CN102051376A - 基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及一种甘蓝型油菜转基因的方法。本发明建立了适合以油菜子叶为外植体的叶绿体转化组织培养体系，通过基因枪转化法获得油菜叶绿体转基因植株。本发明还公开了利用油菜叶绿体片段为同源重组片段，构建油菜叶绿体特异性表达载体，对油菜叶绿体进行转化并获得转基因植株的方法。本发明为甘蓝型油菜的转基因提供了一种新途径。

Description

基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法 

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及建立油菜子叶为外植体的叶绿体转化组织培养体系，通过基因枪转化法获得油菜叶绿体转基因植株的方法。本发明还涉及到利用油菜叶绿体片段为同源重组片段，构建油菜叶绿体特异性表达载体，对油菜叶绿体进行转化并获得转基因植株的方法。 

背景技术

叶绿体基因工程拥有许多独特的优势，包括基因的高效表达、原核基因无需改造、可实现定点整合、外源基因不会随着花粉扩散等等。而且叶绿体基因工程还克服了传统核基因工程中易出现的基因失活，基因沉默和位置效应等现象，是一种很具有发展前景的植物转基因技术。油菜是世界四大油料作物之一，不仅是食用植物油的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白原，还是目前全球用于解决能源危机方向之一的生物柴油的理想原料。 

1988年Boynton等人利用基因枪转化体系，以单细胞生物莱因衣藻为材料，经同源重组，使突变体转化为能进行光合作用的正常莱因衣藻，证实了叶绿体转化是可行的，同时也是首例成功的叶绿体转化报道，标志着叶绿体基因工程的诞生。1989年Pal Maliga等人首次在高等植物烟草中实现了叶绿体转化。自此，叶绿体基因工程迅速发展起来(McBride等，(1995)Amplification of a chimeric Bacillus gene inchloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco.Biotechnology(N Y)13(4)：362-5；Khan MS等，(1999)Fluorescent antibiotic resistance marker for trackingplastid transformation in higher plants.Nat Biotechnol，17(9)：910-5；Hou BK等，(2003)Chloroplast transformation in oilseed rape.Transgenic Res 12(1)：111-4；Kumar等，(2004)Stabletransformation of the cotton plastid genome and maternal inheritance of transgenes.PlantMolecular Biology 56(2)：203-216；Kumar等，Generation of fertile transplastomic soybean.PlantMol Biol 55(4)：479-89；Chakrabarti等，(2006).Expression of the cry9Aa2B.t.gene in tobaccochloroplasts confers resistance to potato tuber moth.Transgenic Res 15(4)：481-8.；Liu，等，(2007).Stable chloroplast transformation in cabbage(Brassica oleracea L.var.capitata L.)by particle bombardment.Plant Cell Rep 26(10)：1733-44；Liu等，(2008).Expression of a Bacillusthuringiensis toxin(cry1Ab)gene in cabbage(Brassica oleracea L.var.capitata L.)chloroplastsconfers high insecticidal efficacy against Plutella xylostella.Theor Appl Genet 117(1)：75-88；Soria-Guerra等，(2009).Expression of a multi-epitope DPT fusion protein in transplastomictobacco plants retains both antigenicity and immunogenicity of all three components of thefunctional oligomer.Planta 229(6)：1293-302.；Scotti等，(2009).High-level expression of theHIV-1Pr55(gag)polyprotein in transgenic tobacco chloroplasts.Planta 229(5)：1109-22。其中，侯丙凯等采用的外植体是油菜萌发4-5天的子叶柄，虽然具有再生率高、再生时间短的特点，但快速进入分化状态对于后续转化植株的同质化是不利的(Hou BK，Zhou YH，Wan LH，Zhang ZL，Shen GF，Chen ZH，Hu ZM(2003)Chloroplast transformation in oilseed rape.Transge Res 12：111-114)。同时，在油菜叶绿体转化中，目前突出的问题就是转化受外植体类型限制、转化频率不高等。本发明从外植体类型 和愈伤组织培养入手，通过较长时期的筛选，通过构建油菜叶绿体特异性表达载体进行转化，建立了一种高效的以油菜子叶为外植体的叶绿体遗传转化方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种以油菜子叶为外植体进行叶绿体转化的组织培养体系，通过基因枪法获得油菜叶绿体转基因植株的方法，提高油菜叶绿体转化的效率。 

本发明通过以下技术方案实现： 

1.引物设计与载体构建： 

1)根据Genebank公布的拟南芥叶绿体基因组序列(序列登录号NC000932)，设计两对特异引物对，用该引物对扩增油菜叶绿体基因trnI和trnA作为同源重组片段(见SEQ ID NO：7-8所示)。 

所述的引物对的编号及DNA序列如下： 

F-trnI：5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’；(序列表SEQ ID NO：3) 

R-trnI：5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3’。(序列表SEQ ID NO：4) 

F-trnA：5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’；(序列表SEQ ID NO：5) 

R-trnA：5’-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’。(序列表SEQ ID NO：6) 

2)用步骤1)所示的引物对从待转化的油菜品种华油杂7号的叶绿体基因组中扩增trnI和trnA基因，将PCR产物回收后，片段trnI及克隆载体pBluescript用SacI和NotI进行酶切，片段trnA及克隆载体pBluescript用SalI和ApaI进行酶切，然后分别进行连接得到中间载体p-trnI和p-trnA。从质粒p-aadA(购自金思特科技(南京)有限公司)中分别以SmaI和EcoRV酶切获得筛选标记基因aadA(见SEQ ID NO：1所示)及调控序列(见SEQ ID NO：2所示)，从质粒p-TpsbA(购自金思特科技(南京)有限公司)中分别以SmaI和EcoRV获得终止子TpsbA(见SEQ ID NO：12所示)。将质粒p-Prrn((购自金思特科技(南京)有限公司)进行SmaI和EcoRV酶切，并与aadA基因连接得到中间载体pPrrn-aadA。将中间载体pPrrn-aadA进行EcoRV酶切，经CIAP去磷酸化酶处理后，与终止子片段TpsbA连接，得到含有完整aadA表达框架的中间载体p-aadA cassette。将含有左侧同源重组片段trnI的质粒进行SpeI和SmaI酶切，将中间载体p-aadA cassette进行SpeI和SmaI双酶切，分别回收片段并连接，得到中间载体p-trnI/aadA cassette。将p-trnI/aadA cassette载体用EcoRV酶切，经CIAP去磷酸化，将trnA片段T4DNA polymerase切平后连接，得到转化载体pCL318-5。 

其具体的构建路线见附图2。 

2.应用基因枪方法转化油菜子叶，它包括以下步骤： 

1)外植体的获得 

选取饱满的油菜种子(华油杂7号，华中农业大学选育的一个全国大面积推广应用的油菜新品种)，先用70％酒精表面消毒种子2min，然后用15％H₂O₂浸泡种子35min，再用无菌水冲洗3-5遍，将种子播种于B5基本培养基(不添加其他附加成分)中，25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养4天。 

2)基因枪转化及筛选 

切取4天经过步骤1)培养获得的油菜植株的子叶，接种至B5-Y预培养基上，在黑暗条件下预处理4h，然后进行基因枪轰击，每皿轰击2次。轰击后将其转移至B5基本培养基上(不添加其他附加成分)，25℃，在黑暗条件下恢复培养16h。 

3)愈伤组织的诱导及筛选 

恢复培养后将子叶切成3mm×3mm大小的块状，转入附加10mg/l壮观霉素愈伤诱导培养基B5D-5S，25℃，于2000Lux下，16h光照/8h黑暗条件下进行愈伤组织诱导，直至筛选出绿色抗性愈伤组织。在 此培养期间每两周继代培养一次，共继代培养4次。 

4)诱导愈伤组织的分化及筛选 

将上述绿色愈伤组织接种到附加20mg/l壮观霉素BF3S分化培养基上，进行筛选，于25℃下，光照强度为2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养至分化出绿芽。 

5)诱导转化的再生植株的生根及移栽 

将经过转化的再生油菜苗转移至生根培养基B5-N上，1周左右长出新根。将再生苗移栽到土中，放在温室中培养，培养条件为25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。 

在本发明中，下列培养基是至关重要的，各类培养基的配方及编号如下 

1.发苗培养基(编号：B5) 

2.预培养培养基(编号：B5-Y) 

3.愈伤组织诱导及筛选培养基(编号：B5D-5S) 

4.分化及筛选培养基(编号：BF-3S) 

5.生根培养基(编号：B5-N) 

上述培养基灭菌采用常规高压蒸汽(121℃)灭菌20min，其中B5培养基的有机成分和AgNO₃采用报道的抽滤方法灭菌，所述的有机成分和AgNO₃在培养基温度降至65℃左右时加入。 

6)PCR检测候选转基因植株，具体方法如下： 

将步骤5)中抗性植株进行PCR检测，利用PCR分子鉴定技术(具体程序参见梁国栋主编，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2001)，根据报告基因(aadA，见序列表SEQ ID NO：1所示)的序列设计引物：5’端引物：5’-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3’(见序列表SEQ ID NO：9)；3’端引物：5’-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3’(见序列表SEQ ID NO：10)。 

PCR循环反应参数：95℃变性5min，然后依次在95℃变性1min，64℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次后在72℃保温10min，最后4℃保存。取10μL扩增产物在含溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。 

7)PCR阳性株系的Southern杂交检测： 

提取步骤6)中经PCR检测呈阳性的植物总DNA，取10μg转基因油菜植株DNA，根据样品数配制酶切反应混合液：每个反应体系含10×Buffer 5μL，限制性内切酶EcoR I 2μL含(20u)，水28μL，混匀，分装至0.5mL的离心管中，每管35μl，加入总DNA 15μL，酶切体系为50μL，小心弹匀，瞬时离心，置于37℃水浴中过夜(12-18h)，第二天上午取3μL电泳检测酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚蓝缓冲液终止酶切，置于4℃，直至电泳。 

用0.8％琼脂糖(购自Sigma公司产品)凝胶电泳，0.8-1.0V/cm电泳18-24h。将胶切成膜一样大小和形状；用0.2mol/L HCl变性10min，置于转膜台上，用0.4mol/L NaOH和1mol/L NaCl作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N⁺尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃烘膜2h；取出冷却后用保鲜膜包好，置于4℃冰箱保存备用。 

32P探针制备、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。 

8)Southern杂交阳性株系的Northern杂交检测： 

提取步骤7)中经Southern杂交阳性株系的总RNA，利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取总RNA，液氮研磨后每管分约0.1g，加入1ml的Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)，摇匀室温静置10min；加入200μl的三氯甲烷后立即剧烈摇晃30s，室温静置5min；4℃，12000r/m离 心10min；取上清溶液转移置新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，4℃，12000r/m离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇溶液洗一次，4℃，12000r/m离心5min收集沉淀；室温干燥后溶于20μl的1∶1000稀释的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的总RNA首先用0.8％的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性，然后用紫外分光光度法测定RNA的得率(OD260/OD280，Ratio，R)，R值介于1.8-2.2之间时，说明提取的RNA质量良好。利用DNA酶I(购自宝生物工程(大连)有限公司)除去总RNA中的基因组DNA。反应体系如下：10倍的DNA酶I缓冲液5μl，DNA酶I 2μl，RNA酶抑制剂(40U/ml)1μl，总RNA 20μl(约40μg)补水至50μl。37℃反应30min后，加入50μl的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入等量的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置60min，12000r/m离心10min回收沉淀，每管加入1ml 70％的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m离心10min收集沉淀，室温干燥后用20μl的DEPC水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。 

每个样品取20μg RNA进行甲醛变性凝胶电泳，具体过程如下：配制5x甲醛凝胶电泳缓冲液：将20.6g3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml经用DEPC处理的50nmol/L乙酸钠溶液。用2mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。制备凝胶：将1.28g琼脂糖溶于水，冷却至60℃，加入5x甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1x和2.2mol/L，在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30分钟使凝胶凝固。在一灭菌的微量离心管中混合样品：RNA(约20μg)4.5μl，5x甲醛凝胶电泳缓冲液2.0μl，甲醛3.5μl，甲酰胺10.0μl，于65℃温育15分钟，冰浴冷却，离心5秒使管内所有液体集中于管底。然后加入2μl灭菌切经DEPC处理过的甲醛加样缓冲液(50％甘油，1mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF)。加样前将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V/cm，然后将样品加至凝胶加样孔L。将胶浸入1x甲醛凝胶电泳缓冲液中，4V/cm电压进行电泳。当溴酚蓝迁移出点样孔约8cm时停止电泳 

将胶切成膜一样大小和形状，先用DEPC处理过的水淋洗胶3次以去除甲醛，然后将胶在0.05mol/L NaOH中浸泡20min，用DEPC水冲洗后将胶置于转膜台上，20xSSC(3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0)作为转移缓冲液，将RNA片段转移到Hybond-N⁺尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃烘膜2h；取出冷却后用保鲜膜包好，置于4℃冰箱保存备用。 

32P探针制备、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。 

本发明的有益效果： 

本发明以油菜子叶为外植体，在参考已发表的油菜叶绿体转化及其他高等植物叶绿体转化的方法，并结合申请人已得到的油菜壮观霉素耐受性研究结果的基础上获得。目前叶绿体遗传转化因受到外植体类型、筛选效率及重组体系的束缚，能应用到的高等植物种类还不是很多，在油菜中仅仅有使用下胚轴进行叶绿体转化的报道。 

本发明克服了现有技术的不足，打破了油菜叶绿体转化外植体类型的限制，利用油菜子叶为外植体，创造一种油菜子叶叶绿体转化的新方法。根据拟南芥叶绿体的DNA序列设计特异性引物，扩增得到油菜叶绿体中的部分基因序列作为同源重组片段构建特异性转化载体，通过基因枪法得到油菜叶绿体转基因植株。通过PCR、Southern杂交和Nothern杂交，证明外源基因不仅整合到叶绿体基因组的特定位点，而且获得表达。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是人工合成的aadA基因序列； 

序列表SEQ ID NO：2是人工合成的核糖体结合位点序列； 

序列表SEQ ID NO：3是引物F-trnI的序列； 

序列表SEQ ID NO：4是引物R-trnI的序列； 

序列表SEQ ID NO：5是引物F-trnA的序列； 

序列表SEQ ID NO：6是引物R-trnA的序列； 

序列表SEQ ID NO：7是油菜叶绿体基因trnI的序列； 

序列表SEQ ID NO：8是油菜叶绿体基因trnA的序列； 

序列表SEQ ID NO：9和10是鉴定aadA基因的引物对序列； 

序列表SEQ ID NO：11是人工合成的启动子Prrn序列； 

序列表SEQ ID NO：12是人工合成的终止子子TpsbA序列。 

图1，是本发明的技术流程图。 

图2，是本发明中油菜叶绿体特异性表达载体pCL318-5物理构建图谱，图2续1是载体构建的第一部分。 

图3，是本发明中利用基因枪法转化得到的油菜叶绿体转化植株，均能正常抽苔、开花和结果。图3A是本发明获得的转基因油菜植株，图3B是本发明的转基因植株正常开花和结荚。 

图4，是本发明中转化植株的PCR检测结果，图中标注M为分子量标记，1为空白对照，2为非转基因油菜植株对照，3-7为本发明的转基因油菜。 

图5，是本发明中转化植株的Southern杂交检测结果，图中标注CK为非转基因油菜植株对照，1-5为本发明的转基因油菜。 

图6，是本发明中转化植株的Northern杂交检测结果，图中标注CK为非转基因油菜植株对照，1-5为转基因油菜。 

图7，是本发明中建立适合油菜叶绿体转化的组织培养体系中6种愈伤诱导培养基和3种分化培养基之间的差异比较。图7A是子叶在6种不同愈伤诱导培养基上诱导出的愈伤组织的差异；图7B是培养4周后在6种愈伤诱导培养基上仍能保持愈伤状态的频率；图7C是愈伤组织在3种不同分化培养基上的分化率差异。 

具体实施方式

实施例1：以油菜子叶为外植体的叶绿体转基因植株的培育方法 

1.转化载体的构建 

(1)同源重组片段trnI/trnA的克隆 

参照Genebank公布的拟南芥叶绿体基因组序列(序列登录号：NC000932)，设计两对特异引物对，用该引物对扩增油菜叶绿体基因trnI和trnA作为同源重组片段。 

所述的引物对的编号及DNA序列如下： 

F-trnI：5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’；(序列表SEQ ID NO：3) 

R-trnI：5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3’。(序列表SEQ ID NO：4) 

F-trnA：5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’；(序列表SEQ ID NO：5) 

R-trnA：5’-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’。(序列表SEQ ID NO：6) 

反应体系为： 

dNTP(2mM)                     2μl 

10X缓冲液                 2.5μl(购自宝生物工程(大连)有限公司) 

MgCl₂                     1.5μl 

Primer1(10mM)             0.5μl 

Primer2(10mM)             0.5μl 

Taq(5U/L)                 0.5μl 

模板DNA(50ng/μl)         1μl 

去离子水                  17.5μl 

总体积                    25μl 

PCR循环反应参数：95℃变性4min，然后依次在95℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次后在72℃保温10min，最后4℃保存。取3μL扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。将剩余的PCR回收，片段trnI及克隆载体pBluescript用SacI和NotI进行酶切，片段trnA及克隆载体pBluescript用SalI和ApaI进行酶切，然后分别进行连接得到中间载体p-trnI和p-trnA。 

(2)aad-cassette表达框架的构建 

从质粒p-aadA(购自金思特科技(南京)有限公司)中分别以SmaI和EcoRV酶切获得筛选标记基因aadA及调控序列，从质粒p-TpsbA(购自金思特科技(南京)有限公司)中分别以SmaI和EcoRV获得终止子TpsbA。将质粒p-Prrn(购自金思特科技(南京)有限公司)进行SmaI和EcoRV酶切，并与aadA基因连接得到中间载体pPrrn-aadA。将中间载体pPrrn-aadA进行EcoRV酶切，经CIAP去磷酸化酶处理后，与终止子片段TpsbA连接，得到含有完整aadA表达框架的中间载体p-aadA cassette。 

(3)转化载体pCL318-5的构建 

将含有左侧同源重组片段trnI的质粒进行SpeI和SmaI酶切，中间载体p-aadA cassette进行SpeI和SmaI双酶切，分别回收片段并连接，得到中间载体p-trnI/aadA cassette。将p-trnI/aadA cassette载体进行EcoRV酶切，经CIAP去磷酸化，将trnA片段T4DNA polymerase切平后连接，得到转化载体pCL318-5。 

2.基因枪法介导的油菜子叶的叶绿体遗传转化 

(1)转化外植体的获得 

选取饱满的油菜种子(华油杂7号，华中农业大学选育的一个全国大面积推广应用的油菜新品种)，)，先用70％酒精表面消毒种子2min，然后用15％H₂O₂浸泡种子35min，再用无菌水冲洗3-5遍，将种子播种于B5基本培养基(不添加其他附加成分)中，25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养4天。 

(2)基因枪转化 

切取生长4天的油菜植株的子叶，接种至B5-Y预培养基上，在黑暗条件下预处理4h，然后进行基因枪轰击，每皿轰击2次。轰击后将其转移至B5基本培养基上(不添加其他附加成分)，25℃，黑暗条件下恢复培养16h。 

(3)愈伤诱导及筛选 

恢复培养后将子叶切成3mm×3mm大小的块状，转入附加10mg/l壮观霉素愈伤诱导培养基B5D-5S，25℃，于2000Lux下，16h光照/8h黑暗条件下进行愈伤组织诱导，直至筛选出绿色抗性愈伤组织。在此培养期间每两周继代培养一次，共继代培养4次。 

(4)愈伤组织的分化及筛选 

将上述绿色愈伤组织接种到附加20mg/l壮观霉素BF3S分化培养基上，进行筛选，于25℃下，光照 强度为2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养至分化出绿芽。 

(5)诱导转化的再生植株生根及移栽 

将经过转化的再生油菜苗转移至生根培养基B5-N上，1周左右长出新根。将再生苗移栽到土中，放在温室中培养，培养条件为25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养至开花结实(见附图3)。 

在以上步骤中，培养基是获得转基因植株的关键所在，相关培养基的配方如下： 

1.发苗培养基(编号：B5) 

KNO₃2500mg/L，(NH₄)₂SO₄134mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，H₃BO₃3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B11mg/L，V_B61mg/L，半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6； 

2.预培养培养基(编号：B5-Y) 

KNO₃2500mg/L，(NH₄)₂SO₄134mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，H₃BO₃3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B11mg/L，V_B61mg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6； 

3.愈伤组织诱导及筛选培养基(编号是否为B5) 

KNO₃2500mg/L，(NH₄)₂SO₄134mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，H₃BO₃3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B11mg/L，V_B61mg/L，半胱氨10mg/L，2，4-D 0.6mg/L，KT 0.2mg/L，壮观霉素10mg/L，AgNO₃3mg/l，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH5.6； 

4.分化及筛选培养基(编号：BF-3S) 

KNO₃2500mg/L，(NH₄)₂SO₄134mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，H₃BO₃3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B11mg/L，V_B61mg/L，半胱氨10mg/L，6-BA 1mg/L，KT 1mg/L，NAA 0.5mg/L，壮观霉素20mg/L，AgNO₃3mg/l，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6； 

5.生根培养基(编号：B5-N) 

KNO₃2500mg/L，(NH₄)₂SO₄134mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，H₃BO₃3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B11mg/L，V_B61mg/L，半胱氨10mg/L，NAA 0.1mg/L，壮观霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6。 

3.候选转基因植株的PCR检测 

利用PCR分子鉴定技术(具体程序参见梁国栋主编，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2001)，根据报告基因(aadA，见序列表SEQ ID NO：1)的序列设计引物，序列如下： 

5’端引物：5’-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3’(见序列表SEQ ID NO：9) 

3’端引物：5’-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3’(见序列表SEQ ID NO：10)。 

反应体系为： 

dNTP(2mM)                    2μl 

10X缓冲液(Buffer)         2.5μl(购自宝生物工程(大连)有限公司) 

MgCl₂                     1.5μl 

Primer1(10mM)             0.5μl 

Primer2(10mM)             0.5μl 

Taq(5U/L)                 0.5μl 

模板DNA(50ng/μl)         1μl 

去离子水                  17.5μl 

总体积                    25μl 

PCR循环反应参数：95℃变性5min，然后依次在95℃变性1min，64℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次后在72℃保温10min，最后4℃保存。取10μL扩增产物在含溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。发明效果如附图4。 

4.转基因植株的Southern杂交检测 

取经PCR检测呈阳性的植物总DNA约10μg，根据样品数配制酶切反应混合液：每个反应体系含10×Buffer 5μL，限制性内切酶EcoR I 2μL含(20u)，水28μL，混匀，分装至0.5mL的离心管中，每管35μl，加入总DNA 15μL，酶切体系为50μL，小心弹匀，瞬时离心，置于37℃水浴中过夜(12-18h)，第二天上午取3μL电泳检测酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚蓝缓冲液终止酶切，置于4℃，直至电泳。 

用0.8％琼脂糖(购自Sigma公司产品)凝胶电泳，0.8-1.0V/cm电泳18-24h。将胶切成膜一样大小和形状；用0.2mol/L HCl变性10min，置于转膜台上，用0.4mol/L NaOH和1mol/L NaCl作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N⁺尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃烘膜2h；取出冷却后用保鲜膜包好，置于4℃冰箱保存备用。 

³²P探针制备、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。发明效果见附图5。 

5.转基因植株的Northern杂交检测 

提取经Southern杂交阳性株系的总RNA，利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取总RNA，液氮研磨后每管分约0.1g，加入1ml的Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)，摇匀室温静置10min；加入200μl的三氯甲烷后立即剧烈摇晃30s，室温静置5min；4℃，12000r/m离心10min；取上清溶液转移置新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，4℃，12000r/m离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇溶液洗一次，4℃，12000r/m离心5min收集沉淀；室温干燥后溶于20μl的1∶1000稀释的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的总RNA首先用0.8％的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性，然后用紫外分光光度法测定RNA的得率(OD₂₆₀/OD₂₈₀，Ratio，R)，R值介于1.8-2.2之间时，说明提取的RNA质量良好。利用DNA酶I(购自宝生物工程(大连)有限公司)除去总RNA中的基因组DNA。反应体系如下：10倍的DNA酶I缓冲液5μl(购自美国Invitrogen公司)，DNA酶I 2μl，RNA酶抑制剂(40U/ml)1μl，总RNA 20μl(约40μg)补水至50μl。37℃反应30min后，加入50μl的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入等量的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置60min，12000r/m离心10min回收沉淀，每管加入1ml 70％的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m离心10min收集沉淀，室温干燥后用20μl的DEPC水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。 

每个样品取20μg RNA进行甲醛变性凝胶电泳，具体过程如下：配制5x甲醛凝胶电泳缓冲液：将20.6g3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml经用DEPC处理的50nmol/L乙酸钠溶液。用2mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。制备凝胶：将1.28g琼脂糖溶于水，冷却至60℃，加入5x甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1x和2.2mol/L，在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30分钟使凝胶凝固。在一灭菌的微量离心管中混合样品：RNA(约20μg)4.5μl，5x甲醛凝胶电泳缓冲液2.0μl，甲醛3.5μl，甲酰胺10.0μl，于65℃温育15分钟，冰浴冷却，离心5秒使管内所有液体集中于管底。然后加入2μl灭菌切经DEPC处理过的甲醛加样缓冲液(50％甘油，1mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF)。加样前将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V/cm，然后将样品加至凝胶加样孔。将胶浸入1x甲醛凝胶电泳缓冲液中，4V/cm电压进行电泳。当溴酚蓝迁移出点样孔约8cm时停止电泳 

将胶切成膜一样大小和形状，先用DEPC处理过的水淋洗胶3次以去除甲醛，然后将胶在0.05mol/L NaOH中浸泡20min，用DEPC水冲洗后将胶置于转膜台上，20xSSC(3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0)作为转移缓冲液，将RNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃烘膜2h；取出冷却后用保鲜膜包好，置于4℃冰箱保存备用。 

32P探针制备、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。发明效果见附图6。 

实施例2：对比实验实施例 

1)不同愈伤诱导培养基对甘蓝型油菜子叶诱导愈伤组织的差异 

在本实施例中，申请人设计了6种诱导愈伤组织的培养基(如后所述)，以三个油菜品种华油杂6号、华油杂7号、华油杂9号(该三个品种均为华中农业大学选育，在中国大面积推广应用的油菜新品种)的子叶为外植体，期望能够获得一种能够长期保持愈伤组织脱分化状态，并能得到较高质量愈伤组织的愈伤诱导培养基。 

本发明设计的6种培养基的配方及编号如下： 

B5D-1：B5基本培养基+NAA 5mg/l+6-BA 5mg/l； 

B5D-2：B5基本培养基+0.4％MES； 

B5D-3：B5基本培养基+2，4-D 0.2mg/l； 

B5D-4：B5基本培养基+2，4-D 0.4mg/l； 

B5D-5：B5基本培养基+2，4-D 0.6mg/l+KT0.2mg/l； 

B5D-6：B5基本培养基+2，4-D 0.8mg/l+KT0.3mg/l； 

上述培养基中的激素英文缩写的定义为：6-BA：6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤；KTKinetin，激动素；NAA：Napthalene acetic acid，萘乙酸；2，4-D：2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸；MES：2-(N-吗啉)乙磺酸MES。 

上述培养基均添加30g/l蔗糖和3mg/l AgNO₃，制备时补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6，培养基用121℃高压蒸汽灭菌20min。 

试验表明，在上述培养基中，编号为B5D-5培养基诱导的愈伤组织出愈率较高，4周后大部分愈伤组织仍保持较好的脱分化状态，致密且呈淡绿色，有利于芽苗的分化。而且在4周后，仍有80％以上的愈伤组织保持脱分化状态，发明效果如图6A-e，6B。 

2)不同分化培养基对芽苗分化的影响： 

将上述在B5D-5培养基上，25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下生长1个月的愈伤组织分别接种到下列分化培养基上，30d后统计分化率，期望获得能使长期保存的愈伤组织具有较高分化能力，较低玻璃化和畸形再生植株频率的分化培养基。 

分化培养基的配方和编号： 

BF1：B5基本培养基+6-BA 3mg/L+ZT 1mg/l； 

BF2：B5基本培养基+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/l； 

BF3：B5基本培养基+6-BA 1mg/L+KT 1mg/l+0.5mg/l NAA； 

上述培养基均添加30g/l蔗糖和3mg/l AgNO₃，制备时补充水分至1L，灭菌前调pH至5.6，培养基用121℃高压蒸汽灭菌20min。 

根据培养30天的油菜叶绿体愈伤组织的分化率统计，编号为BF3的分化培养基能够使长期处于脱分化状态的愈伤组织快速进入分化阶段，10-15d左右在油菜叶绿体愈伤组织表面出现绿色芽点，30d左右分化出绿芽，未发现有玻璃化和形态畸形的再生芽。正常再生绿芽经生根培养基诱导，通过壮苗后移栽至温室管理，所有再生植株均能正常抽苔、开花和结果，未发现畸形苗(见图6C)。 

序列表 

<110>华中农业大学 

<120>基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法 

<130> 

<141>2010-01-27 

<160>12 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>792 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(792) 

<223> 

<400>1 

atggcagaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc     60 

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc    120 

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa    180 

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc    240 

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt    300 

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt    360 

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa    420 

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcttgaacag    480 

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct    540 

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc    600 

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat    660 

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc    720 

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta    780 

gtcggcaaat aa                                                        792 

<210>2 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>RBS 

<222>(1)..(36) 

<223> 

<400>2 

aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccc                       36 

<210>3 

<211>28 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(28) 

<223> 

<400>3 

atagagctct ggaaccctga acagactg                                28 

<210>4 

<211>29 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(29) 

<223> 

<400>4 

atagcggccg catttgaacc agagacctc                               29 

<210>5 

<211>28 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(28) 

<223> 

<400>5 

atagtcgacg gggatatagc tcagttgg                                28 

<210>6 

<211>28 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(28) 

<223> 

<400>6 

taagggcccc ggtactactt cgctatcg                                28 

<210>7 

<211>1493 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(1493) 

<223> 

<400>7 

tggaaccctg aacagactgc cggtgataag ccggaggaag gtgaggatga cgtcaagtca     60 

tcatgcccct tatgccctgg gcgacacacg tgctacaatg gccgggacaa agggtcgcga    120 

tcccgcgagg gtgagctaac tccaaaaacc cgtcctcagt tcggattgca ggctgcaact    180 

cgcctgcatg aagccggaat cgctagtaat cgccggtcag ccatacggcg gtgaattcgt    240 

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ctatgggagc tggccatgcc cgaagtcgtt    300 

accttaaccg caaggagggg ggtgccgaag gcagggctag tgactggagt gaagtcgtaa    360 

caaggtagcc gtactggaag gtgcggctgg atcacctcct tttcagggag agctaatgct    420 

tcttgggtat ttaggtttga cacagcttca aacccaaagc ccatgagctt attatcctag    480 

gtcggaacaa gttgatagga tcccctttta cgcccccatg tccctctcgt gtggcggcag    540 

gggggcgtaa aaaggaaaga gagggatggg gtttctctcg cttttggctt ggcatagcgg    600 

gcccccagca ggaggcccgc acgacgggct attagctcag tggtagagcg cgcccctgat    660 

aattgcgtcg ttgtgcctgg gctgtgaggg ctctcagcca catggatagt tcaatgtgct    720 

catcagcgcc tgaccctgag atgtggatca tccaaggcac attagcatgg cgtactcctc    780 

ctgttcgaac cggggtttga aaccaaactt ctcctcagga ggatagatgg ggcgattcac    840 

gtgagatcca atgtagatcc aactttctat tcactcgtgg gatccgggcg gtccggaggg    900 

gaccaccacg gctcctctct tctcgagaat ccatacatcc cttatcagtg tatggacagc    960 

tatctctcga gcgcaggttt aggttcggcc tcaatgggaa aataaaatgg agcacctaac   1020 

aacgtatctt cacagaccaa gaactacgag atcacccctt tcattctggg gtgacggagg   1080 

gatcgtaccg ttcgagcctt tttttcatgc ttttcccagg ggtctggaga aagctgcaat   1140 

caataggatt ttcctaatcc tcccttcccg aaaggaagaa cgtgaaattc tttttccttt   1200 

ccgcctcgaa atgggagcag gtttgaaaaa ggatcttaga gtgtctaggg ttaggccagt   1260 

agggtctctt aacgccctct tttttcttct catcgaagtt atttcacaaa tacttcctat   1320 

ggtaaggaag agggggggaa caagcacact tggagagcgc agtacaacgg agagttgtat   1380 

gctgcgttcg ggaaggatga atcgctcccg aaaaggaatc tattgattct ctcccaattg    1440 

gttggaccat aggtgcgatg atttacttca cgggcgaggt ctctggttca aat           1493 

<210>8 

<211>1490 

<212>DNA 

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(1490) 

<223> 

<400>8 

ggggatatag ctcagttggt agagctccgc tcttgcaatt gggtcgttgc gattacgggt      60 

tgggtgtcta attgtccagg cggtaatgat agtatcttgt acctgaaccg gtggctcact     120 

ttttctaagt aatggggaaa aggaccgaaa catgccactg aaagactcta ctgagacaaa     180 

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ccctggggaa gaggatcaag ttggcccttg cgaacagctt gatgcactat ctcccttcaa     360 

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ccccgtagga actacgagat caccccaagg acgccttcgg tatccagggg tcgcggaccg     480 

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cggatgtcag cggttcgagt ccgcttatct ccaactcgtg aacttagccg atacaaagct     900 

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aacgaggaag gcttacggtg gatacctagg cacccagaga cgaggaaggg cgtagtaagc    1080 

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<210>9 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(20) 

<223> 

<400>9 

atggcagaag cggtgatcgc                                         20 

<210>10 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(22) 

<223> 

<400>10 

ctagacatta tttgccgact ac                                      22 

<210>11 

<211>108 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>promoter 

<222>(1)..(108) 

<223> 

<400>11 

cctgaactaa ctcgtgggat tgacgtgagg gggcagggat ggctatattt ctgggagcga     60 

actccgggcg aatacgaagc gcttggatac agttgtaggg agggattt                 108 

<210>12 

<211>507 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>terminator 

<222>(1)..(507) 

<223> 

<400>12 

ctgcaggaat tcgatgggga gcgatcctgg cctagtctat aggaggtttt gaaaagaaag     60 

gagcaataat cattttcttg ttctatcaag agggtgctat tgctcctttc tttttttctt    120 

tttatttatt tactagctag tattttactt acatagactt ttttgtttac attatagaaa    180 

aagaaggaga ggttattttc ttgcatttat tcatgattga gtattctatt ttgattttgt    240 

atttgtttct agtaattaat tcccgccttt cgctttttgg gggtggaagg aaaaagaaaa    300 

cgtaggggag ggatagaatc actacactat cacggccaac tataccaaat ccttaattta    360 

aggatatatt taatgctatt tatgaaatta aataataaat aaatagtaat aaaattactt    420 

tatcttggat cttgggcgga tagcgggaat cgaacccgca tcttctcctt ggcaaagaga    480 

aagatatcaa gcttatcgat accgtcg                                             507 

Claims (3)

1.一种利用基因枪方法培育油菜叶绿体转基因的方法，其步骤包括培养基制备，引物设计、PCR扩增、载体构建和遗传转化，其特征在于，以油菜子叶为外植体，通过基因枪法将油菜叶绿体特异性表达载体导入受体油菜中，通过筛选及鉴定，得到叶绿体转化植株，其步骤如下：

1)引物设计和载体构建：根据Genebank公布的拟南芥叶绿体基因组序列(登录号为NC000932)，设计两对特异引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA，以油菜叶绿体基因组为模板，用所述的引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA扩增trnI和trnA基因片段，测序后作为同源重组片段，从质粒p-aadA中分别用SmaI和EcoRV酶切获得筛选标记基因aadA，其序列如SEQ ID NO：X所示，调控序列，其序列如SEQ ID NO：Y所示，从质粒p-Prrn中分别用SpeI和XhoI酶切获得启动子Prrn，从质粒p-TpsbA中分别用SmaI和EcoRV获得终止子TpsbA，将所述的同源重组片段、启动子、筛选标记基因和终止子连接到载体pBluescript上，构建得到油菜叶绿体特异性表达载体pCL318-5；所述的特异引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA的DNA序列如下所示：

F-trnI：5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’，

R-trnI：5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3’；

F-trnA：5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’，

R-trnA：5’-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’；

2)应用基因枪方法转化油菜子叶，它包括以下步骤：

1)外植体的获得：取饱满油菜种子经表面消毒后接种至B5基本培养基上，在25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下生长4d，然后将子叶切下，黑暗条件下高渗？预处理4h；

2)基因枪转化及筛选：将步骤1)的油菜子叶，进行基因枪轰击，每皿轰击2次，轰击后在黑暗条件下用B5培养基中恢复培养16h；

3)愈伤组织的诱导及筛选：将恢复培养后的油菜子叶切成3mm×3mm的块状，转入附加10mg/l壮观霉素的愈伤诱导培养基B5D-5S上，于25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下诱导愈伤组织，每两周继代培养一次，共继代培养4次；

4)愈伤组织的分化诱导：将步骤3)的绿色抗性愈伤组织接种到附加20mg/l壮观霉素的分化培养基BF3S上，于25℃下，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养至分化出绿色小芽，得到候选转基因苗； 

5)再生芽的生根诱导：将步骤4)的得到的材料，在生根培养基B5-N上和壮苗培养基B5上培养，筛选获得候选转基因植株；

6)采用PCR、Southern方法检测PCR阳性株系，获得转基因植株。

其中

所述的培养基成分如下所述：

发苗培养基B5：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄ ^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂ ^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄ ^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄ ^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄ ^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄ ^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄ ^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂ ^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

预培养培养基B5-Y

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄ ^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂ ^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄ ^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄ ^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄ ^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄ ^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄ ^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂ ^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

愈伤组织诱导和筛选培养基B5D-5S：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄ ^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂ ^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄ ^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄ ^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄ ^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄ ^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄ ^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂ ^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，2，4-D 0.6mg/L，KT 0.2mg/L，壮观霉素10mg/L，AgNO₃ 3mg/l，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH5.5；

分化和筛选培养基BF-3S

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄ ^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂ ^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄ ^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄ ^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄ ^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄ ^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄ ^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂ ^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，6-BA 1mg/L，KT 1mg/L，NAA 0.5mg/L，壮观霉素20mg/L，AgNO₃ 3mg/l，蔗糖 30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

生根培养基B5-N：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄ ^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂ ^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄ ^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄ ^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄ ^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄ ^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄ ^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，NAA 0.1mg/L，壮观霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤6)中Southern杂交所述的步骤如下：

提取经PCR检测呈阳性的油菜叶片的总DNA，用限制性内切酶EcoR I酶切，将酶切过的DNA片段转移到Hybond-N⁺尼龙膜上，并用³²P制备探针，对转好的膜进行分子杂交、洗膜、压片，筛选阳性植株。

3.权利要求1和2所述的方法在培育油菜转基因植株上的应用。 

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