JP2000506019A

JP2000506019A - アラビドプシス・サリアナアにおけるプラスチド形質転換

Info

Publication number: JP2000506019A
Application number: JP9531912A
Authority: JP
Inventors: マリガ，パル; シクダル，サミル・アール; レディ，シバ・バンガ
Original assignee: ラトガーズ・ユニバーシティ
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 2000-05-23
Also published as: AU732479B2; DE69733881T2; BR9707948A; WO1997032977A1; CN1114692C; ATE301187T1; CN1222934A; CA2247980A1; CA2247980C; EP0885298A4; US6376744B1; AU2068497A; EP0885298A1; DE69733881D1; EP0885298B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、トランスプラストムされたアラビドプシスおよびブラシカ植物を得るための方法および組成物を提供する。詳細には、方法は外因性の有益なＤＮＡ分子のデリバリー後の形質転換植物の再生を促進する組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アラビドプシス・サリアナアにおけるプラスチド形質転換３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．２０２条（ｃ）に従い、米国政府が本明細書に記載する発明において特定の権利を有し、発明がNational Science Foundation Grant Number 、ＭＣＢ９３−０５０３７からの基金により一部作成されたことを承認する。発明の属する技術分野本発明は、トランスジェニック植物の分野に関する。特に、本発明は、クルシフェラエ（Cruciferae）科からの植物におけるプラスチドの形質転換のための組成物および方法を提供する。発明の背景本発明が属する技術の水準をより詳しく記載するために、いくつかの出版物を本出願において補足的に参照する。これらの参考文献の完全な引用を明細書の最後に示す。これらの出版物の各々の開示は、本明細書に完全に示されるものとして出典明示により本明細書に包含する。高等植物のプラスチドゲノムは、葉細胞１個あたり１９００ないし５００００コピー存在できる環状二本鎖ＤＮＡ分子である(Palmer，1991;Bendich，1987)。タバコプラスチドゲノム（プラストム）の安定な形質転換は、以下の工程により達成されている：(ｉ)バイオリスティックプロセス(Svab et al．1990a;Svab an d Maliga 1993)またはＰＥＧ処理（Gold et al．1993;O'Neill et al.，1993）による抗生物質耐性をコードする形質転換ＤＮＡの導入、(ｉｉ)2つの相同組換え処理による形質転換ＤＮＡの組み込み、および（ｉｉｉ）選択培地上での繰り返し細胞分裂の間の野生型ゲノムコピーの選択的排除。スペクチノマイシン耐性を変異プラスチド１６ｓリボソームＲＮＡ遺伝子(Svab et al．1990a;Staub and Maliga 1992;Golds et al．1993）においてコードされるか、または、操作された細菌ａａｄＡ遺伝子の発現（Svab and Maliga 1993）により与えられる選択マーカーとして用いた。選択マーカー遺伝子およびタバコプラスチドゲノムの繰り返し領域中へのキメラ遺伝子の挿入の標的としてａｄｄＡを利用するベクターが、利用可能である(Zoubenko et al.，1994)。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（kan遺伝子）の発現に基づく、カナマイシン耐性によるプラスチド形質転換体の選択は、より困難であるが、利用可能である(Carrer et al.，1993;Car rer and Maliga，1995)。現在まで、高等植物中での安定なプラスチド形質転換は、タバコにおいてのみ報告されている(Maliga，1993;Maliga et al.，1993に総説されている)。他の農業的および医薬的に重要な種からのトランスプラストム植物が非常に所望される。クルシフェラエ科の高等植物のプラスチドにおける目的とする外来遺伝子の発現は、外来遺伝子の核発現に対していくつかの有利性を提供する。これらは、１）プラスチド中の外因性ＤＮＡ配列の発現は、形質転換ＤＮＡの花粉伝達の可能性を排除する；２）タンパク質発現の高いレベルが得られる；３）ポリシストロン性単位として多数の遺伝子の同時発現が利用できるおよび４）核の形質転換の結果である位置効果および遺伝子サイレントもまた除かれる、である。発明の概要本発明は、安定に形質転換されたトランスプラストム植物を作成するための改良された方法を提供する。本発明の一の具体例において、子葉細胞を均一な細胞分裂を刺激するのに十分な時間、高オーキシン液体培地中で培養する。初期培養は高密度（５０−２００子葉／２０ｍｌ）である。ついで、子葉を外因性の形質転換ＤＮＡのデリバリーのために寒天固化培地に移す。形質転換ＤＮＡのデリバリーに続けて、子葉を低密度（２５−３０／５０ｍｌ）で、高サイトキニンレベルおよび選択剤を含む培地に移し、形質転換体の選択および植物再生を促進させる。ついで、プラスチドゲノム中に外因性ＤＮＡが存在することをサザンブロット解析またはＰＣＲにより確認する。本発明の形質転換ＤＮＡ分子は、いくつかの異なる特徴を有する。それらは、１）形質転換される植物からのプラスチドＤＮＡ配列からなる目的とする外来遺伝子に隣接するセグメントを標的とし、それにより、形質転換ＤＮＡの所定のプラスチドゲノムの領域への相同組換えを促進する；２）選択マーカー遺伝子が標的セグメント内に位置し、選択剤に対する抵抗を付与する；３）プラスチドＤＮＡ由来の５’および３’調節配列は目的とする外来遺伝子をコードする配列に作動的に連結しており、それにより形質転換ＤＮＡの発現およびコードされるｍＲＮＡの安定性を増強する；および４）選択マーカーに隣接する、目的とする外来遺伝子の挿入のためのクローニング部位の少なくともひとつは、それ自体では選択可能ではない、である。選択マーカー遺伝子および目的とする外来遺伝子は隣接配列の異種ブロックを形成するので、両方の遺伝子のプラスチドゲノム中への取り込みは、効果的である。本発明の他の態様において、葉細胞をはじめに高オーキシン培地で処理し、ついで、形質転換ＤＮＡで形質転換し、高サイトキニンレベルおよび所定の選択剤の存在下で培養する。形質転換プラスチドを含む細胞を選択剤の存在下で維持し、トランスプラストム植物中で再生可能なホモプラスミック細胞の入手を促進する。かくして、本発明は、トランスプラストミック植物を作成するための新規な方法および組成物を提供する。アラビドプシス（Arabidopsis）族はマスタードまたはクルシフェル科(BrassicaceaeまたはCruciferae)に属し、約３４０族および３３５０種の広く分布する科である。かかる科は、野菜の農作物、油種子、スパイス、およびより少ない程度で装飾品の源として大きな経済的重要性がある。農業的重要性の多くは、ブラシカ（Brassica）族に由来する。経済的に重要なブラシカssp.の例は、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)(油種子)、ブラシカ・ジュンシア(Brassica juncea)(油種子)、ブラシカ・カンペストリス(Brassica Campe stris)(油種子)、ブラシカ・ジュンシア(Brassica juncea)(油種子)、ブラシカ・オレラシア(Brassica oleracea)(ブロッコリ、カルフラワー、キャベツ)、ブラシカ・ニグラ(Brassica nigra)(ブラックマスタード)おおびブラシカ・ヒルタ (Brassica hirta)(ホワイトマスタード)である。アラビドプシス・サリアナ(植物研究のモデル種、Meyerowitz and Sommervill e， 1994)およびブラシカssp.(重要な農業作物)におけるプラスチド形質転換を本明細書において例示する。これらの方法はクラシフェラエ科からの他の植物におけるプラスチド形質転換に対しても適切である。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＧＳ３１Ａで形質転換後、アラビドプシスプラスチドゲノムへのａａｄＡの組み込みを図式で例示する。図１Ａは、形質転換ベクターｐＧＳ３１Ａ、組み込まれたスペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子を含むｐｔＤＮＡ領域(Ｔ−ｐｔＤＮＡ)、および、野生型ｐｔＤＮＡの共通の領域のマップを示す。１６ＳｒＲＮＡ、ｒｐｓ１２／７およびｔｒｎＶは、プラスチド遺伝子である(Shinozaki et al.，1986)。図１Ｂは、Ｐ１およびＰ２プローブ中に含まれるｐｔＤＮＡの領域を示す。図１Ｃは、プラスチドゲノム中のａａｄＡの組み込みを確証するサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示すオートラジオグラムである。Ｐ１標的配列は、野生型（Ａｔ）植物の２．７２−ｋｂフラグメント、および、トランスプラストム系（Ａｔ−ｐＧＳ３１Ａ−１６）のより長い３．８２−ｋｂフラグメントとハイブリダイズする。トランスプラストム系においては野生型フラグメントが欠損していることに注目されたい。ａａｄＡプローブ、Ｐ２は、大きい方のトランスプラストムフラグメントにのみハイブリダイズする。図２は、アラビドプシス葉に用いたプラスチド形質転換プロトコールの概要図である。図３は、形質転換プラスチドを有するアラビドプシス・サリアナ（ＲＬＤ）の子葉外殖片からの受精可能なアラビドプシス植物を得るのに用いた別のプロトコールの概要図である。図４は、ｐＧＳ７およびｐＧＳ８５Ａプラスミドのプラスチド標的領域のマップである。プラスミドｐＧＳ７の特異的なＨｉｎｃIIクローニング部位およびプラスミドｐＧＳ８５のＫｐｎＩ制限部位、およびキメラのｋａｎ・カナマイシン耐性遺伝子に注目されたい。プラスチド遺伝子、ｔｒｎＶ、１６ＳｒＤＮＡおよびｒｐｓ１２／７は、Shinozaki et al.，1986に記載されている。転写開始の部位および方向を横向きの矢印で示す。図５は、プラスミドｐＧＳ７の標的領域の配列である。カナマイシンまたはスペクチノマイシンに耐性を与える遺伝子は、印をつけたＨｉｎｃII部位に挿入される。図６は、プラスミドｐＧＳ３１Ａのプラスチド標的領域の配列である。図７は、プラスミドｐＧＳ８５Ａのプラスチド標的領域の配列である。発明の詳説知られる限りにおいて、プラスチド形質転換は、タバコにおいてのみ示されている。アラビドプシス・サリアナおよびブラシカ・ナプスにおけるプラスチドの形質転換のプロトコールを確立し、これらの形質転換体を作成するのに有用な方法を以下に示す。以下の実施例におけるアラビドプシスおよびブラシカの使用は、本発明の方法を例示するためのものである。本明細書に開示する方法は、クルシフェラエ科の他の植物に適用してもよい。アラビドプシス・サリアナのプラスチドを、以下の実施例１において記載するように微視的（１μｍ）タングステン粒子の表面上で、葉細胞へ形質転換ＤＮＡをバイオリスチックにデリバリーして、形質転換する。これらの実験に用いた形質転換プラスミドｐＧＳ３１Ａは、プラスチドＤＮＡ配列に隣接するスペクチノマイシン耐性（ａｄｄＡ）遺伝子を有し、ｔｒｎＶおよびｒｐｓ１２／７オペロンの間をその挿入の標的とする。隣接するｐｔＤＮＡ配列およびスペクチノマイシン培地上での選択的増幅を介する２つの相同組換え処理によりａｄｄＡの組み込み、スペクチノマイシン耐性細胞系を得た。再生植物は、ホモプラスミックであり、その中ではプラスチドゲノムコピーは、形質転換ＤＮＡにより均一に変化していた。プラスチド形質転換の効率は低く、２０１個の爆撃葉試料中２個であった。しかしながら、２個の系から再生した９８の植物のうち受精可能であるものはなかった。これらの生植性の問題は、２,４−Ｄ、オーキシン(Van der Graaff and Hooyk as， 1996)処理が長期間であることによる可能性があった。この薬剤に対する曝露の時間を短くして受精能の問題を解決することが可能である。形質転換のための適当な葉の源を提供するためにアラビドプシス・サリアナを比較的長時間生育させることでも、葉をより望ましくない組織源とする。子葉および葉は、それぞれ細胞あたりプラスチドゲノムコピーを多数含む。加えて、子葉はより利用可能な組織源を提供する。したがって、子葉細胞を、以下の実施例IIに示すように形質転換ＤＮＡの受容体として用いる。子葉細胞は、形質転換ＤＮＡで爆撃するために細胞を調製する培養時間が比較的短いので(７日) 、本発明の方法を行うために葉細胞よりも好ましい。標的細胞として子葉細胞を用いる別の有利性は、２，４−Ｄの非存在下で未成熟子葉から受精可能なアラビドプシス植物の再生が報告されていることである(Patton and Meinke，1988)。加えて、２，４−Ｄの非存在下での葉移植片からの受精可能なアラビドプシス植物の再生についてのプロトコールが記載されている(Lloyd et al.，1986;Van de r Graaff and Hooykas，1996)。実施例IIIに記載されるように、アラビドプシス・サリアナおよびブラシカ・ナプスは、同じクルシフェラエ科に属し、それゆえ、プラスチドゲノムは、相同性を高い度合いで共有し、本質的に同一である(Palmer et al.，1994)。したがって、アラビドプシス用に開発されたプラスチド形質転換ベクターおよび発現カセットを修飾することなく、ブラシカ種におけるプラスチド形質転換および外来遺伝子の発現に用いることができる。以下の定義を、本発明の理解を容易にするために示す。ヘテロプラスミック(heteroplasmic)；は、単一プラスチド内の、または、植物細胞もしくは組織に含まれるプラスチドの集団内のいずれかの、異なるプラスチドゲノムの混合集団の存在を意味する。ホモプラスミック(homoplasmic)；は、プラスチド内または植物細胞および組織に含まれる集団内のいずれかの、プラスチドゲノムの純粋な集団を意味する。ホモプラスミックプラスチド、細胞または組織は、これらがただ１つの型のプラスチドゲノムを含むので、遺伝的に安定である。それゆえ、これらは選択圧が除かれた後でさえホモプラスミックとして残り、自己子孫もまたホモプラスミックである。本発明の目的のため、機能的にホモプラスミックのゲノムのヘテロプラスミックの集団（すなわち、配列変異のある野生型ＤＮＡまたは形質転換ゲノムを少数のみ含む）を本明細書において、「機能的にホモプラスミック」または「本質的にホモプラスミック」と称する。細胞または組織のこれらの型を非致死選択培地上での連続選択によりホモプラスミイ（homoplasmy）にまで容易に精製できる。かかる植物のほとんどの種子子孫は、プラスチドゲノムのランダム選別により、選択圧の非存在下で、ホモプラスミックである。プラストーム(plastome)；プラスチドのゲノム。トランスプラストム(transplastome)；形質転換プラスチドゲノム。プラスチドの形質転換；形質転換プラスチドを含む植物の種子子孫に伝わる、プラスチドゲノムへの形質転換ＤＮＡの安定な取り込み。選択マーカー；「選択マーカー」なる用語は、選択マーカーをコードする遺伝子または対立遺伝子が形質転換に用いる外来ＤＮＡ中に含まれる場合、形質転換されたオルガネラ、細胞または組織を首尾よく同定する表現型を意味する。形質転換ＤＮＡ；は、プラスチド中に導入されると、プラスチドゲノムの部分を相同組換えにより置きかえる、同種ＤＮＡ、または同種ＤＮＡが隣接する異種ＤＮＡを意味する。標的セグメント；は、外来ＤＮＡおよびプラスチドゲノム間の相同組換えを促進する相同する隣接領域を意味する。翻訳的に融合した；は、キメラタンパク質が発現するように、構築物においてともにスプライスされる、異なる源由来の構築物中の２つのコーディングＤＮＡセグメントを意味する。高オーキシン培養基；オーキシンのみ、または、高濃度のオーキシンおよびきわめて低濃度のサイトキニンの組み合わせを含む植物組織培養基。オーキシンに対する植物細胞の応答は、所定の分類グループに対して特異的である。異なるオーキシンを組み合わせて適用した場合、それらの効果は、付加的でなくてもよい。さらに、オーキシンに対する組織応答は、サイトキニンにより修飾されてもよい。したがって、用いるオーキシンの種類および濃度は、形質転換する種に対して経験的に決定しなければならない。本発明における使用のための高オーキシン培地の好ましい例は、１ｍｇ／ｍｌのオーキシン、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および低濃度（０．２ｍｇ／ｍｌ）のサイトキニン、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含むＣ１培地である。インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）およびジクロロ−フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などの他のオーキシンもまた、均一な細胞分裂を促進するために用いてもよい。高サイトキニン培養基；高オーキシン培地のように、植物細胞の高サイトキニン培地に対する植物細胞の応答は、分類グループ特異的である。本発明において使用するための好ましい高サイトキニン培地の例は、１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、２ｍｇ／ｌの２ｉＰ、(６−（ガンマ、ガンマ−ジメチルアリアミノ)プリンまたはＩＰＡ、Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン）および低濃度のオーキシン、ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を含むＣ１培地である。用いることのできる他のサイトキニンは、６−フルフリルアミノプリン（ＫＩＮまたはキネチン）である。以下の実施例において示す詳細な記載は、本発明のＤＮＡ構築物の好ましい作成方法および使用方法、ならびに本発明の方法を行う好ましい方法に関する。詳細に記載していない分子クローニングおよび組換えＤＮＡ技法を、例えば、Samb rook et al.，"DNA Cloning，A Laboratory Manual，" Cold Spring Harbor Lab oratory，1989またはAusubel et al．eds．in "Current Peotocols in Molecula r Biology"，John Willey and Sons，1995などに、一般に示される標準的な方法により行う。以下の実施例を本発明をより詳しく記載するために示す。これらは本発明の範囲を限定するものではない。実施例Ｉスペクチノマイシン耐性の選択によるアラビドプシス葉におけるプラスチド形質転換以下の材料およびプロトコールにより実施例Ｉの方法の実行が可能となる。用いた方法の概要図を図２に示す。植物材料形質転換の受容体として、アラビドプシス・エコタイプ・ＲＬＤを用いた。このエコタイプは、培養において容易に再生可能であることが報告されている(Mar ton and Browse，1991)。ベクターｐＧＳ３１Ａの構築アラビドプシスプラスチド形質転換ベクターｐＧＳ３１Ａを図１中に示す。ｐＧＳ３１Ａの直接の祖先は、プラスミドｐＧＳ７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ファージミドベクター（Stratagene）誘導体である。プラスミドｐＧＳ７は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５’−末端、ｔｒｎＶおよびｒｐｓ１２／７オペロンの部分を含む２−ｋｂのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩアラビドプシスｐｔＤＮＡフラグメントを有する。ｐＧＳ７プラスミドの構築の間に、ＨｉｎｄIII（１６ＳｒＤＮＡ中の部位）およびＫｐｎＩ（ベクター中、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖張り出し部分を除去する）で消化し、平滑末端を連結して、除去する。ベクターｐＧＳ３１Ａは、プラスミドｐＺＳ１９７（Svab and Mal iga，1993）中に存在する、選択可能なスペクチノマイシン耐性遺伝子（Prrn::a adA::TpsbA）を有する。ａａｄＡコーディング領域は、合成リボソーム結合部位（Prrn）と融合したタバコｒＲＮＡオペロンのプロモーターからなる合成プロモーターから転写される。ａａｄＡｍＲＮＡをコーディング領域の下流の配列とタバコプラスチドｐｓｂＡ遺伝子（ＴｐｓｂＡ）の３’−非翻訳領域を転写的に融合させて安定化する。ｐＧＳ３１Ａの遺伝子は、ａａｄＡおよびＴｐｓｂＡの間のＸｂａＩ部位が平滑化によって除去されたｐＺＳ１９７の修飾祖先由来である。プラスミドｐＧＳ３１Ａを、ｔｒｎＶおよびｒｐｓ１２／７オペロン間のプラスミドｐＧＳ７の特異的ＨｉｎｃII部位への連結のために、キメラａａｄＡをＥｃＩ１３６II（ＳａｃＩのイソキソマー、平滑末端になる）およびＢｓｐＨＩ（一本鎖張り出しを埋めて平滑末端を得る）で除去して得た。組織培養基組織培養プロトコールをMarton adn Browse(1991)およびCzako et al．(1993) から適用した。アラビドプシス組織培養基(ＡＲＭ)は、Murashige&Skoog(1962) ＭＳ培地の誘導物である。ＡＲＭ培地：ＭＳ塩、３％シュークロース、０．８％ＴＣ寒天、２ｍｌ／Ｌビタミン溶液(１ｍｌあたり、１００ｍｇミオイノシトール、５ｍｇビタミンＢ１、０．５ｍｇビタミンＢ６、０．５ｍｇニコチン酸、１ｍｇグリシンおよび０．０５ｍｇビオチン)。ＡＲＭＩ培地：１リットルあたり、３ｍｇインドール酢酸(ＩＡＡ)、０．１５ｍｇ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．６ｍｇベンジルアデニン（ＢＡ）および０．３ｍｇイソペンテニルアデニン（ＩＰＡ）を含むＡＲＭ培地。ＡＲＭＩＩｒ培地：０．２ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および０．４ｍｇ／ＬＩＰＡを加えたＡＲＭ培地。アラビドプシス・苗条誘導（ＡＳＩ−ＮＩＢＩ）培地：１ｍｇ／ＬＮＡＡおよび１ｍｇ／ＬＢＡＰを加えたＡＲＭ培地。アラビドプシスの苗条をＡＲＭ培地上に根付かせた。アラビドプシス種子培養（ＡＲＭ５）培地：５％シュークロースを加えたＡＲＭ培地。植物ホルモンのストックを濾過滅菌し、オートクレーブ後４５℃に冷却した培地に添加した。選択培地は、５００ｍｇ／ＬスペクチノマイシンＨＣｌおよび／または硫酸ストレプトマイシンを含んだ。抗生物質（濾過滅菌）をオートレクーブ後４５℃に冷却した培地に添加した。滅菌培養におけるアラビドプシス植物の培養表面滅菌のため、種子(２５ｍｇ)をエッペンドルフチューブ中５〜７分間時々ボルテックスしながら１ｍｌの市販の漂白剤(５．２５％次亜塩素酸ナトリウム) で処理した。種子を漂白剤とともに１０ｍｌの９０％エタノールを含む１５ｍｌのコニカル遠心チューブ中に注ぎ、５〜７分間インキュベートした。エタノール -漂白剤混合物をデカントし、種子を１０ｍ１のオートクレーブした脱イオン化水で４回洗浄し、最後に滅菌水中に再懸濁した(約１５０種子／ｍｌ)。得られた種子懸濁液（２ｍｌ）を５０ｍｌのＡＲＭ５培地を含む深（高さ１０ｍｍ）ペトリ皿中に注いだ。懸濁液をかき混ぜて、種子を一様に広げた。ついで水をピペッティングによりプレートから除去した。種子が２４℃において１０〜１５日培養後発芽した(培養中、プレートを冷白色蛍光チューブ（２０００ｌｕｘ）を用いて８時間照らした)。植物をより大きな葉に生育させるため、実生をそれぞれＡＲＭ５プレート(１０ｃｍペトリ皿あたり１０植物)に移し、冷白色蛍光バルブ(ｌｕｘ；温度２１℃ 昼間、１８℃夜)で８時間照らした。厚い、暗緑葉、大きさ１ｃｍないし２ｃｍを５〜６週間後、爆撃のために収集した。スペクチノマイシン耐性系の形質転換および選択プラスチド形質転換のために葉（長さ約１．５ないし３０ｍｍ）を滅菌的に生育させた植物から収集した。直径４〜５ｃｍの円形領域を覆うために、１２〜１８の葉を寒天固化ＡＲＭＩ培地上に置いた。ｐＧＳ３１ＡベクターＤＮＡを、ヘリウム−作動ＰＤＳ１０００バイオプラスチックガンを用いて微視的（１μｍ）タングステン粒子の表面上で、バイオリスチック方法により葉クロロプラスト中へ導入した。新鮮な葉を４５０ｐｓｉで爆撃した(標的を破裂ディスクから９ｃｍのところに置く；バイオプラスチックガンを上からＮｏ．３にセット)。ＡＲＭＩ培地上で４日間培養した葉を１１００ｐｓｉで爆撃した(標的を破裂ディスクから１２ｃｍのところに置く；バイオプラスチックガンを上からのＮｏ．４にセット)。葉爆撃をＡＲＭＩ培地中で行った。爆撃に続けて、葉をＡＲＭＩ培地中でさらに２日間培養した。この期間の後、葉をカミソリの刃のスタックで印をつけ、１ｍｍ離れた一連の平行な切り込みを作成した。葉において均一なカルス形成を誘導するために機械的に傷つけることが必須であることがこれまでに観察されている。印をつけた葉をスペクチノマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）を含む同じ培地( ＡＲＭＩ)上に移し、形質転換ｐｔＤＮＡコピーを含むプラスチドの優先的な複製を促進させた。ＡＲＭＩ培地は、葉細胞の分化および無色、胚発生カルスの形成を誘導する。ＡＲＭＩ培地上で７〜１０日選択後、正常に緑化を誘導するＡＲＭＩＩｒ培地上でスペクチノマイシン選択を継続した。スペクチノマイシンは野生型細胞の緑化を妨げるので、スペクチノマイシン耐性細胞のみが緑色カルスを形成する。選択ＡＲＭＩＩｒ培地上での可視化緑色細胞カルスターが２１ないし７０日のうちに現れた。２０１爆撃化試料中、１９のスペクチノマイシン−耐性系を得た。１４のスペクチノマイシン−耐性系で植物再生を試み、そのうちの１０個で成功した。緑色カルスからの苗条をＡＳＩ−ＮＩＢＩ培地上で再生し、ＡＲＭ培地上に根付かせた。表１は、プラスミドｐＧＳ３１Ａのバイロリスティックデリバリー後のスペクチノマイシン耐性細胞系の回復を示す。表１．プラスミドｐＧＳ３１Ａでのエイ．サリアナの爆撃後のスペクチノマイシン耐性系の回復 ¹対照プレートは爆撃しなかった。² ｐｓｉ＝インチ四方あたりのポンド、破裂ディスクの値プラスチド形質変異を確認するための全細胞ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析スペクチノマイシン耐性は、プラスチド中のａａｄＡの発現(Svab and Maliga ,1993)、核中のａａｄＡの発現(Svab et al.,1990b)、または自然突然変異(From m et al.，1987;Svab and Maliga，1991)による可能性がある。サザンハイブリダイゼーションを行い、単離したスペクチノマイシン耐性系におけるプラスチド形質転換体を同定した。全細胞ＤＮＡをMettler(1987)にしたがって単離した。制限酵素−消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロン膜(A mersham)へ、PosiBlot transfer装置（Stratagene）を用いて移した。ブロットを迅速ハイブリダイゼーション緩衝液（Amersham）を用いて、ランダムプライミングにより生成した³²Ｐ標識プローブ(Boehringer-Mannheim)で、プローブ化した。プローブとして標的ｐｔＤＮＡを用いた場合、Ａｔ−ｐＧＳ３１Ａ−２およびＡｔ−ｐＧＳ３１Ａ−１６の系において、３．８２−ｋｂのトランスジェニックフラグメントのみが検出され、野生型のｐｔＤＮＡコピーが選択培地上での細胞分化の間に選択的に希釈されていることが示唆された。同じトランスジェニックフラグメントはまた、ａａｄＡプローブともハイブリダイズした(図１Ｃ)。１９のスペクチノマイシン耐性系のうち、１７の核形質転換体が、標的ｐｔＤＮＡプローブとハイブリダイズした場合、サザンブロット上で野生型のフラグメントにより同定された。用いたサザンブロットは高コピー（細胞あたり１００００）葉ｐｔＤＮＡに対して至適化されており、２、３の核ａａｄＡコピーでのシグナルは検出されないことに注意されたい。自然突然変異体は、サザンブロット上野生型のｐｔＤＮＡ標的フラグメントを有し、ＰＣＲ−増幅ａａｄＡ遺伝子を有さないものと考えられる。１９のスペクチノマイシン耐性系の試料において、そのような自然突然変異体は見られなかった。挿入されたａａｄＡ配列のＰＣＲ増幅ＤＮＡを標準的なプロトコール（９２℃で１分、５８℃で１．５分、７２℃で１．５分、３０サイクル）にしたがって増幅した。ａａｄＡ発現の結果によるスペクチノマイシン耐性を、以下のプライマー：５’−ＧＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＧＣＧＧ−３’ ５’−ＣＣＡＡＧＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＧ−３’ を用いて４０７のヌクレオチド内部セグメントのＰＣＲ増幅により確認した。トランスプラストム・アラビドプシス植物トランスプラストム・アラビドプシス植物はすべて開花したけれども、自殖後、または野生型植物からの花粉での受精後も、これらはいずれも種をつけなかった。これらには、スペクチノマイシン耐性がプラスチド形質転換によるものである２つの系から再生された９８の植物、および、スペクチノマイシン耐性が核ゲノム中のａａｄＡの発現によるものである１２の系から再生された６６の植物が含まれた。結論および考察重要な農業の解決法の、モデル種アラビドプシス・サリアナにおけるプラスチド形質転換が本発明において記載される。前記の結果に基づき、アラビドプシスｐｔＤＮＡの標的カセット中に挿入されると、キメラａａｄＡ遺伝子は、形質転換ＤＮＡのバイオリスティックデリバリー後プラスチド形質転換体を回収するのに適していることが見出される。しかしながら、アラビドプシスプラスチド形質転換体の数は、タバコプラスチドの形質転換体（爆撃試料あたり平均１個の形質転換体、Svab and Maliga，1993;Zoubenko et al.，1994）に基づいて期待されるよりも、かなり少ない(１００個のうち約１個)。比較的少ない形質転換効率には、多数の理由があるかもしれない。アラビドプシスクロロプラスとにおいて相同組換え系が比較的効率的でないなどの、固有の種−特異的相違が１つの明らかな理由であろう。タバコベクターｐＺＳ１９７において、ａａｄＡは１．５６−Ｋｐおよび１．２９ｋｂのｐｔＤＮＡに隣接しており、爆撃あたり１個の形質転換体を得る(Sva b et al.,1993)。またタバコベクターである、プラスミドｐＲＢ１５において、ａａｄＡは、より大きな標的セグメント、１．５６−ｋｂおよび３．６ｋｂのｐｔＤＮＡが隣接しており、爆撃あたり約５プラスチド形質転換体が得られる(Boc k and Maliga,1995)。アラビドプシスベクター、ｐＧＳ３１Ａにおいて、ａａｄＡは、両方の側に約１−ｋｂのプラスチド標的配列のみが位置する。それゆえ、アラビドプシスにおけるプラスチド形質転換の効率は、標的ｐｔＤＮＡフラグメントの大きさを増加させることで有意に改良されるかもしれない。葉から再生された植物のほとんどが受精可能であるタバコと対照的に、１６４の再生されたアラビドプシス植物のいずれもが種をつけなかったことは驚くべきことである。受精能の欠損は、部分的には、Galbright et al.，(1991)およびMe laragno et al.，(1993)により報告されるように、葉組織の広範囲な倍数性によるかもしれない。受精能の欠損の別の理由は、２，４−Ｄへの培養物の長い期間の曝露であるかもしれない(Van der Graff and Hooykaas，1996)。実施例II カナマイシン耐性を選択することによるアラビドプシス子葉におけるプラスチド形質転換実施例Ｉに記載されているように、ＤＮＡ被覆のタングステン粒子で爆撃を与えた後、葉培養基中のスペクチノマイシン耐性を選択することにより、アラビドプシン・サリアナにおけるプラスチド形質転換を得た。プラスチド形質転換は成功したが、再生植物は受精能を有しなかった。これらの障害は形質転換プロトコールの特定のパラメーターを変えることで解決された。この実施例にて開発され、かつ示されているプロトコールは以下の顕著な特徴：(１)その利用可能性が容易であるため、成熟種子を発芽させることで得られる子葉を用いるのに供し、それで多量の滅菌性子葉を表面滅菌種子より得る。(２) 該プロトコールは２つの別々の工程を有する。第１工程は高オーキシン培地を用いて子葉全体に均一な細胞分裂を誘発し(段階Ｉ)、第２工程は高サイトカイニン培地を用いて植物再生を誘発する(段階IIおよびIII)。該プロトコールは、組織培養の間の２,４−Ｄ含有培地への暴露を最小限とするか、またはより好ましくは、かかる暴露を完全に排除するように設計された。(３)後で豊富な植物再生を得るのに不可欠であることが証明されている、最初の８日間（段階Ｉ、II）の間に子葉細胞を高密度、すなわち、液体培地２０ｍｌ中５００−２００個の子葉で初期培養すること、を有する。アラビドプシスにおけるプラスチド形質転換についてのプロトコールは、以下のように、標的組織として子葉を、選択マーカーとしてカナマイシン耐性を利用すして行った。キメラｋａｎ遺伝子をプラスミドｐＴＮＨ７、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）をコードするｐＵＣ１１８誘導体、カナマイシン抗生物質を酵素不活性化する酵素より誘導する。タバコ標的プラスミド( プラスミドｐＴＮＨ３２)中の同じキメラｋａｎ遺伝子をタバコ中のプラスチド形質転換体を直接選択するのに用いた(Carrerら、１９９３)。ｋａｎ遺伝子の構築は、当該文献にさらに詳細に記載されている。プラスミドｐＧＳ８５Ａは、ｋａｎをｐＴＮＨ７よりＳａｃＩ／ＰｓｔＩフラグメントとして切除し、平滑末端し、そのフラグメントをプラスミドｐＧＳ７のＨｉｎｃＩＩ部位にクローンすることにより得られた(図４)。ｐＧＳ８５Ａのｋａｎ遺伝子は、プラスミドｐＧＳ３１ＡのａａｄＡのように、Ｐｒｒｎ／ＴｐｓｂＡカセットにて発現する。しかし、高度に発現されたｒｂｃＬコーディング領域の５個のＮ−末端アミノ酸は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＮ−末端と翻訳融合した。タバコでのこの翻訳融合は、ｒｂｃＬＮ−末端セグメント不含の同一の構築物に由来するよりも１０倍高いレベルでＮＰＴＩＩの蓄積をもたらす。キメラｋａｎ遺伝子のＤＮＡ配列を含めｐＧＳ８５Ａの配列を本明細書中に示す。第１に、種子−セットを組織培養プロトコールにより再生植物にて試験した。その後、ＤＮＡ被覆のタングステンで爆撃を与えた後のカナマイシン耐性クローンの選択物を評価した。これらの該方法の改良は、受精能のある形質転換されたアラビドプシス植物の生成に適している。以下の材料およびプロトコールをこの実施例IIの方法を行うのに利用した。種子発芽アラビドプシス・サリアナ生態型ＲＬＤの種子を、市販の漂白剤（５％次亜塩素酸ナトリウム）を用いて５分間表面滅菌し、つづいて５分後、９５％エタノールで処理する。トリトンＸ−１００（１滴）をその漂白剤に加え、滅菌処理の期間、その種子の表面を湿らせた。滅菌処理後、種子を滅菌脱イオン水で５−６回洗浄した。１０ｃｍペトリ皿中のＧＭ培地上で種子を発芽させた。表２を参照のこと。パーシバル（Percival）増殖チャンバー中、２３℃で８ないし９日間、連続的照明の下、そのペトリ皿をインキュベートした。表２種子発芽（ＧＭ）培地の組成培地濃度（ｍｇ／Ｌ）ＭＳ基礎塩０.５Ｘミオイノシトール１００チアミン０.１ピリドキシン０.５ニコチン酸０.５グリシン２.０シュークロース３０ｇ／ＬｐＨ５.８文献： van der GraaffおよびHooykaas、１９９６組織培地および培養条件選択プロトコールの段階Ｉ、IIおよびIIIに用いた組織培地の組成を表２および３に列挙する。少なくとも５０ないし２０００個の子葉を、各々、約２０ｍｌの培地を含有する、ペトリ皿（１００ｍｍｘ２０ｍｍ）に無菌状態で移すことで段階ＩおよびIIの液体培養を確立した。そのペトリ皿をニューブランズウィックＧ１０旋回振盪器にて２３℃で６０ｒｐｍでインキュベートし、冷蛍光を１６時間照明した。段階IIIのプロトコールにて、寒天−固化(０.８％ＴＣ寒天、JRH Bioscience)培地上、５０ｍｌの培地中に約２５−３０個の子葉／ペトリ皿（１００ｍｍｘ２０ｍｍ）で子葉をインキュベートした。培養物を段階ＩおよびII に記載されているように照明した。再生植物を、ガス交換用の通気孔を設けたマゼンタ（Magenta）ボックスのＧＭ培地に直接移した。そのマゼンタボックス中の植物を、培養室中で２３℃でインキュベートし、冷蛍光で１６時間照明した。植物は、ボックス中で開花して種子を形成した。実施例Ｉについて記載されている方法を修飾し、形質転換されたプラスチドゲノムを有する受精能のあるアラビドシス植物を生成した。３つの異なる組織培養段階を利用してプラスチド形質転換を得た。段階Ｉ：均一な細胞分裂を促進するための高オーキシン培地の液体培養基。段階II：形質転換細胞から植物再生を誘発するための高サイトカイニン培地の液体培養基。段階III:さらに植物再生を誘発するための高レベルのサイトカイニンを含有する寒天−固化培地の培養基。受精能のあるプラスチド形質転換体を得るための最良のプロトコールを同定するために用いた方法の模式図を図３に示す。液体培養基中にて均一な細胞分裂を誘発するために、４種の培地、Ｃ１(van der GraaffおよびHooykaas、１９９６) 、ＡＲＭＩ(MartonおよびBrowse、１９９１)、Ｒ３およびＰＧ１（FeldmannおよびMarks、１９８６；アラビドプシスにてカルスおよび／または体細胞胚発生を誘発すると報告されている）を利用した。段階Ｉの処理を短期間（２日間）続け、通常のタイミングで爆撃後、外植片を選択培地に移し、使用するならば、２−４−Ｄの副作用を最小限とした。利用した段階Ｉの組織培養基の組成を以下の表３に列挙する。表３：段階Ｉの組織培養基の組成＊培地ＡＲＭＩＣ１Ｒ３ＰＧ１基礎塩ＭＳＭＳＭＳＭＳビタミンＡＲＭＩＢ５ＭＳＢ５２,４−Ｄ０.１５ − ０.５２.２ＢＡＰ０.６０.２ − − ＩＡＡ３.０ − ５.０ − ＩＰＡ０.３ − − − ＮＡＡ − １.０ − − ＫＩＮ − − ０.３０.０５シュークロース３０ｇ３０ｇ３０ｇ３０ｇｐＨ５.８５.８５.８５.８＊すべての成分はｍｇ／Ｌである。文献：ＡＲＭ１、MartonおよびBrowse、１９９１；Ｃ１、van der GraaffおよびHooykaas、１９９６；Ｒ３およびＰＧ１、FeldmannおよびMarks(１９８６)。段階IIの培養の場合、１種類だけの培地（Ａ；表４）を用いた。この培地は未成熟な子葉から植物再生を誘発するのに効果的であった(PattonおよびMeinke、１９８８)。子葉を段階IIに液体培養基中、高密度で合計でさらに６日間保持した。段階IIIの培養の場合、子葉を４種の寒天−固化の再生培地に移した。これらの培地は、未成熟胚からの植物再生を発生させるＡ培地(PattonおよびMeinke、１９８８)；根外植片から植物再生を発生させるＢ培地(ＡＲＭＩＩ；MartonおよびBrowse、１９９１)；本明細書にて設計したＣ培地；および根（ＡＲＭＩ；Mar tonおよびBrowse、１９９１）および葉（実施例Ｉ）外植片についての胚誘発培地であるＤ培地を含む。表４：段階IIおよび段階IIIの植物再生培地培地Ａ培地＊Ｂ培地＊Ｃ培地＊Ｄ培地＊基礎塩ＭＳＭＳＭＳＭＳビタミンＢ５Ｂ５Ｂ５Ｂ５ＮＡＡ０.１ − １.０ − ＩＡＡ − ０.１ − ３.０ＢＡＰ１.０ − １.００.６２ｉＰ − ４.０２.００.３２,４−Ｄ − − − ０.１５シュークロース３０ｇ３０ｇ３０ｇ３０ｇ寒天（ＴＣ）７ｇ７ｇ７ｇ７ｇｐＨ５.８５.８５.８５.８＊すべての成分はｍｇ／Ｌである。Ａ培地はPattonおよびMeinke、１９８８に基づく；Ｂ培地はMartonおよびBrowse、１９９１のＡＲＭＩＩと同じである；Ｃ培地はＡおよびＤ培地に基づいて本明細書で開発した培地である；Ｄ培地はMartonおよびBrowse、１９９１のＡＲＭＩ胚−誘発培地と同じである。植物再生および受精能試験４種のすべての培地における段階Ｉの培養の最初の２日間で、子葉は緑色のままであり、わずかに大きくなった。カルス／胚誘発培地にて２日経過した後、段階IIのために子葉を４種のすべての培地からＡ液体再生培地に移した。緑色カルスがＡ培地にて培養した３日経過後から出現し始め、７日目までに子葉全体にカルスが出現した。この段階で培養物を、胚／苗条の増殖を促進する段階IIIの半固体培地に移した。培地１（ＡＲＭ１）および２（Ｃ１）から由来のカルスは緑色であった。これらの外植片からの苗木の成長は、培養後２１日までに観察できた。培地３（Ｒ３）および４（ＰＧ１）から由来のカルスもまた、極めてコンパクトではあるが、緑色であった。これは、おそらく、段階Ｉ培地にて２,４−Ｄが高濃度であることによるものである。これらの培養基では２、３の苗木が３０日経過後にのみ現れた。すべての培養基からの植物を、大きさが５−１０ｍｍとなるとすぐに、ホルモン不含のＧＭ培地に移した。図３に示されるプロトコールを２つのレベル：細胞分裂および子葉からの苗条再生の均一な誘発；および再生植物の生存種子の生成で評価した。結果を表５で要約する。第１の基準に基づくと、最良の組合わせは２ＡＣ、すなわち、段階ＩでＣ１培地で、段階IIIでＣ培地のものであり、これらの処理は外植片の各々について観察される増殖性苗条をもたらした。第２の優れた組合わせは、段階ＩでＡＲＭ１を、段階IIIで培地Ｃを用いる、１ＡＣ（４０のうち３５の外植片が苗条を再生した）であった。段階Ｉでの培地３と４の組み合わせは、子葉のほんのわずかなフラクションだけで、苗条の形成はほとんどなかった。生存種子の形成に関する限りでは、一つを除いて、再生植物は、各々、生存種子を生成した。表５を参照のこと。最も重要なこととして、２つの組み合わせ（２ＡＣと１ＡＣ）で、受精能に関して副作用は何ら観察されず、その苗条再生は豊かであった。表５図３に模式的に示されたプラスチド形質転換プロトコールを介して再生されたアラビドプシス・サリアナＲＬＤ植物に関するマゼンタボックス中の種子−セット培地培養された苗条を有すボックス中生存可能な子葉の数る子葉の数の植物の数種子の数１ＡＡ４０２０８８１ＡＢ４０２５８８１ＡＣ４０３５８８１ＡＤ４０ − − − ２ＡＡ４０２５１２１２２ＡＢ４０２２８７２ＡＣ４０４０１６１６２ＡＤ４０２ − − ３ＡＡ４０１２４４３ＡＢ４０６４４３ＡＣ４０２０ − − ３ＡＤ４０１ − − ４ＡＡ４０１ − − ４ＡＢ４０１ − − ４ＡＣ４０４４４４ＡＤ４０１ − １カナマイシン耐性によるプラスチド形質転換体の選択ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）をコードするｋａｎの発現は、アラビドプシス核に導入されると、カナマイシンに対する耐性を付与する。ｋａｎを操作した形態は、アラビドプシス（Valvekensら、１９８８を参照のこと）およびブラシカ（Radkeら、１９９２を参照のこと）の核形質転換体を得るのに広く用いられる。ｋａｎ遺伝子はタバコにおけるプラスチド形質転換体を選択するためにプラスチドマーカーに変換される(Carrerら、１９９３)。実施例Ｉに示されるように、アラビドプシスプラスチド形質転換体は、タバコのＰｒｒｎ／ＴｐｓｂＡカセットのａａｄＡにより得られるスペクチノマイシン耐性について選択することにより得られる。ＰｒｒｎはプラスチドｒＲＮＡオペロンから誘導されるプロモーターであり、ＴｐｓｂＡはキメラプラスチドｍＲＮＡの安定性のために要求されるプラスチドｐｓｂＡ遺伝子の３’非翻訳領域を有する(Svab およびMaliga、１９９３)。プラスチド形質転換体を選択するのに適当なカナマイシン耐性マーカー遺伝子は、ｋａｎをＰｒｒｎ／ＴｐｓｂＡカセットにて発現させることにより得ることができる。アラビドプシンおよびブラシカからの適当なカナマイシン耐性プラスチド形質転換ベクターは、プラスチドｐＴＮＨ３２からのキメラカナマイシン遺伝子を有するｐＧＳ８５Ａベクターである(Carrerら、１９９３)。ｐＧＳ８５Ａにおける挿入部位はｔｒｎＶ／ｒｐｓ１２／７遺伝子間領域のＨｉｎｃＩＩ部位である。しかしながら、プラスチドゲノムの他の遺伝子間領域を、導入されたトランス遺伝子がフランキングプラスチド遺伝子の発現を干渉しないことを条件として、標的とすることができる。プラスチド形質転換は、前記した１ＡＣまたは２ＡＣ組織培養プロトコールの後に行うことができる。形質転換するための適当な標的組織を調製するために、８−９日齢の苗木の子葉を、液体ＡＲＭ１およびＣ１培地中の苗木から切断し、１ＡＣおよび２ＡＣプロトコールで示されるように２日間培養した(図３)。２日経過した後、その子葉を同一組成の寒天−固化した非選択性培地上の濾紙（What man No.４）に移す。３ｃｍ²の領域を覆うのに、約５０ないし７０個の子葉が必要である。ついで、その子葉をプラスチドｐＧＳ８５Ａで爆撃し、カナマイシン耐性に付し、アラビドプシンベクターを形質転換する。プラスミド調製、タングステン粒子の被覆および爆撃はタバコについて記載されているように実施した(M aliga、１９９５)。表現型を発現させる場合、子葉を同じプレートに２日間放置する。その後、該子葉を５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンを含有する選択性液体Ａ培地に移し、さらに７日間培養する。７日後、子葉を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する選択性寒天−固化のＣ培地に移す。別の具体例においては、最初に２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを用いて選択を行ってもよい。培養の後期の段階で、カナマイシン濃度を５０ｍｇ／ｍｌに上昇させる。選択性培地上の形質転換細胞からのカルス増殖は１週間と早期に観察することができる。しかしながら、別のカナマイシン耐性クローンは出現に数週間またはそれ以上を要するかもしれない。これらの幾つかはプラスチド形質転換体であるのに対して、その他は、核中にプラスチドｋａｎ遺伝子を発現するため、カナマイシンに対する耐性を獲得する(Carrerら、１９９３)。２種類のカナマイシン耐性クローンは、（実施例Ｉに記載されているように）ＤＮＡゲルブロット分析およびＰＣＲ分析により容易に区別することができる。標準プロトコールに従ってＤＮＡを増殖させた(９２℃で１分間、５８℃で１.５分間、７２℃で１.５分間、９０サイクル) 。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が発現した結果、カナマイシン耐性が生じ、それは以下のプライマーを用いて５４８個のヌクレオチド内部セグメントをＰＣＲ増幅することで立証できる：５’−ＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣ−３’ ５’−ＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＧ−３’ 実施例III スペクチノマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を選択することによるブラシカ・ナプス葉におけるプラスチド形質転換本質的に同一のゲノムを得るならば、アラビドプシスについて開発したプラスチド形質転換ベクターおよび発現カセットを用いて、修飾することなく、ブラシカ種におけるプラスチド形質転換および異種遺伝子の発現に供することができる。進化論的に遠い種類から由来する特定のプラスチド発現シグナルが、アラビドプシスおよびブラシカプラスチドにて機能する。この観察は、実施例Ｉに記載する、タバコのＰｒｒｎ／ＴｐｓｂＡカセットがアラビドプシスプラスチドにて選択可能なスペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）を発現させるのに用いることができることを示す、結果により支持されている。しかし、すべてのタバコ発現シグナルがアラビドプシスにて適当に機能するわけではない。終止シグナルＴｐｓｂＡをシグナルＴｒｐｓ１６と置き換えることを除いて、ＰＧＳ３１Ａと同一のベクターを用いる実験は、プラスチド形質転換体を得ることに劇的な効果を有する。このプラスチド遺伝子は、Ｐｒｒｎ／Ｔｒｐｓ１６カセットをＰＧＳ７ベクター中の標的部位に挿入することにより得られる。図４を参照のこと。このプラスチドで爆撃した４１６個のサンプルで、プラスチド形質転換体は全く得られなかった。前記したように、Ｐｒｒｎ／ＴｐｓｂＡカセット（StaubおよびMal iga、Plant Journal ６：５４７−５５３、１９９４ならびにSvabおよびMaliga 、１９９３に記載のカセット、その内容を出典明示により本明細書の一部とする）を利用して、アラビドプシス葉を形質転換した場合、爆撃した２１０個のサンプルのうち２個で、プラスチド形質転換体が得られた。分類上同類であるため、アラビドプシスとブラシカ種は、組織培養において、植物ホルモンまたは抗生物質に対して同様に応答する。その結果、培養細胞からの植物再生および抗生物質耐性によるトランスジェニック系統の選択は、本質的に同じプロトコールで達成することができる。アラビドプシスおよびブラシカの両方の葉または子葉外植片は、表６に示す苗条再生培地、例えば培地Ｃ上の野生型の形質転換していない組織にて豊かにカルス増殖しながら５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンに対して応答する。この応答は、５００ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンへの暴露が苗条誘発培地上でのカルス増殖の強い阻害をもたらす、タバコの葉組織とは有意に異なっている。すなわち、タバコプラスチド（および核遺伝子）形質転換体は、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン含有の苗条誘発培地で容易に再生することができる(SvabおよびMaligam、１９９３)。残念ながら、スペクチノマイシン含有のＣ苗条／胚再生培地上での迅速なカルス増殖は(表６を参照のこと)、アラビドプシスおよびブラシカプラスミド形質転換体の回収を妨げる。培養条件を改良し、迅速なカルス増殖を抑制し、プラスチド形質転換体の回収を促進しなければならない。かかる条件は実施例Ｉに示されている。選択は可能であり、プラスチド形質転換体は実施例Ｉの方法を用いて得られたが、再生されたトランスプラストム植物は受精能がなかった。しかしながら、ブラシカの２,４−Ｄに対する耐性を高めたならば(Radkeら、１９９２)、実施例Ｉに記載の同じプロトコールをブラシカにおける使用に適用することができる。実施例IIに表されるデータは、カナマイシン選択が前記の再生プロトコールで他花受容が容易であることを示す。したがって、カナマイシンが、クルシフェラエ（Cruciferae）分類群中のプラスチド形質転換体を選択するための好ましい抗生物質である。実施例ＩおよびIIは、アラビドプシスの葉および子葉からトランスジェニック植物を再生するためのプロトコールを開示する。ブラシカでのトランスジェニック植物を再生するためのプロトコールは、葉については２段階プロトコール（２種の異なる培地の使用）および子葉については３段階プロトコール（３種の異なる培地を使用）からなる。実施例IIにおけるアラビドプシス子葉のプラスチド形質転換における使用のために記載されている３段階プロトコールが、ブラシカでの使用に適している。したがって、２段階工程にてブラシカ葉プラスチドを形質転換する方法だけを以下に記載する。標的組織として葉を、選択マーカーとしてカナマイシン耐性を用いるブラシカにおけるプラスチド形質転換ブラシカの段階Ｉの培養は、葉または子葉において細胞分裂を均一に誘発させる。段階IIの目的は、トランスジェニック植物の再生である。細胞分裂を誘発するための適当な段階Ｉ培地は実施例ＩおよびIIに記載されているＡＲＭＩ培地であろう。適当な段階II再生培地は、表６に列挙されている、Ｂ培地(ＡＲＭＩＩ、MartonおよびBrowse、１９９１)、Ｃ培地(この実験)およびＥ培地(Pelletier ら、１９８３)であろう。表６段階IIのブラシカ植物再生培地＊培地Ｂ培地Ｃ培地Ｅ培地基礎塩ＭＳＭＳＭＳビタミンＢ５Ｂ５Ｂ５ＮＲＲ − ０.１１.０ＩＡＡ０.１ − − ＢＡＰ − １.０ − ２ｉＰ４.０２.０１.０ＧＡ３ − − ０.０２シュークロース３０ｇ３０ｇ３０ｇ寒天（ＴＣ）７ｇ７ｇ７ｇｐＨ５.８５.８５.８＊成分はすべてｍｇ／Ｌである。Ｂ培地はMartonおよびBrowse、１９９１のＡＲＭＩＩと同じであり；Ｃ培地はこの実験の使用培地であり；Ｅ培地はPell etierら、１９８３のクルシフェラエ再生培地である。プラスチド形質転換体を選択する場合、実施例IIにてアラビドプシスについて記載されているように、ブラシカ・ナプスｃｖ．ウェスター種子を表面滅菌し、マゼンタボックスにて無菌状態で発芽させる。３ないし４週間後、葉を収穫して、寒天−固化の非選択性段階Ｉ培地上に置いたWhatman濾紙に直接配置する。実施例IIに記載されているように、選択可能なカナマイシン耐性マーカーを有する適当なプラスチド形質転換ベクターのＤＮＡで爆撃した後、プレートを２５℃で光源（１６時間）の下で２日間インキュベートする。２日後、多くの滅菌処理したカミソリ刃で切り込み、５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンを補足した同一の段階Ｉ培地に移した。別の具体例において、最初に２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを用いて選択を行ってもよい。培養の後期の段階で、カナマイシン濃度を５０ｍｇ／ｍｌに上昇させる。選択性段階Ｉ培地上で２週間経過した後、植物再生用の段階II培地の一つに葉を移す。カナマイシン耐性クローンをその迅速な増殖および選択培地上での苗条再生により同定する。カナマイシン耐性はプラスミド形質転換またはカナマイシンマーカー遺伝子の核ゲノムへの組み込みによるかもしれない。プラスミド形質転換は、カナマイシン耐性カルスおよび再生している苗条より採取した組織サンプルをＰＣＲおよびＤＮＡゲルブロット分析に付すことにより確認される。ついで、標準プロトコールに従って、再生した苗条を根づかせて温室の土壌に移す。本発明の特定の好ましい具体例を上記して詳細に例示したが、本発明はかかる具体例に限定されない。以下の請求の範囲に示される、本発明の範囲および精神から離れることなく、様々な修飾が本発明になされるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者シクダル，サミル・アールインド712101ウエスト・ベンガル、ディストリクト・フーリー、ナワバガン・ビーオー・チンスラー711番 (72)発明者レディ，シバ・バンガインド110070ニューデリー70、バーサント・クンジ・ビー１／1160番

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスプラストム植物を得るための方法であって、ａ）植物からの植物細胞を均一な細胞分化を促進する薬剤の存在下で培養し；ｂ）該植物細胞を寒天固化培地上の濾紙に移し；ｃ）該植物細胞内のプラスチドゲノムに、形質転換ＤＮＡをデリバリーし、ここで該形質転換ＤＮＡ分子は：ｉ）形質転換されるプラスチドゲノムからのプラスチドＤＮＡ配列からなる複数の標的セグメント(該標的セグメントは該形質転換ＤＮＡの該プラスチドゲノムへの相同組換えを促進する)；ｉｉ）該標的セグメント内に配置される選択マーカー遺伝子に作動的に連結したプラスチドＤＮＡ由来の５’および３’調節配列(該調節配列は、選択マーカー遺伝子の発現およびそれによりコードされるｍＲＮＡの安定性を促進し、該選択マーカー遺伝子は、該植物細胞に抗生物質耐性を与える)；ｉｉｉ）目的とする外来遺伝子をコードする配列に作動的に連結したプラスチドＤＮＡ由来の５’および３’調節配列（これにより目的とする外来遺伝子の発現およびそれによりコードされるｍＲＮＡの安定性を促進する）ｉｖ）該選択マーカー遺伝子に隣接した目的とする外来遺伝子を挿入するための少なくとも１つのクローニング部位（該挿入は、該選択表現型の付与および隣接するプラスチド遺伝子の機能を妨げない）を有する；ｄ）工程ｃ）において形質転換された細胞を所定の期間、高密度で培養倍地中に移し(該培養基は連続する均一な細胞分裂および植物再生を促進する薬剤を含む) ；ｅ）工程ｄ）において処理した細胞を再生促進剤および抗生物質を含む寒天固化培養基に移し(該形質転換細胞は、選択マーカー遺伝子の発現により該抗生物質に対して耐性となっている)；ｆ）形質転換されたプラスチドゲノムを有し、植物再生を誘導する細胞を選択することを含む方法。２．形質転換ＤＮＡが、ＤＮＡ−被覆粒子による該細胞のバイオリスチック爆撃、ＣａＰＯ₄媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびポリエチレングリコール媒介ＤＮＡ取り込みからなる群から選択される方法によりデリバリーされる、請求項１記載の方法。３．植物細胞が、子葉細胞、葉細胞、胚軸および根細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。４．選択マーカー遺伝子および目的とする外来遺伝子がモノシストロン性発現単位を構成する、請求項１記載の方法。５．選択マーカー遺伝子および目的とする外来遺伝子がポリシストロン性発現単位を構成する、請求項１記載の方法。６．プラスチドがクロロプラストである、請求項１記載の方法。７．抗生物質が、カナマイシン、スペクチノマイシン、およびストレプトマイシンからなる群から選択される、請求項１記載の方法。８．均一な細胞分化を促進する薬剤が、ＮＡＡ、ＩＡＡおよび２，４−Ｄからなる群から選択される、請求項１記載の方法。９．再生促進剤が、ＢＡＰ、２１Ｐ、ＩＰＡおよびＫＩＮからなる群から選択される、請求項１記載の方法。１０．形質転換ＤＮＡがベクターｐＧＳ３１Ａ中にクローニングされる、請求項１記載の方法。１１．形質転換ＤＮＡがベクターｐＧＳ８５Ａ中にクローニングされる、請求項１記載の方法。１２．形質転換ＤＮＡがベクターｐＧＳ７中にクローニングされる、請求項１記載の方法。１３．植物がアラビドプシス・サリアナである、請求項１記載の方法。１４．植物がブラシカ・ナプスである、請求項１記載の方法。