为转基因阳性苗。上条带为质控线，下条带为检测线，指示被检测出蛋白。由图2可知，转基因玉米出现检测线，Bar蛋白在转基因玉米中正确表达。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法，其特征在于，将农杆菌侵染的植物组织恢复培养后，置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养，将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件下进行苗再生，即得转基因植物；
所述筛选培养时间为25-30天；
所述弱光条件为光照强度1-20μmol/m2.s；
所述筛选培养基含有1-10mg/L的CuSO4与0.1-1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱光条件为光照强度5-10μmol/m2.s。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基含有5mg/L的CuSO4与0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述较强光条件为光照强度60-150μmol/m2.s。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述较强光条件为光照强度100μmol/m2.s。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述筛选培养分为两轮进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基的配方为：
MS培养基4.3g/L，蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L，肌醇0.25g/L，L-脯氨酸0.69g/L，CuSO4·5H2O 5mg/L，2,4-D 3mg/L，6-BA 0.5mg/L，噻孢霉素250mg/L，双丙氨膦3-5mg/L，pH5.8。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将农杆菌侵染后的植物组织在黑暗条件下恢复培养4-7天。
9.根据权利要求1或2及权利要求4～8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物组织为玉米幼胚。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710090814.2A CN106922525B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710090814.2A CN106922525B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106922525A true CN106922525A (zh) | 2017-07-07 |
| CN106922525B CN106922525B (zh) | 2019-02-26 |
Family
ID=59423770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710090814.2A Active CN106922525B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106922525B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108441512A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-08-24 | 刘寒冬 | 一种玉米遗传转化方法 |
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113424A (zh) * | 2007-07-04 | 2008-01-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8G基因、蛋白及其应用 |
| CN101195832A (zh) * | 2007-12-25 | 2008-06-11 | 贵州大学 | 农杆菌介导的花椒转基因方法 |
| CN101358198A (zh) * | 2008-08-20 | 2009-02-04 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种rna干扰载体及其应用 |
| CN101974479A (zh) * | 2010-10-19 | 2011-02-16 | 中国科学院植物研究所 | 一种培育转基因四合木愈伤组织的方法及其专用培养基 |
| CN102051376A (zh) * | 2010-01-27 | 2011-05-11 | 华中农业大学 | 基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法 |
| CN102121029A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-07-13 | 贵州大学 | 一种植物表达载体及其构建及利用百脉根为生物反应器生产鸡α干扰素的方法 |
| CN102286523A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-12-21 | 华中农业大学 | 农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法 |
| CN103045637A (zh) * | 2011-11-18 | 2013-04-17 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中的应用 |
| CN103060369A (zh) * | 2012-09-17 | 2013-04-24 | 西南大学 | 杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统 |
| CN103243111A (zh) * | 2013-05-23 | 2013-08-14 | 重庆大学 | 菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体及其构建方法和应用 |
| CN103451229A (zh) * | 2013-09-22 | 2013-12-18 | 山东农业大学 | 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的构建及应用 |
| CN103993036A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-08-20 | 广东工业大学 | 一种用于紫萍愈伤诱导并且能实现转基因稳定遗传的转化体系 |
| CN105861543A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-08-17 | 云南纳博生物科技有限公司 | 一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法 |
| CN106916843A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 国家开发投资公司 | 一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法及其应用 |
-
2017
- 2017-02-20 CN CN201710090814.2A patent/CN106922525B/zh active Active
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113424A (zh) * | 2007-07-04 | 2008-01-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8G基因、蛋白及其应用 |
| CN101195832A (zh) * | 2007-12-25 | 2008-06-11 | 贵州大学 | 农杆菌介导的花椒转基因方法 |
| CN101358198A (zh) * | 2008-08-20 | 2009-02-04 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种rna干扰载体及其应用 |
| CN102051376A (zh) * | 2010-01-27 | 2011-05-11 | 华中农业大学 | 基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法 |
| CN101974479A (zh) * | 2010-10-19 | 2011-02-16 | 中国科学院植物研究所 | 一种培育转基因四合木愈伤组织的方法及其专用培养基 |
| CN102121029A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-07-13 | 贵州大学 | 一种植物表达载体及其构建及利用百脉根为生物反应器生产鸡α干扰素的方法 |
| CN102286523A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-12-21 | 华中农业大学 | 农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法 |
| CN103045637A (zh) * | 2011-11-18 | 2013-04-17 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中的应用 |
| CN103060369A (zh) * | 2012-09-17 | 2013-04-24 | 西南大学 | 杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统 |
| CN103243111A (zh) * | 2013-05-23 | 2013-08-14 | 重庆大学 | 菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体及其构建方法和应用 |
| CN103451229A (zh) * | 2013-09-22 | 2013-12-18 | 山东农业大学 | 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的构建及应用 |
| CN103993036A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-08-20 | 广东工业大学 | 一种用于紫萍愈伤诱导并且能实现转基因稳定遗传的转化体系 |
| CN106916843A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 国家开发投资公司 | 一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法及其应用 |
| CN105861543A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-08-17 | 云南纳博生物科技有限公司 | 一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108441512A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-08-24 | 刘寒冬 | 一种玉米遗传转化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106922525B (zh) | 2019-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU670316B2 (en) | An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells | |
| CN108374012A (zh) | 橡胶树白粉菌内源启动子wy51及其用途 | |
| CN103444524B (zh) | 一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法 | |
| CN111893133A (zh) | 一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法 | |
| CN107974455A (zh) | 橡胶树白粉菌内源启动子wy7及其用途 | |
| CN105602984A (zh) | 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法 | |
| CN102296086A (zh) | 农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法 | |
| CN101121940A (zh) | 一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法 | |
| CN104450779A (zh) | 一种快速高效的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法 | |
| CN107190019B (zh) | 一种农杆菌介导的麻竹转化方法 | |
| CN104004783B (zh) | 一种提高棉花转基因效率的方法 | |
| CN102191269B (zh) | 以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法 | |
| CN102499075A (zh) | 一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法 | |
| CN105567730A (zh) | 一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法 | |
| CN118813697A (zh) | 一种毛花猕猴桃愈伤组织的遗传转化方法 | |
| CN103993038A (zh) | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法 | |
| CN104087611A (zh) | 一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法 | |
| CN107475287A (zh) | 一种茄子遗传转化方法 | |
| CN106922525A (zh) | 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 | |
| CN111149699A (zh) | 培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法 | |
| CN101717786B (zh) | 一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法 | |
| WO2009132116A2 (en) | Transformation and engineered trait modification in miscanthus species | |
| CN115896160A (zh) | 一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法 | |
| CN105200003B (zh) | 一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基 | |
| CN115216490A (zh) | 一种非组培方式的不结球白菜再生方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |