HU218465B - Eljárások és kompozíciók stabilan transzformált, termő egyszikű növények és sejtjeik előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány reprodukálható rendszerre vonatkozik stabil, genetikailagtranszformált kukoricasejtek előállítására, továbbá eljárásravonatkozik a transzformált sejtek szelektálására. A szelekció egyikismertetett eljárásában a Streptomyces bar gént alkalmazzák,mikrolövedékes bombázással bejuttatva az embriogén kukoricasejtekbe,amelyeket azután szuszpenziós tápközegben növesztenek, ezután pedig abialafoszherbicid hatásának teszik ki. Az itt ismertetett eljárás,amellyel stabil transzformálást érnek el, magában foglal eljárásokatbefogadósejtek bombázására a kívánt transzformáló DNS-sel, valamintmagában foglal eljárásokat termő növények növesztésére a transzformáltsejtekből. A találmány foglalkozik a transzformált sejtekkel ésmagokkal, valamint a transzformált sejtekből és pollenekből kinőtttermő növényekkel. ŕ

Description

A találmány eljárás termő, transzgenikus kukoricanövények előállítására a kukorica sejtjeinek mikrolövedékes bombázása és a növényeknek az így transzformált sejtekből történő regenerálása útján. Az eljárás alkalmazható exogén nukleinsavak bevezetésére sejtekbe, valamint szelektálható és/vagy átvizsgálható markerrendszerek bevezetése, például olyan géneké, amelyek rezisztenciát adnak át (például antibiotikum-, herbicidstb. rezisztenciát), vagy olyan géneké, amelyek fenotípusosan megfigyelhető jellemvonásokat tartalmaznak. Egy másik szempontja szerint a találmány stabilan transzformált és termő egyszikű növények, gaméták és utódok előállításával foglalkozik a transzgenikus növényekből.

Amióta az emberi faj kilépett történelmének gyűjtögető-vadászó szakaszából és belépett földművelő szakaszába, az emberi találékonyság és ötletesség fő célja a termésátlagok javítása és a növények tulajdonságainak megváltoztatása és megjavítása. Ezen belül elsősorban azokat a lehetőségeket keresik, amelyek segítségével úgy változtatják meg a növények jellemzőit, hogy legyenek ízletesebbek és/vagy táplálóbbak és adjanak magasabb termésátlagokat, és amelyek segítségével a növények jobban alkalmazkodnak a speciális körülményekhez.

Egészen a legutóbbi időkig a termés és a növény javítása a kívánt tulajdonságokkal bíró növények szelektív nemesítésére támaszkodott. Az első nemesitől siker bizonyára véletlenen alapult valamely kívánt tulajdonságú növény megfigyeléséből és ennek a növénynek a szaporításából a következő generációban. Mivel azonban az ilyen növények heterogén genetikai állományt foglalnak magukban, nem valószínű, hogy a kívánt jellemvonásokkal bíró szülőkkel azonos utódok bukkannak fel. A szabályozott nemesítésben mégis jelentős előrelépés történt, amely részben az átöröklés menetében működő mechanizmus fokozatosan növekvő megismerésének, részben a különböző szülőnövények keresztezéséből származó eredmények megfigyelésének tulajdonítható.

A legutóbbi idők fejlődése a molekuláris biológiában drámai módon megnövelte az emberiség lehetőségeit, hogy manipulálják az állatok és növények csíraplazmáit. A speciális fenotípusokat, például az olyan polipeptideket, amelyek antibiotikum- vagy herbicidrezisztenciát kölcsönöznek, szabályozó géneket lokalizálták bizonyos csíraplazmákon belül és izolálták azokból. Még fontosabb az a képesség, hogy az egyik organizmusból izolált géneket már be lehet vezetni másik organizmusba. Ezt a transzformálást még akkor is végre lehet hajtani, amikor a befogadóorganizmus más törzsbe, nemzetségbe vagy fajba tartozik, mint az az organizmus, amely a gént szolgáltatja (heterogén transzformálás).

Kísérleteket tettek arra, hogy genetikailag építsenek be kívánt jellemvonásokat növényi genomokba exogén gének bevezetésével, genetikai manipulációs technikák alkalmazásával. Ezeket a technikákat bizonyos növényi rendszerekben, elsősorban kétszikű növényeknél sikeresen alkalmazták. Az új DNS-szakasz felvétele a befogadó növényi sejtek részéről különböző módokon mehet végbe, ideértve az Agrobacterium-fertőzést (32.), a polietilénglikol (PEG) által közvetített DNS-felvételt (25.), a protoplasztok elektroporációját (17.) és a mikrolövedékes bombázást. Sajnos az exogén DNS bevezetése az egyszikű növényekbe és a transzformált növények ezt követő regenerálása sokkal nehezebbnek bizonyult, mint a transzformálás és regenerálás a kétszikű növényeknél. Ezenkívül a kukorica transzformálására szolgáló eljárásokról és a termő kukoricanövények ezt követő előállításáról nemigen jelentek meg közlemények. Ebből az következik, hogy ezen a területen nem értek el sikert, és a transzformálás mindennapos kivitelezését transzgenikus termő növények előállításával nem valósították meg. Ez a hiányosság különösen sajnálatos kukorica esetében, ahol igen nagy az igény a genetikai jellemzők javítására szolgáló eljárásokra.

A genetikailag transzformált egyszikű növényfajták kifejlesztésében a problémák sokféle területen jelentkeznek. így például általában hiányoznak azok az eljárások, amelyek lehetővé teszik, hogy nukleinsavakat vezessenek be a sejtekbe, hatékonyan végezzenek sejttenyésztést, végül regeneráljanak termő növényeket. Csak mérsékelt sikereket hoztak nyilvánosságra ezen a téren. Rizsnél például DNS-átvitelról csak a legutóbbi időkben számoltak be protoplasztelektroporáció alkalmazásával, majd a transzgenikus növények ezt követő regenerálásával (41.). Beszámoltak ezenkívül transzformálásról kukoricánál is, protoplasztelektroporáció alkalmazásával (lásd például 17.).

A stabilan transzformált növények nyerése azonban nem volt reprodukálható. Különösen súlyos hiány az, hogy kukorica esetében néhány kialakított transzgenikus növény nem termő (38.). Bár beszámoltak termő kukoricanövény regenerálásáról (37., 39.), ezek a leírt eljárások nem transzformált protoplasztok alkalmazására korlátozódtak. Ezenkívül a növények regenerálása protoplasztokból olyan technika, amely jelentős hátrányokat hordoz magában. Bár élénk erőfeszítéseket tettek, hogy termő, transzformált kukoricanövényekhez jussanak, ezen a téren sikeres beszámolók nem állnak rendelkezésre.

Az a transzformációs technika, amely kiküszöböli a protoplasztok alkalmazásának szükségességét, a mikrolövedékes bombázás. Bár egy riportergén átmeneti kifejeződését kimutatták bombázott dohánypollenben (47), pollen mikrolövedékes bombázásával végzett transzformálásról még nem számoltak be egyetlen növényfajnál sem. A szójacsúcs-merisztémák bombázása DNS-sel burkolt aranyrészecskékkel olyan kiméra növényeket eredményezett, amelyek tartalmaznak transzgenikus szektorokat. A bevezetett gént tartalmazó utódokat csak kis gyakorisággal kapják meg (27.). Az éretlen kukoricaembriók sarjmerisztémáinak bombázása olyan szövetszektorokat eredményez, amelyek antocianin látható markért fejeznek ki: ennek szintézisét egy szabályozógép bevezetése indítja be. Ennek az eljárásnak a végén azonban termő kukoricanövény nem született (46.). A sejteredetminták elemzése kukoricában (28.) azt sugallja, hogy a kukoricacsíra-vonal transzformálása ilyen megközelítéssel nehéz lehet.

HU 218 465 Β

Az EP 290 395 számú európai szabadalmi irat transzformációs eljárással foglalkozik, amelyet növényi sejtbe való bevitelt permeabilitást fokozó szer és elektromos áram segítségével hajt végre. A transzformálásra szánt DNS-szakasz bevitelének sikeressége azonban nem megfelelően bizonyított, életképes transzgenikus kukoricanövény kifejlesztése nem történt meg ezzel az eljárással.

A sikeres egyszikű transzformálás elérésében második fő gond a hatékony markergénrendszer hiányának eredménye; ezt arra kellene alkalmazni, hogy azonosíthassanak stabilan transzformált sejteket. A markergénrendszerek azok, amelyek lehetővé teszik a DNS kifejezési termékeinek szelekcióját és/vagy átvizsgálását. A transzformáit sejtekben való vizsgálathoz a szelektálható és átvizsgálható termékeknek olyannak kell lenniük, amelyek a befogadósejtekbe bevezetett genetikai konstrukciókból erednek. Ennek megfelelően az ilyen markergéneket alkalmazhatjuk stabil transzformánsok azonosítására.

A legáltalánosabban alkalmazott markergénrendszerek azok a génrendszerek, amelyek rezisztenciát adnak át aminoglükozidokra, például kanamicinre. Bár a kanamicinrezisztenciát sikeresen alkalmazták mind rizsnél (5.), mind kukoricaprotoplaszt-rendszereknél (39.), továbbra is nagyon nehéz szelektív eszköz marad az egyszikűekben való felhasználáshoz a nagy endogén ellenállás következtében (19.). Sok egyszikű növény, különösen a kukorica, aminoglükozidokra magas szintű endogén ellenállást mutat. Ebből következően a vegyületeknek ez az osztályát nem lehet reprodukálhatóan alkalmazni a transzformált szövetek megkülönböztetésére a nem transzformált szövetektől. Ezért szükség van új eljárásokra a transzformált növényi sejtek reprodukálható szelektálására vagy átvizsgálására.

A fentiekből következik, hogy javított eljárások és/vagy megközelítések az egyszikű fajok genetikai transzformálásához nagy fejlődést jelentenének a szakterületen. Különösen annak lenne nagy jelentősége, ha olyan új megközelítéseket nyújtanánk az egyszikű-transzformációhoz, főleg a kukoricasejtek transzformálásához, amelyek lehetővé tennék stabilan transzformált, termő kukoricanövények és utódok előállítását, amelyekbe a kívánt külső gének be vannak vezetve. Ezenkívül az egyszikű rendszerekhez, például kukoricához alkalmazható markergénrendszerek hasznos eszközt nyújtanának az ilyen technikák alkalmazásához általában. így ezeknek és más technikáknak a kifejlesztése genetikailag stabilan transzformáit kukorica előállítására forradalmasíthatná a szemléleteket a kukorica nemesítéséhez.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A találmány feladata, hogy a szakterületen ismert hiányosságok közül egyet vagy többet kiküszöböljön olyan módon, hogy eljárásokat és kompozíciókat nyújt stabilan transzformált kukoriasejtek előállításához, majd ezt követően a termő, transzgenikus kukorica és utódok regenerálásához.

Ennek megfelelően a találmány elsődleges tárgya, hogy olyan technikákat nyújtson, amelyek lehetővé teszik transzgenikus, termő kukorica előállítását, amelyek előnyösen diploidok, és amelyek stabilan vannak transzformálva genomjaikba valamely kívánt gén bevezetése révén.

A találmány így általában vonatkozik transzgenikus kukorica előállítására. Ahogy itt használjuk, a „transzgenikus növény” kifejezés olyan növényekre utal, amelyek exogén géneket vagy DNS-szekvenciákat építettek be, beleértve - de nemcsak ezekre korlátozva azokat a géneket vagy DNS-szekvenciákat, amelyek esetleg normálisan nincsenek jelen, azokat a géneket, amelyek normálisan nem íródnak át és nem transzformálódnak (vagyis nem „fejeződnek ki” egy adott sejttípusban), vagy olyan más géneket vagy DNS-szekvenciákat, amelyeket be kívánunk vezetni a nem transzformáit növényekbe, például olyan géneket, amelyek normálisan jelen lehetnek a nem transzformált növényben, de amelyektől azt kívánjuk, hogy kifejeződésük megváltozzék.

Példaként szolgálhatnak a bevezetett génekre például más fajokból való DNS-szekvenciák vagy gének, vagy akár olyan gének is, amelyek azonos fajból erednek vagy azonos fajban vannak jelen, de a befogadósejtekbe genetikai manipulációs eljárásokkal vannak beépítve és nem a nemesítési technikák klasszikus reprodukciójával. Az „exogén” kifejezés viszont szándékunk szerint olyan génekre utal, amelyek normálisan nincsenek jelen a transzformálandó sejtekben, vagy egyszerűen nem olyan formában, szerkezetben stb. vannak jelen, mint ahogyan a transzformáló DNS-szegmensben találhatók, továbbá olyan génekre utal, amelyek ugyan normálisan is jelen vannak, de bevezetésük mégis kívánatos, hogy többletkifejeződést éljünk el. így az „exogén gén” vagy „exogén DNS” olyan génre vagy DNSszegmensre utal, amely be van vezetve valamely befogadósejtbe, tekintet nélkül arra, hogy van-e más hasonló gén jelen egy ilyen sejtben vagy nincs.

A termő transzgenikus növények előállításában a kiindulási lépés valamely DNS-kompozíció, például vektor, plazmid, lineáris DNS-fragmentum stb. beszerzése, amelynek egy komponensét be akaijuk vinni a befogadó kukoricasejtekbe. Az ilyen sejtek transzformálásához felhasznált DNS-szegmensek általában természetesen tartalmazzák azt a gént vagy azokat a géneket, amelyeket be kívánunk vezetni a sejtekbe. Ezek a gének kívánt esetben tartalmazhatnak még olyan szerkezeteket is, mint promotorok, fokozok, polilinkerek vagy további szabályozógének.

A vektorok, amelyeket a jelen találmány gyakorlatában alkalmazhatunk, megalkotása általában a szakterületen való jártasság keretében van (lásd általában a 79. és 80. referenciát). Az előnyös konstrukciók általában valamely növényi promotort foglalnak magukban, mint például a CaMV 35S promotort (68.) vagy másokat, például a CaMV 19S (69.), nos (70.), Adh (71.) és szacharóz szintáz (72.) promotorokat, az R gén-komplexszel társult promotorokat (5.), vagy a szövetfajlagos promotorokat, mint például a gyökérsejtpromotorokat (73.) és szövetfajlagos fokozókat (74.). A konstrukciók magukban foglalják a szóban forgó géneket a 3’-véggel együtt, mint például a Tr7 vagy nos (75.), vagy hasonló géneket. Ha szükséges, szabályozóelemek is lehetnek a konstrukcióban, mint például az Adh intron 1 (76.), a szacharóz szintáz intron (77.) vagy a TMV omega-elem (78).

HU 218 465 Β

Bizonyos elemek akkor nyernek hasznosítást, amikor beépülnek a genomba anélkül, hogy kifejezhető génekkel társulnának. így például a transzpozonok, mint az Ac, Ds vagy Mu olyan elemek, amelyek beiktatódhatnak a génekbe és instabil mutációkat okozhatnak. Ez az instabilitás nyilvánvalóan az elem kimetszése miatt alakul ki a mutáns lókuszból a növény vagy a mag fejlődése során. A transzpozonelemek alkalmazását bemutató áttekintő irodalmi helyek például az 56. és 57. Ezeket az elemeket, főleg az Ac-t abból a célból vezethetjük be, hogy inaktiváljunk (vagy aktiváljunk) és ezáltal „megragadjunk” egy adott jellemvonást. Amikor megragadtuk, az ezzel a jellemvonással bíró gént klónozhatjuk, például a transzpozonszekvencia alkalmazásával PCR-primerként a PCR-gén-klónozó technikákkal együtt (58., 59.). Miután azonosítottuk, az adott jellemvonáshoz tartozó teljes gént (vagy géneket) izolálhatjuk, klónozhatjuk és manipulálhatjuk, amennyiben az újrabevezetés előtt szükséges.

A befogadósejtek kialakítása és alkalmazása - úgy véljük - a találmány egyik fontos szempontja. Ahogyan itt alkalmazzuk, a „befogadósejt” kifejezés azokra a kukoricasejtekre utal, amelyek fogékonyak a transzformálásra és az ezt követő regenerálásra stabilan transzformált, termő kukoricanövényekké. A találmány feltalálói azt látják valószínűnek, hogy nem minden, a sejtpopulációban jelen lévő sejt, amely transzformálási eseményen megy keresztül, lesz „befogadó”-ja a sikeres transzformálásnak és regenerálásnak. Inkább az látszik valószínűnek, hogy az itt leírt technikák segítségével képesek lehetünk olyan populációkat létrehozni, amelyek megfelelő számú befogadósejtet tartalmaznak, hogy létrejöjjön a sikeres, stabil transzformálás és regenerálás.

Leírunk bizonyos technikákat, amelyekkel a befogadósejtek feldúsíthatok. így például úgy véljük, hogy a II. típusú kallusz kifejlesztése, amelyet manuális szelekció és a morzsalékos embriogén szövet tenyésztése követ, dúsítást eredményez a befogadósejtekben. A szuszpenziós tenyésztés, különösen az 1. táblázatban bemutatott tápközegek alkalmazásával, szintén javíthatja a befogadó- és nembefogadó sejtek arányát bármely adott populációban.

A DNS-t befogadósejtek előfordulási gyakorisága kicsinynek vélhető. Ezenkívül nagyon valószínű, hogy nem minden, DNS-szegmenseket befogadósejt eredményez transzformált sejteket, amelyekben a DNS stabilan integrálódik a növényi genomba és/vagy kifejeződik. Sok esetben kimutathatók csak kiindulási és átmeneti génkifejeződések. Feltételezhető azonban, hogy bizonyos sejtek gyakorlatilag minden egyszikű fajban stabilan transzformálhatok az itt leírt technikák alkalmazásának segítségével.

A kukoricát illetően a találmány feltalálói úgy vélik, hogy a legtöbb találmány szerinti technika alkalmazható kukoricafajtákhoz általában, legyenek ezek akár beltenyésztett, akár elit beltenyésztett, akár hibrid fajták. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy valamely adott fajtából vagy keresztezésből kifejlesztett sejtvonalak közül nem mutatja mindegyik szükségszerűen a stabil transzformálhatóság azonos mértékét. így például ebben a találmányban példaként az Α188χΒ73 sejtvonalakat hozzuk fel, amelyek standard technikákkal lettek kifejlesztve egy A188xB73 keresztezésből. Az SC716-nak és SC82-nek nevezett vonalak olyan sejtvonalakra példák, amelyek A188xB73 keresztezésekből lettek kifejlesztve, amint ezt a későbbiekben leírjuk. Sok más, ugyanebből a keresztezésből kifejlesztett sejtvonal nem bizonyul stabilan transzformálhatónak. így a stabil transzformálhatóság nem azonnal nyilvánvaló néhány vonalnál, még azonos keresztezésből valóknál sem. A mintegy 12 A188xB73 vonalból 2 bizonyul stabilan transzformálhatónak és alakít ki termő transzgenikus növényeket; ez a vonalak mintegy 16%-a. így ahol egy adott keresztezés vagy fajta transzformálásait kell elkészíteni, általában kívánatos több sejtvonalat kifejleszteni az adott keresztezésből vagy fajtából (például 8- 10-et), és mindezeket az így kifejlesztett vonalakat alá kell vetni a transzformációs munkamenetnek.

Abból a célból, hogy a transzformánsok azonosításának lehetőségeit javítsuk, kívánatos lehet szelektálható vagy átvizsgálható markergéneket alkalmazni kifejezhető génként vagy azonkívül. A markergének olyan fenotípusokat kódolnak, amelyek lehetővé teszik, hogy azok a sejtek, amelyek kifejezik a markergént, megkülönböztethetők legyenek azoktól a sejtektől, amelyek nem rendelkeznek ezzel a markerrel. Az ilyen gének szelektálható vagy átvizsgálható markert kódolhatnak, attól függően, hogy a marker olyan jellemvonást ad át, amelynek alapján kémiai eszközökkel, például szelektív szerek (mint herbicidek, antibiotikumok vagy hasonlók) alkalmazásával a sejtek szelektálhatok, vagy ez a marker egyszerűen olyan jellemvonás, amely megfigyeléssel vagy vizsgálattal vizsgálható (például lókuszjellemvonás). Az alkalmas génekre természetesen sok példa ismeretes a szakterületen és alkalmazható a találmány gyakorlati kivitelezésében.

A találmánnyal kapcsolatban való felhasználásra lehetséges szelektálható markerek közt találjuk - a korlátozás szándéka nélkül - a neo gént (82.), amely a kanamicinrezisztenciát kódolja, és kanamicin G418 stb. alkalmazásával szelektálható; a bar gént, amely a bialafoszrezisztenciát kódolja; a mutáns EPSP szintáz gént (67.), amely a glifozátrezisztenciát kódolja; egy nitrilázgént, amely rezisztenciát ad át bromoxilinre (83.); a mutáns acetolaktát szintáz gént (ALS), amely imidazolinon- vagy szulfonil-karbamid-rezisztenciát ad át (60.), vagy a metotrexátrezisztens DHFR-gént (61.). Amikor mutáns EPSP szintáz gént alkalmazunk, további előnyök realizálhatók egy megfelelő kloroplaszt tranzitpeptid (CTP; 62. referencia) beépítésével.

A példaszerűen felhozható átvizsgálható markerek között találjuk a β-glükoronidáz vagy uidA gént (GUS); ez olyan enzimet kódol, amelyhez különböző kromogén szubsztrátumok ismeretesek; vagy az R-lókusz-gént; ez olyan terméket kódol, amely antocianinfestékek (vörös szín) termelését szabályozza növényi szövetekben (59.).

Benne foglaltatnak a „szelektálható vagy átvizsgálható markergének” fogalmába azok a gének is, ame4

HU 218 465 Β lyek kiválasztható markert kódolnak, és ahol ez a kiválasztás kimutatható mint eszköz a transzformált sejtek azonosításához és kiválasztásához. Ezekre példák lehetnek azok a markerek, amelyek kiválasztható enzimet kódolnak - ezek katalitikusán mutathatók ki. A kiválasztható fehérjék sokféle osztályba sorolhatók, ideértve a kis, diffundálható fehérjéket, amelyek például ELISA-val mutathatók ki, a kis, aktív enzimeket, amelyek az extracelluláris oldatban mutathatók ki, vagy a fehérjéket, amelyek beiktatódnak vagy bezáródnak a sejtfalba.

A leírás ismeretében természetesen számos más lehetséges szelektálható és/vagy átvizsgálható markergén nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ezért az előbbi példák csak példáknak tekinthetők, nem kimerítő felsorolásnak. Bár ez a leírás ad a bar és/vagy a GUS-gének alkalmazásával kapcsolatban részletes példákat, más átvizsgálható vagy szelektálható markergének készítéséhez és alkalmazásához alkalmas technikák is a szakterületen belüli jártasság keretén belül vannak a jelen leírás figyelembevételével.

Azokra a markergénekre, amelyek alkalmazhatók transzformánsok kiválasztására szolgáló rendszerekben, példaszerű kiviteli forma a Streptomycesből, például a hygroscopicus fajból származó bar gén. A bar gén a foszfinotricin acetil transzferázt (PAT) kódolja, amely inaktiválja a bialafoszherbicidben levő aktív alkotórészt, a foszfínotricint (PPT). A PPT gátolja a glutamin szintázt (29., 47.), és ezzel az ammónia gyors felgyülemlését és a sejt pusztulását okozza. Az ilyen szelektív rendszer alkalmazásában elért siker az egyszikűek esetében váratlan azok miatt a jelentős nehézségek miatt, amelyekkel a gabonafélék transzformálásával számolni kell (36.).

Ha bialafoszrezisztencia-gént kívánunk alkalmazni a találmány gyakorlati kivitelezésében, akkor - észleléseink és vizsgálataink szerint - erre a célra különösen hasznos gén a Streptomyces hygroscopicusból (ATCC 21705) kinyerhető bar gén. A bar gén klónozását már leírták (29., 45.), akárcsak a bar gén alkalmazását, de csak az egyszikűektől eltérő növényekkel összefüggésben (10., 11.). Az itt leírt technikákat és az általános, a szakterületen ismert rekombináns technikákat figyelembe véve az előzőekben leírt vagy bármely más gén bevezetése és alkalmazása lehetséges itt.

Különösen hasznos átvizsgálható markerként javasolható a kukorica R gén-komplexből származó valamely gén alkalmazása. Az R gén-komplex a kukoricában olyan fehérjét kódol, amely az antocianinpigmentek termelését szabályozó tényezőként tevékenykedik a legtöbb magban és növényi szövetben. A kukoricatörzseknek egy vagy legfeljebb négy R allélje lehet, amelyek kombinálódnak, hogy szabályozzák a pigmentálódást fejlődés- és szövetspecifikus módon. A találmány feltalálói egy R gén-komplexből való gént alkalmaznak a kukorica transzformálásához, mivel ez életképes, ez természetben előforduló termék kukoricában, és ez láthatóvá válik további vizsgálatok szükségessége nélkül, így az ilyen sejtekbe bevezetett R gén vörös pigment kifejeződését idézheti elő, és - ha stabilan beépült - vizuálisan megjeleníthető mint vörös szektor. Ha egy kukoricavonalban dominánsak az antocianin bioszintetikus út enzimes köztes termékei (C2, Al, A2, Bzl és Bz2), de a vonal az R lókuszban recesszív, az ebből a vonalból való bármely sejt alkalmazható befogadóként transzformáláshoz. Az ezt alátámasztó példák lehetnek az rg-Stadler a Wisconsin 22-ben és TR112-ben, egy K55-származékban, amely r-g, b, Pl.

A feltalálók arra is rájöttek, hogy az R gén-szabályozó területek alkalmazhatók kiméra konstrukciókban abból a célból, hogy mechanizmusokat biztosítsanak a kiméra gének kifejeződésének szabályozásához. Ismeretes a fenotípusos kifejeződés nagyobb sokfélesége az R lókusznál, mint bármely más lókusznál (63.). Fel lehet mérni, hogy az R struktúrgén 5’-területéből kapott szabályozóterületek nagyon értékesek lehetnének a gének, például a rovarrezisztencia vagy herbicidtűrés génjei, vagy más fehérjekódoló területek kifejeződésének irányításában. A találmány céljaira, úgy véljük, a különböző R gén-családtagok bármelyike sikeresen alkalmazható (például P, S, Le stb.). A legelőnyösebb azonban általában az Sn (különösen az Sn:bol3). Az Sn az R génkomplex domináns tagja, és működését tekintve hasonló az R és B lókuszokhoz, amennyiben az Sn szabályozza az antocianinpigmentek szövetspecifikus lerakódását bizonyos palántákban és növényi sejtekben. így ennek fenotípusa az R-hez hasonló.

A befogadósejtbe szállítandó adott DNS-szegmens kiválasztása gyakran függ a transzformálás céljától. A gabonanövények transzformálásnak fő céljai közé tartozik, hogy bizonyos kereskedelmileg kívánatos, agronómiailag fontos jellemvonásokat adjunk a növénynek. Az ilyen jellemvonások lehetnek például - a korlátozás igénye nélkül - a herbicidrezisztencia, a megnövekedett termés, rovar- és betegségrezisztencia, fizikai megjelenés, élelmiszer-beltartalom és megjelenés stb. így például egy vagy több, herbicidrezisztenciát kódoló gént kívánunk bevezetni. Erre jó példák a bar és a glifozáttűrő EPSP szintetáz gének. Egy lehetséges bevezethető rovarrezisztencia-gén a Bacillus thuringiensis kristályos toxingén (86), amely ellenállást alakíthat ki rovarok ellen, például pikkelyesszámyúak vagy fedelesszámyúak ellen.

A lehetséges inszekticidaktivitással jellemezhető fehérjéket, például tehénborsótripszin-inhibitort (CpTI; 88.) kódoló gének gyökérféreg-riasztóként nyerhetnek alkalmazást; az avermektint kódoló gének (84., 85.) különösen hasznosnak bizonyulhatnak kukoricagyökérféreg-riasztóként. Ezenkívül a lektineket kódoló gének adhatnak át inszekticidtulajdonságokat (például árpa, búzacsíra-agglutinin, rizslektinek, lásd a 81. referenciát), míg más gének gombaellenes tulajdonságokat adhatnak át (például hevein, kitináz, lásd például a 65. referenciát).

Realizálhatók az eljárás előnyei a hidegre való megnövekedett rezisztencia céljaira is, ezt a rezisztenciát valamely „fagyellenes” fehérje, például Winder Flounder fehérje bevezetésével (87.) lehet bevinni.

Végül a legkívánatosabb Jellemvonások” valamely egyszikű genomba való bevezetésre azok a homológ gé5

HU 218 465 Β nek vagy géncsaládok lehetnek, amelyek egy kívánt jellemvonást (például megnövekedett hektáronkénti termésátlagot) kódolnak, és amelyeket új promotorok vagy fokozok stb. szabályozása alatt vezetünk be, vagy akár homológ vagy szövetspecifikus (például gyökérspecifikus) promotorok vagy szabályozóelemek szabályozása alatt vezetünk be.

A találmány így azt kívánja bemutatni, hogy növényi sejtek transzformálásával - bármely kifejezhető génnel - előnyökhöz lehet jutni, de nem szándékozik az eljárást markergének alkalmazására korlátozni. Ahogyan itt használjuk, egy „kifejezhető gén” bármely olyan gén, amely képes valamely fehéijévé transzlatálódni, valamely adott jellemvonásként kifejeződni stb., és ez a fogalom nem korlátozódik szelektálható, átvizsgálható vagy nem szelektálható markergénekre. A találmány azt is be kívánja mutatni, hogy ahol egy kifejezhető gént, amely nem szükségszerűen markergén, egy markergénnel együtt alkalmazunk, a különböző géneket alkalmazhatjuk ugyanazon vagy eltérő DNS-szegmenseken. Az utóbbi esetben a különböző vektorokat egyidejűleg szállítjuk a befogadósejtbe, hogy fokozzuk az együttes transzformálás esélyeit.

Bizonyos kiviteli módokban a befogadósejteket a tenyészetben való növesztés után választjuk ki. Ahol ezt alkalmazzuk, a tenyésztett sejteket előnyösen szilárd támasztóanyagon vagy folyékony szuszpenzió formájában tenyésztjük. Bármelyik esetben tápanyagokat lehet juttatni a sejtekhez tápközegek formájában, és a környezeti körülményeket szabályozni lehet. A szövettenyésztő tápközegek többféle típusa létezik, amelyek aminosavakat, sókat, cukrokat, hormonokat és vitaminokat tartalmaznak. A találmány gyakorlati kivitelezésében alkalmazott tápközegek legnagyobb részében hasonló alkotórészek találhatók (lásd például az 1. táblázatot); a tápközegek alkotórészeik összetételében és eloszlásában különböznek a szóban forgó alkalmazástól fiiggően. így például különböző sejttípusok általában egynél több típusú tápközegen is nőhetnek, de különböző növekedési sebességeket és különböző morfológiai állapotokat mutatnak a tápközegektől függően. Bizonyos tápközegekben a sejtek túlélnek, de nem osztódnak.

Sokféle, növényi sejtek tenyésztésére alkalmas tápközeget írtak már le a szakirodalomban. Ezek között találhatók - a korlátozás szándéka nélkül - a Chu és társai által leírt N6 tápközeg (5.) és az M5 tápközeg (30.). A befogadósejtek előállítására szolgáló egyik, példában megadott kiviteli módban a találmány feltalálói módosítják ezeket a tápközegeket (1. táblázat). Ilyen célokra előnyös hormon a dicamba vagy 2,4-D. Alkalmazhatunk azonban más hormonokat is, köztük az NAA-t vagy az NAA+2,4-D kombinációt. Ezeknek és más alaptápközegeknek a módosításai megkönnyíthetik a befogadósejtek növekedését bizonyos fejlődési stádiumokban.

A befogadó kukoricasejtek tenyésztésére példaként szolgáló kiviteli mód lehet a II. típusú kalluszban levő embriogén sejtek alkalmazása; kis (10-30 μ), egyenlő átmérőjű, citoplazmatikusan sűrű sejteket választunk ki, ezeket a sejteket hormontartalmú tápközegeket tartalmazó szuszpenziós tenyészetben növesztjük, újból tenyésztjük további tápközegekben, hogy megkönnyítsük a hajtások és gyökerek kifejlődését, végül a növényeket kiültetjük, és metabolikusan előkészítjük a földben való növekedéshez. A transzformálásban való felhasználáshoz a szuszpenziós úton tenyésztett sejteket fagyasztással tartósíthatjuk és tárolhatjuk a szükséges időtartamon át, majd felengedtetés után ezeket befogadósejtekként alkalmazhatjuk transzformációhoz.

A fagyasztva tartósítás példaként felhozható kiviteli módja például az alábbi lépésekből áll. A szuszpenziós tenyészethez fagyásvédő anyagokat adunk olyan menynyiségben, hogy a végső koncentráció 10% dimetilszulfoxid, 10% polietilénglikol (6000 móltömeg), 0,23 mol/1 prolin és 0,23 mol/1 glükóz legyen. A keveréket ezután lehűtjük -35 °C hőmérsékletre 0,5 °C/perc hűtési sebességgel.

percig tartjuk ugyanezen a hőmérsékleten, majd mintákat helyezünk el folyékony N₂-ben [Withers és King (49.), valamint Finkle és munkatársai (15.) eljárásainak módosítása]. Ha a fagyasztva tárolt anyagból szuszpenziós tenyészeteket akarunk újból beindítani, a sejteket gyorsan felengedtethetjük és adagolólemezekre pipettázhatjuk, hasonlóan a Rhodes és munkatársai által leírt eljáráshoz (39.).

A tenyésztett növénysejtek, amelyek befogadósejtekként szolgálhatnak transzformáláshoz a kívánt DNSszegmensekkel, elsősorban kifejezhető géneket tartalmazó DNS-szegmensekkel, az egyik kiviteli mód szerint kukoricasejtek, pontosabban Zea mays L. sejtjei. A szomatikus sejtek különféle típusúak. Az embriogén sejtek példák azokra a szomatikus sejtekre, amelyek indukálhatok valamely növény regenerálására embrióképezés segítségével. A nem embriogén sejtek azok, amelyek tipikusan nem érzékenyek az ilyen eljárásra. A nem embriogén sejtekre példák bizonyos Black Mexican Sweet (BMS, fekete, édes, mexikói) kukoricasejtek; ezeket sikeresen transzformálták mikrolövedékes bombázással, a neo gént alkalmazva, majd a kanamicin aminoglikoziddal szelektálva (22.). Ez a BMS tenyészet azonban nem bizonyult regenerálhatónak, és a kanamicin alkalmazását általában akadályozza a kukorica belső ellenállása (19.).

A további befogadósejt-célpontok között találjuk - a korlátozás szándéka nélkül - a merisztémasejteket, az I. és II. típusú kalluszsejteket és az ivarsejteket, mint például a mikrospórákat és pollent. A pollen, valamint ennek prekurzorsejtjei, a mikrospórák, képesek lehetnek befogadósejtekként működni genetikai transzformációhoz, vagy vektorokként működni idegen DNS-hordozókra beépítés céljából a megtermékenyítés során. A közvetlen pollentranszformáció kiküszöbölhetné a sejttenyésztés szükségességét. A merisztémás sejtek (vagyis olyan növényi sejtek, amelyek folyamatos sejtosztódásra képesek, és amelyeket differenciálatlan citológiai megjelenés jellemez; ezek a merisztémás sejtek normálisan a növekedési pontokon vagy szövetekben találhatók a növényekben, például a gyökércsúcsokban, nyélrügyekben, oldalrügyekben stb.) a befogadó növényi sejtek másik típusát képviselhetik.

HU 218 465 Β

Differenciálatlan növekedésük miatt és képességük miatt a szervdifferenciációra és -növekedésre, egyetlen transzformált merisztémás sejt is visszaállítható mint teljes transzformált növény. Valóban fennáll annak a lehetősége, hogy az embriogén szuszpenziós tenyészet in vitro merisztémás sejtrendszer legyen, megőrizve a folytonos sejtosztódás képességét nem differenciált állapotban, amelyet a tápközeg és a környezet szabályoz.

A transzformáló DNS-szegmensek bevezetésére sejtekbe számos módszer ismeretes, de nem mindegyik alkalmas a DNS beszállítására növényi sejtekbe. A megfelelő módszerek között - úgy véljük - találhatók lényegében mindazok az eljárások, amelyek segítségével DNS-t vezethetünk be egy sejtbe, ilyen például az Agrobacteriummal végzett fertőzés, a DNS közvetlen bejuttatása például PEG-gel közvetített transzformációval, elektroporációval vagy DNS-sel burkolt részecskék gyorsításával stb. Előnyösek általában a gyorsitásos eljárások; ezek között megemlítjük a mikrolövedékes bombázást és hasonlókat. Elektroporációt már alkalmaztak kukoricaprotoplasztokhoz (17.).

A transzformáló DNS-szegmensek szállítására alkalmas eljárás a mikrolövedékes bombázás. Ebben az eljárásban nem biológiai részecskék nukleinsavakkal vannak beborítva és ilyen módon vannak beszállítva a sejtekbe mozgatóerő segítségével. Az ilyen részecskékre példák lehetnek a volfrámot, aranyat, platinát és hasonlókat tartalmazó részecskék.

A mikrolövedékes bombázásnak azonkívül, hogy hatékony eszköz egyszikűek stabil, reprodukálható transzformálásához, az a különös előnye, hogy nem szükséges hozzá sem a protoplasztok izolálása (8.), sem fogékonyság Agrobacterium-fertőzésre. A DNS kukoricasejtekbe való, gyorsítással történő beszállításához alkalmas eljárásra bemutatópélda lehet a Bioliotics Partiele Delivery System, amelyet arra lehet alkalmazni, hogy DNS-sel burkolt részecskéket hajtson keresztül valamely szűrőn, például rozsdamentes acélon vagy Nitex-szűrőn egy olyan szűrőfelületre, amely szuszpenzióban tenyésztett kukoricasejtekkel van borítva.

A bombázáshoz a szuszpenzióban levő sejtek előnyösen koncentrálva vannak a szűrőkön. A bombázandó sejteket tartalmazó szűrőket megfelelő távolságban helyezzük el a makrolövedéket megállító lemez alá. Ha szükséges, egy vagy több szűrőt is elhelyezhetünk a lövegkibocsátó berendezés és a bombázandó sejtek közé. Az itt leírt technikák alkalmazásával 1000 vagy több sejtcsomót (,,góc”-ot) is kaphatunk a bombázott szűrőn, amelyek átmenetileg egy markergént fejeznek ki. Egy gócban azoknak a sejteknek a száma, amelyek az exogén génterméket fejezik ki 48 órával a bombázás után, általában az 1 és 10 közötti tartományban, átlagban a 2 és 3 közötti tartományban van.

Miután hatékonyan beszállítottuk az exogén DNS-t befogadósejtekbe a fentebb tárgyalt eljárások bármelyikével, előnyös lépés a transzformált sejtek azonosítása további tenyésztéshez és növényregeneráláshoz. Ez a lépés magában foglalhatja a tenyészetek közvetlen megfigyelését valamely átvizsgálható jellemvonásra, vagy a bombázott tenyészetek kitevését valamely szelektív szemek vagy szereknek.

Az átvizsgálható markerj ellem vonásokra példa lehet a kukoricában az R lókusz szabályozása alatt termelt vörös pigment. Ezt a pigmentet ki lehet mutatni olyan módon, hogy a tenyészetet valamely, az ebben a stádiumban a növekedés serkentésére képes tápközeget tartalmazó szilárd rögzítőanyagon tenyésztjük, a sejteket például 18 °C hőmérsékleten és több mint 180 E-m²-s^-1-nél inkubáljuk, majd a pigmentált telepekből (a sejtek látható aggregátumaiból) sejteket szelektálunk. Ezeket a sejteket tovább tenyészthetjük vagy szuszpenzióban, vagy szilárd tápközegben.

A transzformált sejtek azonosítására szolgáló eljárásoknak egyik példa szerinti kiviteli módja magában foglalja a bombázott tenyészetek kitevését valamely szelektív szer hatásának; ilyen lehet például valamely metabolikus inhibitor, antibiotikum, herbicid vagy hasonló. Azok a sejtek, amelyek transzformálódtak és stabilan integráltak valamely, az alkalmazott szelektív szerre rezisztenciát átadó markergént, növekednek és osztódnak a tenyészetben. Az érzékeny sejtek nem foghatók be a további tenyésztésre.

A bar-bialafosz szelektív rendszer alkalmazásához a szűrőn levő bombázott sejteket újraszuszpendáljuk nem szelektív folyékony tápközegben, tenyésztjük (például egy-két hétig), majd 1-3 mg/1 bialafoszt tartalmazó szilárd tápközeggel felülrétegezett szűrőkre visszük át. Bár tipikusan az 1-3 mg/1 tartomány az előnyös, úgy tűnik, hogy a 0,1-50 mg/1 tartomány nyerhet gyakorlati alkalmazást a találmányban. A szűrő típusa a bombázásban való felhasználásban nem tűnik különösebben kritikusnak, és ez lehet bármilyen szilárd, porózus, semleges támasztóanyag.

Azokat a sejteket, amelyek túlélik a szelektív szernek kitevést, olyan tápközegekben tenyészthetjük, amelyek elősegítik a növények regenerálását. A megfelelő tápközegre példa lehet az MS tápközeg egyik módosítása (1. táblázat). A szövetet hormonokat tartalmazó alaptápközegen tartjuk fenn 2-4 hétig, majd átvisszük hormont nem tartalmazó tápközegekre. 2-4 hét múlva a hajtások kifejlődése a jele annak, hogy ideje átvinni a szövetet másik tápközegre.

A regenerálás tipikusan olyan tápközeg kialakítását igényli, amelynek összetétele úgy van módosítva, hogy mindig a megfelelő tápanyagokat és hormonális jeleket biztosítsa az egymást követő fejlődési stádiumok során a transzformált kallusztól az érettebb növényig. A fejlődő csíranövényeket földbe visszük át és megeddzük például kömyezetszabályozott kamrában mintegy 85% relatív nedvességnél, 600 ppm CO₂ és 250 mikroeinstein m^-2-s^_1 fény jelenlétében. A növényeket növesztőkamrában vagy üvegházban fejlesztjük ki. A regenerálás tipikusan 3-12 hetet vesz igénybe. A regenerálás során a sejteket szilárd tápközegeken növesztjük szövettenyésztő edényekben. Az ilyen edényekre jó példa a Petri-csésze. A regenerálódó növények előnyösen 19-28 °C hőmérsékleten növekednek. Miután a regenerálódó növények elérték a hajtás- és gyökémövekedési stádiumot, ezeket át7

HU 218 465 Β vihetjük üvegházba további növekedésre és vizsgálatokra.

Abból a célból, hogy a regenerálódó növényben igazoljuk a befogadósejtbe az exogén DNS alkalmazásával beszállított jellemvonás jelenlétét egyedül vagy valamely markergénnel összekapcsolva, vizsgálatokat hajthatunk végre az említett gének kifejeződésére például a regenerált növények részeinek átvizsgálásával. Ezekre a részekre a levelek a legjobb példák. A tipikus transzformáns átvizsgálási módszerek között találjuk a regenerálódó növények vagy növényi kivonatok érintkezésbe hozását olyan szubsztrátummal, amely hatását a transzformálógén termékével fejti ki. A fejlődésnek ebben a stádiumában a növényekre az ilyen vizsgálat nem hat letálisan. A növény egy kis részének eltávolítása nem okozza annak pusztulását vagy nem hat károsan a további fejlődésre.

Az egyik tanulmányban növényeket regenerálunk A188xB73 szuszpenziós tenyésztővonal (SC82) transzformánsaiból, és ezek a növények az A188xB73 hibrid - amelyből a kallusz és a tenyészet származik - várt fenotípusát mutatják. A növények hasonló magasságúak, mint a mageredetű A188 növények (95-160 cm magasak), de B73 jellemvonásokkal bírnak, például antocianinfelhalmozódással a szárban és a pillérlevelekben, valamint függőleges levelek jelenlétével. Az is várható, hogy néhány jellemvonás a transzformált növényekben különbözik a forrásnövény jellemvonásaitól, sőt valószínű, hogy néhány variáns is előfordul.

Az egyik példaként felhozható kiviteli módban a transzformált kalluszból származó regenerálódó növények aránya, amelyek sikeresen növekednek, és elérik az érettséget az üvegházba való átvitel után, 97% (76ból 73). Egy másik példában legalább 50 élő utódot nyerünk ki Rq növényekből. Az 1% növényeket az üvegházban megvizsgáljuk termőképességre, mégpedig a transzformált növények visszakeresztezésével mageredetű növényekkel; ezt úgy végezzük, hogy az R^ kalászokat beporozzuk a mageredetű B73 növényekből származó pollennel, és ez csíra fejlődését eredményezi. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a transzformált növényeken levő csírák embriókiszabadítást igényelnek a csírafejlődés felfüggesztése miatt és a növények idő előtti elöregedése miatt.

Abból a célból, hogy embriókat szabadítsunk ki, ezeket kimetsszük a felületükön fertőtlenített csírákból 10-20 nappal a beporzás után, és tenyésztjük. Az ebben a stádiumban a tenyésztéshez alkalmazott tápközegekre egyik példa lehet az olyan tápközeg, amely MS-sókat, 2% szacharózt és 5,5 g/1 agarózt tartalmaz. Az embriókinyerésre bemutatópélda az alábbi: nagy embriókat (amelyet úgy határozunk meg, mint 3 mmnél nagyobb hosszúságúakat) csíráztatunk közvetlenül megfelelő tápközegen. Azokat az embriókat, amelyek a fenti méretnél kisebbek, egy héten át tenyésztjük olyan tápközegen, amely a fenti alkotórészeket tartalmazza, és még 10 ⁵ mol/1 abszcizinsavat, majd az embriókat átvisszük hormonmentes tápközegre csírázásra.

A transzformált növényekből utódokat nyerünk ki és megvizsgáljuk exogén, kifejezhető gén kifejeződésére, mégpedig a megfelelő szubsztrátum lokalizált alkalmazásával a növényrészekhez, például levelekhez. Bar transzformált növények esetében észlelhetjük, hogy a transzformált szülőnövények (R_o) és utódaik (R|) nem mutatnak bialafosszal kapcsolatos nekrózist a Basta herbicid lokalizált alkalmazása után, ha a növényben van működőképes PAT-aktivitás valamely in vitro enzimes vizsgálattal mérve. Az egyik tanulmányban 28 vizsgált utód (Rj) növényből 50%-nak (N = 14) van PAT-aktivitása. Az összes vizsgált PAT-pozitív utód tartalmaz bárt, igazolva, hogy az enzim jelenléte és a bialafoszra való rezisztencia össze van kapcsolva a markergén átvitelével a csíravonalon keresztül. A kallusz és a szülőtranszformánsok (Rq) nem kiméra szerkezetét a csíravonal-átvitel, valamint a transzformáló DNS azonos Southem-folt hibridizációs mintái és intenzitásai igazolják a kalluszban, Ro növényekben és R( utódokban, amelyek a transzformált génnel alakulnak ki.

A genomikus DNS-t izolálhatjuk a kalluszsejtvonalakból és növényekből, hogy meghatározzuk az exogén gén jelenlétét olyan technikák alkalmazásával, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Meg kell jegyeznünk, hogy nincsenek mindig jelen ép szekvenciák, valószínűleg a szekvenciák átrendeződése vagy kiiktatása következtében a sejtben.

A találmány feltalálóinak sikerült termő transzgenikus egyszikű növényeket (kukoricát) előállítani, ami eddig másoknak nem sikerült. A találmány szerinti eljárások különböző szempontjai a termő, transzgenikus kukoricanövény előállításához - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbiak lehetnek: a befogadósejtek szuszpenziós tenyészetének kifejlesztése a speciális növekedési stádiumokat elősegítő tápközegeket alkalmazva; azoknak a szelektív rendszereknek a kiválasztása, amelyek lehetővé teszik a transzformálás hatékony kimutatását; a gyorsítási eljárások módosítása, hogy exogén DNS-sel bíró genetikai vektorokat vezethessünk be a sejtekbe; a transzformált sejtekből növények nagy gyakoriságú regenerálására szolgáló eljárások és túlélésre, valamint reprodukálódásra képes termő transzgenikus növények előállítására.

MÉGHA TAROZÁSOK

Beltenyésztett vonalak - olyan organizmusok, amelyek genetikailag homogének (homozigóták), ez pedig az önkeresztezés több generációjának az eredménye. Csírasejtek (gaméták) - valamely organizmus sejtjei, amelyek képesek átvinni genetikai információjukat a következő generációba.

Egyszikű - olyan növény, amelynek egyetlen sziklevele van (a kiültetett növény embriójának első levele); erre példák lehetnek a gabonafélék, például a kukorica, rizs, búza, zab és árpa.

Embriogén kallusz - a kallusz egyik típusa, amely képes differenciálódni szomatikus embriókká.

Fenotípus - valamely organizmus által mutatott jellemvonás, amely a genotípus és a környezet kölcsönhatásából alakul ki.

Genotípus - valamely szervezet genetikai állománya. Heterológ DNS - DNS olyan forrásból, amely a befogadósejt forrásával azonos.

HU 218 465 Β

Hibrid - olyan utód, amely szülővonalak közti keresztezés eredménye.

Homológ DNS - DNS olyan forrásból, amely a befogadósejt forrásával azonos.

In vitro - laboratóriumi körülmények között.

In vivő - az élő organizmusban.

Kallusz - sejtek vagy szövetek in vitro buqánzó tömege. I. típus - tömör, lassan növő, heteromorf kallusz (embriogén/organogén), amely megőrzi merisztémás aktivitását a szervszövetek területeiben. II. típus - morzsalékos, gyorsan növekvő embriogén kallusz, amely kis, izodiametrikus, sűrű citoplazmájú sejtek aggregátumaiból áll. Gyakran tartalmaz kis embrioidokat az alapkalluszhoz tapadva egy felfüggesztő (szuszpenzor) segítségével.

Nem embriogén kallusz - a kallusznak olyan típusa, amely nem differenciált, gyakran nagymértékben üreges sejtekből áll, amelyek nem képesek indukálódni embriók kialakítására.

Protoplaszt - növényi sejtek a sejtfal nélkül.

Szomatikus sejtek - valamely organizmust alkotó sejtek a csírasejtek kivételével.

Transzformálás - új genetikai kódolószekvenciák befogadására hozzátett (exogén) DNS beépítésével. Transzgenikus - olyan organizmusok (növények vagy állatok), amelyekbe új DNS-szekvenciák integrálódtak.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit.

1. ÁBRA: a bombázási kísérletekben alkalmazott plazmidok (vektorok) vázlatos bemutatása. A plazmidok neve: (A) pDPG165, amely bárt tartalmaz; és (B) pDPG208, amely uidA-t tartalmaz, ez az a gén, amely a β-glükoronidázt (GUS) kódolja. Azok a betűk, amelyek a különböző restrikciós helyek elhelyezkedését jelölik, vagyis azokét a helyekét, amelyek restrikciós enzimekkel hasíthatok, az alábbi jelentésűek: E=EcoRI; H=HindIII; B=BamHI; S=SmaI. A (C) mutatja be a pDPG165 részletesebb térképéf és a (D) mutatja be a pDPG208 részletesebb térképét.

Az (E) a pAGUSl - amely a pDPG141-ként is ismeretes - restrikciós térképet mutatja be; ebben az 5’-nemkódoló és 5’-kódolószekvenciák úgy vannak módosítva, hogy beléjük van építve a Kozak-konszenzusszekvencia és egy Hindlll restrikciós hely. Az (F) a pDPG237 restrikciós térképét mutatja be; ez olyan plazmid, amely az Rsn cDNS-t építi be egy 35S promotorral és egy Tr7 3'-véggel együtt.

2. ÁBRA: a sejttelepek megjelenése, amelyek a bialafoszt tartalmazó szelekciós lemezeken feltűnnek. Az ilyen telepek 6-7 héttel a bombázás után jelennek meg. (A) SC82 bialafoszrezisztens telep, 1 mg/1 bialafoszon szelektálva. (B) Embriogén SC82 bialafoszrezisztens kallusz, 1 mg/1 bialafoszon szelektálva és fenntartva.

3. ÁBRA: foszfinotricin acetil transzferáz (PAT)-aktivitás az El-Eli jelzésű embriogén SC82 kallusztranszformánsokon és nem szelektált kontroliban (EO). 25 pg fehérjét viszünk fel vonalanként A B13 BMS-bar transzformáns. A BMS fekete mexikói édeskukorica (Black Mexican Sweet Com). A különböző transzformánsok aktivitásai változók, akár mintegy

10-szeres különbséggel is, a csíkok intenzitásai alapján.

4. ÁBRA: a bar gén integrálódása az El-Eli bialafoszrezisztens SC82 kalluszizolátumokban. Az El-El 1-ből és egy nem szelektált kontroliból való, EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztett genomikus DNS (4 pg/emésztés) DNS-gélfoltja. A kb-ban megadott molekulatömeget a jobb és bal oldalon megadjuk. A foltot hibridizáljuk ³²P-vel jelzett, pDPG165-ből származó barral (25 1 0⁶ Cerenkov-beütés/perc). Az 1. és 5. kópiáknak jelzett vonalak a diploid genomra utalnak, és 1,9, illetve 9,5 pg-ot tartalmaznak a pDPG-ből EcoRI-gyel és HindlII-mal kiszabadított, 1,9 kb-s barkifejező egységből.

5. ÁBRA: PAT-aktivitás az R_n növények fehérjekivonataiban. Az A188xB73, SC82 szuszpenziós tenyészetéből való négy transzformált, regenerálható kalluszvonal (E10, Eli, E2/E5 és E3/E4/E5) mindegyikéből származó növény kivonatait vizsgáljuk PAT-aktivitásra. (Az E2/E5 és E4/E4/E6 jelölések olyan transzformált sejtvonalakat képviselnek, amelyek azonos DNS-gélfolthibridizációs mintával bírnak; az izolátumok nagyon valószínű, hogy csak a tenyésztési és szelektálás! munkamenet során különülnek el). Kontrollként szerepelnek a nem transzformált B73 növény és egy fekete mexikói édes kukorica (BMS) sejttenyészete fehérjekivonatai. Mintegy 50 mikrogramm összfehérjét alkalmazunk reakciónként.

6. ÁBRA: A transzformált kalluszból és a megfelelő R_n növényekből való genomikus DNS-gélfolt elemzése barral átvizsgálva. Genomikus DNS-t emésztünk EcoRI-gyel és HindlII-mal, amely kiszabadítja a pDPG165-ből való 1,9 kb-s barkifejező egységet (CaMV 35S promotor-bar-Tr7 3’-vég) (a pDPG165 az SC82 sejtek mikrolövedékes bombázásos transzformálásához alkalmazott plazmid), és barhoz hibridizáljuk. A molekulatömegeket kb-ban a jobb és bal oldalon ábrázoljuk. Az E3/E4/E6, Eli, E2/5 és E10 jelű vonalak 5 pg kallusz (C) vagy R_o növény-DNS-t tartalmaznak. A kontrollvonal DNS-t tartalmaz egy nem transzformáit A188xB73 növényből. Az „1 kópiá”-val jelzett vonal 2,3 pg-ot tartalmaz a pDPG 165-ből származó 1,9 kb-s EcoRI/HindlII fragmentumból, ez pedig egy kópiát képvisel diploid genomonként.

7. ÁBRA: Az E2/E5 R_o növények különváló utódjainak PAT-aktivitása és DNS-folt-elemzése. (A) A PAT-aktivitás vizsgálata 10 utódban (a-j vonalak) és egy nem transzformált kontrollnövényben (k vonal). Az a, b-h, és j jelű vonalak különböző szülő Ro növények utódaiból való fehérjeextraktumokat tartalmaznak. A „kallusz” jelű vonal fehérjekivonatot tartalmaz E2/E5 kalluszból. Mintegy 25 mikrogramm teljes fehérjét alkalmazunk reakciónként. (B) Az (A)-ban elemzett 10 utódból izolált genomikus DNS, DNS-gélfolt elemzése. A genomikus DNS-t (5 pg/vonal) Smal-gyel emésztjük, amely egy 0,6 kb-s, a pDPG165-ből való bárt tartalmazó fragmentumot szabadít fel, és ezt barvizsgáló mintával (próbával) átvizsgáljuk. Az Ro-nak jelölt vonal DNS-t tartalmaz az az utód Ro szülőgénjéből. Az 1 kópiával jelzett vonal Smal-gyel emésztett

HU 218 465 Β pDPG165-öt tartalmaz, ez mintegy 1 kópiát képvisel a 0,6 kb-s fragmentumból egy diploid genomra számítva (0,8 pg).

8. ÁBRA: a GUS-aktivitás hisztokémiai meghatározása barral transzformált Y13 SC82 kalluszvonalban. Ezt az Y13 bialafoszrezisztens kalluszvonalat, amely ép GUSkódolószekvenciákat tartalmaz, átvizsgáljuk GUS-aktivitásra három hónappal a bombázás után. Ebben az ábrán a kallusz különböző festődése figyelhető meg.

9. ÁBRA: az exogén gének integrálódása az R1-R21 bialafoszrezisztens SC716 izolátumokban.

(A) Az A188xB73 (SC716) szuszpenziós tenyészetből izolált, R1-R21 jelzésű transzformánsokból való EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztett genomikus DNS, DNS-gélfoltja, ³²P-jelzett (—10—10⁶ Cerenkovbeütés/perc) barvizsgáló mintával (próbával) hibridizálva. A molekulatömeg-markerek megtalálhatók mind a jobb, mind a bal oldalon. A barkifejező egység két kópiája diploid genomonként 5,7 pg a pDPG165ből való, 1,9 kb-s EcoRI/ HindlII fragmentumból. (B) Az (A) lépésből való foltot mossuk és hibridizáljuk ³²P-jelzett GUS-vizsgáló mintával (próbával) (~35 · 10⁶ Cerenkov-beütés/perc). A két kópia a 2,1 kbs, a pDPG 208-ból való, GUS-tartalmú EcoRI/HindlIl fragmentumból 6,3 pg.

10. ÁBRA: a bevezetett gének működőképes kifejezése transzformált R_o és Rj növényekben. (A) Bastarezisztencia transzformált Rq növényekben. Bastaoldatot alkalmazunk nagy területen (4x8 cm) a nem transzformált A188xB73 növény (balra) és egy transzgenikus R_(l E3/E4/E6 növény (jobbra) leveleinek középpontjában.

(B) Bastarezisztencia transzformált Rj növényekben. Bastát alkalmazunk négy R| növény leveleihez is; két növény bar nélküli (balra), két növény viszont tartalmaz bárt (jobbra). A herbicidet az Rj növényekhez 1 cm-es körökben alkalmazzuk egy-egy levélen négy helyen, kétkét helyen a középső erezet mindegyik oldalán. A fényképeket hat nappal az alkalmazás után készítjük. (C) GUSaktivitás hisztokémiai meghatározása egy együtt-transzformált Y13 kalluszvonalból regenerált növény (jobbra) és egy nem transzformált, szövettenyészet-eredetű növény (balra) levélszövetében (oszlop=l cm). (D) A (C) részben bemutatott Y13 növényből származó levélszegmens fénymikroszkópos kép, felületi leképezéssel megfigyelve fényes mezőoptikával. GUS-aktivitás figyelhető meg több sejttípusnál a levélszövet mentén (nagyítás=230x). (E) A kontroli-levél (D) szerinti fénymikroszkópos képe.

11. ÁBRA: érett R_o növény, fejlődő csirák és utódok. (A) Érett, E2/E5 kalluszból regenerált transzgenikus Ro növény (Β) E2/E5 növényből embriókiszabadítással származó utód; az a fajta, amely hordozza a rezisztenciagént, jobbra látható, míg amelyikből ez a gén hiányzik, balra látható. (C) A transzformált Rj növényekből való pollent alkalmazva B73 kalászok beporzására nagyszámú magot nyerünk ki. (D) Transzformált cső R! növényből, amely egy nem transzformált, bel tenyésztett növény pollenjével van keresztezve.

A továbbiakban leírjuk a találmány előnyös kiviteli módjait.

Ez az első időpont, amióta transzgenikus kukoricanövényeket állítanak elő, hogy a gabonatermelés javítására olyan új távlatok nyílnak, amelyek az in vitro genetikai transzformáción alapulnak. A jelen találmány feltalálóinak sikerült az, amely másoknak még nem, hogy egyesítsenek és módosítsanak számos lépést abban az általános munkamenetben, amely a szomatikus sejtekből a transzgenikus növényekig vezet. Bár az itt leírt eljárások egy egységes munkamenet részei, a jobb szemléltetés céljából ezeket az alábbi szakaszokra bontjuk: olyan sejtek tenyésztése, amelyek az exogén DNS befogadói lesznek; a befogadósejtek tartósítása fagyasztással; vektorok megalkotása, amelyek a DNS-t a sejtekbe szállítják; a DNS beszállítása a sejtekbe; a sikeres transzformációk vizsgálata; szelektív szerek alkalmazása, ha ez szükséges a stabil transzformánsok izolálásához; a növények vizsgálata génkifejezésre és az exogén DNS-szekvenciák azonosítására; annak meghatározására, hogy a transzgenikus növény termő-e; és a transzgenikus növények utódainak előállítása. A találmány foglalkozik még a transzformált kukoricasejtekkel, transzformált növényekkel és az említett növények által termelt pollennel.

A) Szövettenyészet

A szövettenyésztés megfelelő tápközeget és szabályozott körülményeket igényel. A „tápközeg” kifejezés olyan tápanyagkeveréket jelent, amelyet a sejtek in vitro növesztéséhez alkalmaznak, vagyis ez az élő, ép organizmuson kívül található. A tápközeg általában tápanyagok különböző típusainak (sók, aminosavak, hormonok, cukrok, pufferek) szuszpenziója, amelyek a legtöbb sejttípus növekedéséhez szükségesek. Minden speciális sejttípus azonban speciális alkotórész-tartományt igényel a növekedéshez, és még speciálisabb összetételt igényel az optimális növekedéshez. A sejtnövekedés sebessége tenyészetenként változó a tápközegek összetételének megfelelően, amelyek az adott sejttípus növekedését lehetővé teszik.

A tápközeget folyadékként készítjük el, de ezt megszilárdíthatjuk olyan módon, hogy a folyadékba szilárdítás kialakítására alkalmas anyagot adunk. Erre a célra leginkább agart használunk. A Bacto agar és a Gelgro azok a szilárd rögzítőanyagok, amelyek leginkább alkalmasak a növényi sejtek növekedéséhez szövettenyészetben.

Bizonyos sejttípusok vagy folyékony szuszpenzióban, vagy szilárd tápközegen növekednek és osztódnak. Amint itt leítjuk, a kukoricasejtek szuszpenzióban növekednek, de a növények regenerálása azt igényli, hogy a fejlődés bizonyos pontjaiban tenyészeteket folyékony tápközegről szilárd tápközegre vigyük át. A sejtek differenciálódásának típusára és mértékére a tenyészetben nem csupán a tápközeg típusa és a környezet, például a pH hat, hanem az is, hogy a tápközeg folyékony-e vagy szilárd. Az 1. táblázat mutatja be a befogadósejtek megalkotásához és a növények regenerálásához alkalmas különböző kompozíciók összetételét.

B) Befogadósejtek tenyésztése szuszpenzióban transzformációhoz

A találmány feltalálói úgy vélik, hogy az a lehetőség, amely szerint kukoricasejtek szuszpenziós tenyé10

HU 218 465 Β szete elkészíthető és fagyasztva tartósítható, a találmány egyik fontos szempontja, amely eszközt nyújt sejtek sikeres és reprodukálható előállítására transzformációhoz. Az alább leírt tanulmányok ismertetik azokat a technikákat, amelyeket a feltalálók sikeresen alkalmaz- 5 tak, hogy kukoricasejtek transzformálható és regenerálható szuszpenziós tenyészeteit alakítsák ki. A feltalálók sok, különböző típusú tápközeget fejlesztettek ki és alkalmaztak a találmány különböző szempontjainak kivitelezésében, ezek közé értve elsősorban a szuszpenziós tenyészetek kifejlesztését. Az alábbi 1. táblázat megadja a feltalálók által előnyösnek vélt kompozíciókat a találmány e szempontjainak kivitelezéséhez.

1. táblázat

Példaszerű kiviteli formák szövettenyésztő tápközegekre, amelyeket a II. típusú kallusz kifejlesztéséhez, a szuszpenziós tenyészetek kifejlesztéséhez és növényi sejtek (elsősorban kukoricasejtek) regenerálásához alkalmazunk

Tápközeg-azonosítási szám	MS*	N6	Szacharóz	Optimális pH	Más komponensek**
52.	+		2%	6,0	0,25 mg tiamin 1 mg 2,4-D 10-7 mol/1 ABA Bacto agar
101.	+ V	-	3%	6,0	100 mg mio-inozit Bacto agar
142.	+ V		6%	6,0	5 mg BAP 0,186 mgNAA 0,175 mg IAA 0,403 mg 2-IP 200 mg mio-inozit Bacto agar
163.	+ V	—	3%	6,0	3,3 mg dicamba 100 mg mio-inozit Bacto agar
171.	+ V		3%	6,0	0,25 mg 2,4-D 10 mg BAP 100 mg mio-inozit Bacto agar
173.	+ V		6%	6,0	5 mg BAP 0,186 mg NAA 0,175 mg IAA 0,403 mg 2-IP 10 5 mol/1 ABA 200 mg mio-inozit Bacto agar
177.	+ V		3%	6,0	0,25 mg 2,4-D 10 mg BAP IO 3 mol/l aba 100 mg mio-inozit Bacto agar
201.		+ V	2%	5,8	25 mmol/1 prolin 1 mg 2,4-D 100 mg kazeinhidrolizátum Gelgro®
205.		+ V	2%	5,8	25 mmol/1 prolin 0,5 mg 2,4-D 100 mg kazeinhidrolizátum Gelgro®
227.		+ V	2%	5,8	25 mmol/1 prolin 0,5 mg 2,4-D 100 mg kazeinhidrolizátum Gelgro®

HU 218 465 Β

1. táblázat (folytatás)

Tápközcg-azonosítási szám	MS*	N6	Szacharóz	Optimális pH	Más komponensek**
401.	+		3 +	6,0	0,25 mg tiamin 1 mg 2,4-D 2 mg NAA 200 mg kazeinhidrolizátum 500 mg K-szulfát 100 mg mio-inozit 400 mg K-foszfát (egybázisú)
402.	+		3%	6,0	0,25 mg tamin 25 mmol/1 prolin 1 mg 2,4-D 200 mg kazeinhidrolizátum 500 mg K-szulfát 400 mg K-foszfát (egybázisú) 100 mg mio-inozit
409.	+		3%	6,0	0,25 mg tiamin 25 mmol/1 prolin 10 mg dicamba 200 mg kazeinhidrolizátum 500 mg K-szulfát 400 mg K-foszfát (egybázisú)
501.	-	-	2%	á- §	Clark’s*** Gelgro®

* tsz alap MS tápközeget a 30. referencia írja le. A 30. referenciában leírt tápközeget tipikusan úgy módosítjuk, hogy az NH₄NO₃-at 1,64 g/l-ről 1,55 g/l-re csökkentjük, és elhagyjuk a piridoxin.HCl-t, a nikotinsavat, a mio-inozitot és a glicint.

+ =jelen van; - =nincs jelen; v=vitaminok.

** NAA=naftil-ecetsav,

IAA=indol-ecetsav,

2-IP=2-izopentil-adcnin,

2,4-D=2,4-diklór-fcnoxi-ccctsav,

BAP=6-benzil-amino-purin,

ABA=abszcizinsav.

*** Az alaptápközeg a 6. referenciában van leírva.

1. példa

A GII(A188 χ B73)716 szuszpenziós tenyészet (amelyet SC716-nak is nevezünk) beindítása transzformálásban való felhasználáshoz

Ez a példa egy SC716-nak nevezett kukorica-szusz- 40 penzióstenyészet kifejlesztését írja le, amelyet az alábbiakban leírt különböző transzformációs tanulmányokhoz alkalmazunk. A sejtszuszpenzió beindításához alkalmazott II. típusú szövet A188xB73 éretlen embrióiból származik, amelyek N6-alapú tápközegre - 1 mg/ml 45 2,4-D-vel - (az 1. táblázatban 201.) vannak szélesztve.

Az A188xB73 embriók az A188-ból (Maize DB sejtvonalgyűjtemény ID 47602) és B73-ból (Maize DB 47638) állíthatók elő. A kukoricavonalak szakterületén jól ismert keresztezést a (89.) irodalmi hely, az éretlen 50 embriók izolálását a (90.) irodalmi hely ismerteti. A II. típusú kalluszt úgy indítjuk be, hogy vizuálisan kiválasztjuk a gyorsan növő, morzsalékos embriogén sejteket. A kallusz beindításától számított 6 hónapon belül alakítjuk ki a szuszpenziót. Az a szövet, amelyet a kai- 55 luszból kiválasztunk a szuszpenzió beindításához, nagyon differenciálatlan II. típusú kalluszból áll; ennek a differenciálatlan szövetnek a jellemzői az embriókifejlődés legkorábbi stádiumainak felelnek meg a lágy, morzsalékos, differenciálatlan megjelenés alapján. 60

Mintegy 1 gramm szövetet helyezünk 20 ml folyékony tápközegbe. Ebben a példában a folyékony tápközeg a 402. jelű, amelyet különböző lassú kibocsátású hormonkapszula-kezelésben részesítünk (lásd a 2. példát). Ezek között a kezeléshez alkalmazott kapszulák között találjuk a 2,4-D, NAA, 2,4-D+NAA és 2NAA kapszulákat. Egy palackot indítunk be minden különböző 402. tápközeghormon-kombinációhoz. Minden 7. napon a tenyészetet átoltjuk friss tápközegre olyan módon, hogy a sejtszuszpenzió egy kis részét átvisszük új palackba. Ez magában foglalja az eredeti palack megforgatását, hogy a sejteket felszuszpendáljuk (amelyek igyekeznek a tenyésztőpalack fenekére leülepedni), továbbá a palack megdöntését egyik oldalára, és így a sűrűbb sejtek és sejtaggregátumok enyhe ülepedésének lehetővé tételét. 1 ml ilyen módon összetömörödött sejtet azután leszívunk a leülepedett sejteknek ebből a gyűjteményéből, 4 ml kondicionált tápközeggel együtt. Ehhez az átvitelhez 10 ml-es, széles csúcsú steril pipettát alkalmazunk (Falcon 7304). Kizárunk ilyen módon minden olyan nagy sejtaggregátumot, amely nem hatol át könnyen a pipetta csúcsán. Ha a tápközegben van hormonkapszula, azt is átvisszük az új palackba.

Mintegy 7 hét múlva a laza embriogén sejtaggregátumok elkezdenek túlsúlyba kerülni és fragmentálód12

HU 218 465 Β ni az egyes tenyészetekben, elérve azt a stádiumot, amelyet „diszpergált”-nak nevezünk. Az a kezelés, amely az embriogén csomók legnagyobb arányát alakítja ki, a 402. tápközeg+NAA kapszula. Miután a tenyészetek diszpergálttá váltak, és elkezdenek nagyobb sebességgel nőni mintegy 2-3 naponként megduplázódva, amint ezt a tömörödött sejttérfogat növekedésével meghatározzuk, az egyes tenyészetekből 1 ml tömörödött sejtinokulumot viszünk át 401. tápközegbe 10 ml-es szűk csúcsú pipettát alkalmazva (Falcon 7551). Ezeket az átviteleket elvégezzük 3/ naponként. A 4O2.+2,4-D+ +NAA kapszulatenyészetből való inokulumokat alkalmazzuk 409. tápközeg (4O2.+2,4-D nélkül, +10 mg/1 dicamba) beindítására is 1 ml kókuszdióvízzel vagy a nélkül (Gibco 670-8130AG).

A leginkább diszpergált tenyészeteket fagyasztással tartósítjuk 2 hét, 2 hónap és 5 hónap után.

A tenyészetet, amely 409. tápközegen és kókuszdióvízzel nőtt, nyolc hónap múlva vesszük elő a fagyasztott tárolásból, felengedtetjük, két héten át tenyésztjük szilárd 201. tenyésztő tápközegen, táplálórétegként BMS-t alkalmazva (38), majd átvisszük 409. tápközegre kókuszdióvíz nélkül. A tenyészeteket úgy tartjuk fenn, hogy hetenként kétszer átoltjuk 409. tápközeget alkalmazva, ahogyan fentebb leírtuk.

2. példa

Az (A188 χ B73)82 szuszpenziös tenyészet (amelyet SC82-nek is nevezünk) beindítása transzformálásban való felhasználáshoz

Ez a példa egy másik, SC82-nek nevezett vonal kifejlesztését írja le, amelyet az alábbi különböző transzformációs tanulmányokban alkalmazunk. Az SC82 kifejlesztésénél a szuszpenziös tenyészet beindításához az inokulumot vizuálisan választjuk ki egy II. típusú kalluszból, amely éretlen embriókból származik; ezek N6alapú tápközegen vannak tenyésztve, amely 13,2 mg/1 dicambát is tartalmaz (227.; 1. táblázat). A szuszpenziós tenyészetet 3 hónappal a II. típusú kallusz beindítása után indítjuk be. Kis mennyiségű (50-100 mg) kalluszt - amely vizuális megfigyeléssel megkülönböztethető nagymértékben előembrionális morfológiája miatt - izolálunk érettebb és szervezettebb struktúrákból, és 50 ml-es palackba inokuláljuk, amely 5 ml, szűréssel sterilizált kondicionált tápközeget tartalmaz különböző GII(A188xB73)716 szuszpenziös tenyészetekből (402. tápközeg négyféle típusú kapszulakezeléssel és 409. tápközeg).

Egy hét múlva ezt az 5 ml-es tenyészetet átszűrjük egy 710 mikronos szűrőn, és ezt felhasználjuk 20 ml megfelelő friss és szűréssel sterilezett kondicionált tápközeg inokulálására; ez a tápközeg 150 ml-es palackban nőtt kialakult GII(A188xB73) 716. tenyészetből származik. Egy hét vagy több növekedés után 2 ml összetömörített sejtet átoltunk friss tápközegre a fentebb leírt eljárással. Az ezzel az eljárással 409. tápközegen fenntartott szuszpenziös tápközeget azután fagyasztással tartósítjuk 3 hónapon belül. Az eredeti sejtvonalat, amelyet 409. tápközegen tartunk fenn (vagyis nem újrainokulált, fagyasztással tartósított tenyészetet), alkalmazzuk a kísérletekben 1 vagy 2 hónap múlva, amely stabil transzformálást és szelektálást eredményez (lásd a 2. táblázatot). A fagyasztva tartósított tenyészetet a 6. kísérletben alkalmazzuk (lásd a 2. táblázatot).

C) Lassú kibocsátású növényi hormon kapszula

A radioaktív növényi hormonok (2,4-D és NAA) sorsát követő tanulmányok azt mutatják, hogy a kukoricasejtek két napon belül abszorbeálják a szuszpenziös tenyésztő tápközegekben jelen levő auxinokat. A hormonéhezésnek ezt a problémáját leküzdhetjük olyan módon, hogy a tenyészeteket kiegészítjük kis mennyiségű auxinnal minden második napon. A tenyészetek rendszeres kiegészítése azonban nagyon időrabló, amikor nagy mennyiségben végezzük, és növekszik a fertőzés veszélye, hiszen a tenyésztőpalackokat gyakran ki kell nyitni. A lassú kibocsátású növényi hormon kapszulákat azért fejlesztettük ki, hogy leküzdjük ezeket a problémákat. A lényeget összefoglalva ezek a kapszulák valamely növényi hormont tartalmaznak általában kristályos állapotban szilikonmátrixba foglalva, ez pedig egy szilikonkorlátozó membránnal van körülvéve. A hormonkibocsátás sebessége szabályozható a diffúzióra alkalmas terület méretével és a membrán vastagságával. Ennek az eljárásnak az előnyei a következők: 1.) hormonok szolgáltatása elfogadható és megjósolható sebességgel (például 20-100 pg/20 ml tenyésztő tápközeg/nap); 2.) ezek alkalmas méretűek (például 0,5-1,5 cm hosszúságúak) szilárd vagy folyékony tápközegekben való felhasználáshoz; 3.) ezek nagyon tartósak és könnyen sterilezhetők autoklávozással; és 4.) ezek száraz állapotban addig tárolhatók, ameddig szükséges.

Ez a kiszerelés lehetővé teszi a növényi hormon vagy szelektív szer szabályozott kibocsátását valamely növényi szövettenyészethez egy belső mátrixból - amely a kívánt szer kristályait tartalmazza - egy külső diffúziószabályozó membránon keresztül. A kiszerelés egyik előnyös kiviteli módjában a kívánt szerből 30% száraz kristályt összekeverünk 70% (tömeg/tömeg) szobahőmérsékletű vulkanizálószilikonnal (RTV), majd ezt a keveréket a kívánt szer kívánt kibocsátási sebességéhez megfelelő átmérőjű és falvastagságú szilikoncsőbe injektáljuk. (A lassú kibocsátású kapszulával kapcsolatban alkalmazható előnyös szerek a 2,4-D és az NAA, és az előnyös méretek: 0,1575 cm (belső átmérő) χ 0,3175 cm (külső átmérő).

Az RTV szilikont azután szobahőmérsékleten vagy magasabb hőmérsékleten polimerizáljuk, hogy meggyorsítsuk a vulkanizálási folyamatot. A belső mátrix vulkanizálása után a csövet a kívánt hosszúságú darabokra vágjuk, és a darabok végeit RTV szilikonnal leforrasztjuk. A találmány szerinti felhasználáshoz az előnyös hossz mintegy 0,5 cm. Miután a végforrasztásokat polimerizáltuk, az így kapott kapszulákat ilyen formában tárolhatjuk, vagy 15 percig autoklávozhatjuk egy gyors kiürítésű körfolyamatban és korlátlan ideig tárolhatjuk steril formában. A felhasználás előtt a kapszulákat kiegyensúlyozhatjuk, hogy stabil diffúziós gradienst hozzunk létre a membránon keresztül, de alkalmazhatjuk a kapszulákat közvetlenül is, kiegyensúlyozás nélkül.

HU 218 465 Β

Egy másik, sokkal kisebb kibocsátási sebességhez alkalmas kiszerelés az, hogy egy kívánt anyagnak valamely folyadékban, például vízben vagy szilikonolajban szuszpendált kristályait valamely viszonylag nem áteresztő csőbe, például Nylon-11-be zárjuk. A kibocsátási sebességet ebből a tárolási formából szabályozhatjuk különböző méretű üregek befúrásával a csőbe és egy szilikonablak ráragasztásával az üregre valamely szilikonos orvosi ragasztóval. A kapszulákat ezután autoklávozással sterilezhetjük és szárazon tárolhatjuk a felhasználásig.

A feltalálók az alábbiakban példaként megadnak egy technikai kiviteli módozatot lassú kibocsátású hormonkapszulák előállítására.

1. ) 2 gramm Dow Corning MDX-4-4210 orvosi minőségű elasztomert és 0,2 gramm Dow Corning MDX-4-4210 vulkanizálószert bemérünk egy 10 mles fecskendőbe, amelynek feneke műanyag sapkával van lezárva.

2. ) 600 mg 2,4-D-t (vagy NAA-t), amelyből a csomókat eltávolítottuk egy 411 μ-os rozsdamentes acél szitán való átengedéssel, adunk ugyanabba a fecskendőbe és alaposan összekeverjük az elasztomerrel és a vulkanizálószerrel.

3. ) A 10 ml-es fecskendőt és tartalmát azután félórán át gázmentesítjük vákuumcentrifugában, hogy a buborékokat eltávolítsuk.

4. ) Közepes keménységű (50 Shore A) Dow Corning Silastic orvosi minőségű szilikoncsövet [0,1575 cm (belső átmérő) χ0,3175 cm (külső átmérő)] 10-30 percig előduzzasztunk acetonban végzett áztatással.

5. ) A műanyag sapkát eltávolítjuk a 10 ml-es fecskendő végéről, és a gázmentesített szilikon-2,4-D keveréket az előduzzasztott csőbe extrudáljuk, ahol a csőből az aceton fölöslegét előzőleg eltávolítottuk levegőáram gyors átfujásával.

6. ) A megtöltött cső mindkét végét azután csiptetőssel lezárjuk, és a csövet 50 °C hőmérsékleten melegítjük (az aceton forráspontja=56,5 °C) egy éjszakán át, hogy meggyorsítsuk a polimerizációt.

7. ) A csövet ezután 0,5 cm hosszúságú darabokra vágjuk.

8. ) A csodarabok végeit Dow Corning Type A orvosi ragasztóval leforrasztjuk, és hagyjuk száradni 24 órán át.

9. ) A kész kapszulákat szárazon autoklávozzuk 15-20 percen át, majd felhasználásig tároljuk.

10. ) A felhasználás előtt a kapszulákat kiegyensúlyozhatjuk 48 órán át olyan módon, hogy 25 ml steril, 1-10 mmol/1 KHCO₃-ban rázatjuk, de a kapszulákat adhatjuk a tenyészethez kiegyensúlyozás nélkül is.

D) Fagyasztva tartósítási eljárások

A fagyasztva tartósítás azért fontos, mert ez teszi lehetővé, hogy egy sejttenyészetet a későbbi felhasználáshoz fenntartsunk és tartósítsunk.

A sejtszuszpenziók fagyasztva tartósítása korábban leírt eljárások (15.; 49.) módosított formájának alkalmazásával történik. A fagyasztva tartósítási munkamenet abból áll, hogy egy előhűtött (0 °C), koncentrált fagyvédő keveréket cseppenként hozzáadunk egy óra alatt, keverés közben a sejtszuszpenzióhoz, amelyet ez alatt az idő alatt 0 °C hőmérsékleten tartunk. A hozzáadott fagyvédő térfogata azonos a sejtszuszpenzió kiindulási térfogatával (1:1), és a fagyvédő anyagok végső koncentrációja: 10% dimetil-szulfoxid, 10% polietilénglikol (6000 molekulatömeg), 0,23 mol/1 prolin és 0,23 mol/1 glükóz. A keveréket 0 °C hőmérsékleten 30 percen át hagyjuk kiegyensúlyozódni, amely idő alatt a sejtszuszpenzió/fagyvédő keveréket 1,5 ml-es alikvotokra (0,5 ml tömörödött sejttérfogat) osztjuk szét 2 ml-es polietilén fagyasztóampullákba. A csöveket 0,5 °C/perc sebességgel lehűtjük -8 °C hőmérsékletre és ezen a hőmérsékleten tartjuk a jéggócok képződése céljából.

Amikor a jéggócok képeződéséről vizuálisan meggyőződtünk, a csöveket 0,5 °C/perc sebességgel -8 °Cról -35 °C hőmérsékletre hűtjük le. Ezen a hőmérsékleten tartjuk 45 percen át (hogy biztosítsuk az egységes, hidegindukált dehidratálást a sejtcsomók teljes átmérője mentén). Ebben az állapotban a sejtek elveszítik ozmotikus térfogatuk legnagyobb részét (vagyis kevés szabad víz marad a sejtekben), és ezek így biztonságosan belemárthatók folyékony nitrogénbe tárolás céljából. A sejtekben maradó szabad víz csekély mennyisége a gyors hűtési sebesség mellett -35 °C-ról -196 °C hőmérsékletre megakadályozza a nagy, szervezett jégkristályok kialakulását a sejteken belül. A sejteket folyékony nitrogénben tároljuk, amely hatékonyan immobilizálja a sejteket és lelassítja a metabolikus munkafolyamatokat egészen olyan mértékig, hogy a hosszú idejű tárolás ne legyen káros hatású.

A sejt közötti oldat felengedtetését úgy végezzük el, hogy a lefagyasztott csövet eltávolítjuk a folyékony nitrogénből, és kevertetjük 42 °C hőmérsékletű steril vízben mintegy 2 percen át. A csövet a meleg vízből eltávolítjuk, mihelyt a legutolsó jégkristály megolvadt, hogy megakadályozzuk a szövet felmelegedését. A sejtszuszpenziót (még a fagyvédő keverékben) szűrőre pipettázzuk, amely agarózon immobilizált BMS-sejtek (Maize DB ID 25818) rétegén nyugszik (ez az a táplálóréteg, amely segítőhatást biztosít a kinyerés során). A fagyvédő hígulása lassan megtörténik, ahogyan az oldat átdiffundál a szűrőn, és a tápanyagok felfelé diffundálnak a kinyerendő sejtekbe. Amikor a felengedtetett sejtek növekedése észlelhetővé válik, a növekedő szövetet friss tenyésztő tápközegre visszük át. A sejtcsomókat azután visszavisszük folyékony szuszpenziós tápközegbe, mihelyt a szükséges sejttömeget elértük (ez általában 1-2 héten belül megtörténik). Miután a tenyészetet újból kialakítottuk folyadékban (1-2 további hét alatt), ezt alkalmazzuk a transzformációs kísérletekhez. Amikor szükséges, az előzetesen már fagyasztással tartósított tenyészeteket újból lefagyaszthatjuk tárolási célból.

E) Exogén géneket tartalmazó DNS-szegrnensek

Amint korábban említettük, számos eljárás áll rendelkezésre a megfelelő DNS-szegmenseket valamely gazdasejtbe szállító DNS megalkotására, amely eljárások jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az itt alkalmazott vektorok általános konstrukciója a plazmid, amely tartalmaz valamely promotort, más szabályozóterületeket, struktúrgéneket és 3’-véget.

HU 218 465 Β

A bar gént kódoló DNS-szegmenseket hozunk létre a pDPG165 plazmidban való felhasználásra, amelyet a bialafoszrezisztencia-gén bevezetésére alkalmazunk befogadósejtekbe (lásd az 1A. és C. ábrát). A bar gént Streptomyces hygroscopicusból (ATCC 21705) klónozzuk (53.); ez úgy létezik, mint egy 599 bp-s Smal fragmentum a pIJ4101 plazmidban. Ezen gén kódolóterületének szekvenciája azonos a publikált szekvenciával (45.). Abból a célból, hogy a pDPG165 plazmidot megalkossuk, a pIJ4101-ből való Smal fragmentumot egy pUC19-alapú vektorba ligáljuk, amely tartalmazza a karfiol-mozaikvírus [Cauliflower Mosaic Vírus (CaMV)] 35S promotert (ez a pBI221.1-ből származik, amelyet Jefferson R., Plánt Breeding Institute, Cambridge, Anglia bocsát rendelkezésre), egy pUC 19 polilinkert, és a 7-átirat (Tr7) 3’-véget Agrobacterium tumefaciensből (91) (ezt a 3’-véget Stalker D., Calgene, Inc., Davis, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok, bocsátja rendelkezésre).

Ezekben a kísérletekben alkalmazzuk még a GUS-t kódoló pDPG208 vektort is (IB. és D. ábra). Ezt egy

2,1 kb-s, a pAGUSl-ből való BamHI/EcoRI fragmentum alkalmazásával alkotjuk meg (a pAGUSl-et Skuzeski J., University of Utah, Salt Laké City, Utah, Amerikai Egyesült Államok, bocsátja rendelkezésre); ez a nevezett fragmentum tartalmazza a GUS-t kódoló szekvenciát és a nos 3 ’-véget az Agrobacterium tumefaciensből. A pAGUSl-ben 5’ nemkódoló és 5’-GUSkódoló szekvenciái módosítva vannak a Kozak-konszenzusszekvencia (24.) építésével és egy új 6 bp-s HindlII restrikciós hely vezetésével a gén kódolóterületébe (lásd az 1E. ábrát). A pAGUSl-ből való 21 kb-s BamHI/EcoRI fragmentumot ligáljuk a pCEVl nevű, pUC19-alapú vektor (a Calgene, Inc., Davis, Kalifornia terméke) 3,6 kb-s BamHI/EcoRI fragmentumához. A pCEVl-ből való 3,6 kb-s fragmentum tartalmazza a pUC19-et, és tartalmaz egy 430 bp-s 35S promotort a karfiol-mozaikvírusból a kukorica-Adh 1-ből való első intron szomszédságában. A pCEVl vektort elő lehet állítani a karfiol-mozaikvírusból való 430 bp.S 35S promotor lizálásával a kukorica-Adh 1-ból való első intronhoz szomszédosán (68.).

Az R gén-komplex vonatkozásában a jelen találmányban való felhasználáshoz a legelőnyösebb vektorok tartalmazzák a karfiol-mozaikvírus 35S promotoiját, a kukorica-Adh 1-ből az első intront, a Kozak-konszenzusszekvenciát, az Sn:bol3 cDNS-t, és az Agrobacterium tumefaciensből a 7. átirat 3’-végét. Az egyik ilyen vektor, amelyet a feltalálók előállítottak, pDPG237 nevet kapott. Abból a célból, hogy előállítsuk a pDPG237et (lásd az 1F. ábrát), az Sn:bol3 cDNS-klónt Dellaporta S-től (Yale University, Amerikai Egyesült Államok) szerezzük be. Az Sn genomikus kiónját az Sn:bol3 genomikus DNS-éből izoláljuk, amelyet előzőleg teljességig emésztettünk HindlII-mal, ligáljuk lambda-karokkal és csomagoljuk in vitro. A klónozott R allélek két területéhez, az R-nj-hez és R-sc-hez (54) hibridizáló tarfoltokat restrikciós emésztéssel elemezzük. Megfelelő fragmentumot alkalmazunk egy olyan cDNSkönyvtár átvizsgálására, amelyet lambdában hoztunk létre az Sn:bol3 fénnyel besugárzott pikkelyes csomóinak RNS-éből. A cDNS-klón szekvenciáját és restrikciós térképét megállapítjuk.

A cDNS-klónt beiktatjuk ugyanabba a növényi kifejezővektorba, mint amelyet már leírtunk a pDPG165-tel és a bar kifejezóvektorral kapcsolatban (lásd fentebb); ez tartalmazza a karfiol-mozaikvírus 35S promotort, egy polilinkert és az Agrobacterium tumefaciensből való 7. átirat (Tr7) 3’-végét. Ezt a plazmidot, a pDPG232-t úgy állítjuk elő, hogy a cDNS-klónt a polilinkerterületbe iktatjuk be; a pDPG232 restrikciós térképét az 1G. ábrán mutatjuk be. Az előnyös vektort, a pDPG237-et úgy állítjuk elő, hogy a cDNS-klónt és a Tr7 3’-véget eltávolítjuk a pDPG-ből Aval-gyel és EcoRI-gyel, és ezt ligáljuk egy BamHI/EcoRI fragmentummal, amely a pDPG208-ból származik. A ligálást az alábbi BamHI kapcsoló jelenlétében végezzük.

GATCCGTCGACCATGGCGCTTCAAGCTTC

GCAGCTGGTACCGCGAAGTTCGAAGGGCT

A pDPG237 végső konstrukciója tartalmazza a karfiol-mozaikvírus 35S promotort, az Adhl első intronját, a Kozak-konszenzusszekvencíát, a BamHI kapcsolót, az Sn:bol3 cDNS-ét és a Tr7 3’-véget, amint ezt az 1F. ábrán bemutatjuk.

További vektorokat is készíthetünk standard genetikai manipulációs technikákat alkalmazva. így például megalkotjuk a pDPG 12 8-nak nevezett vektort, amely magában foglalja a neo kódolószekvenciát {neomicin foszfotranszferáz [APH(3’)-II]}. A pDPG128 plazmid tartalmazza a CaMV 35S promotorját, a neomicin foszfotranszferáz gént a Tn5-ből (66.) és a Tr7 terminátort az Agrobacterium tumefaciensből (91.). Egy másik vektor, a pDPG154 beépíti a kristályos toxingént és szintén standard technikákkal készül. A pDPG154 tartalmazza a 35S promotort, a Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD 263 kristályos toxinfehéijének a teljes kódolóterületét (92.) és a Tr7 promotort (99.).

Készítünk különböző tandemvektorokat is. így például egy bar/aroA tandemvektort alkothatunk meg olyan módon, hogy ligálunk egy tompa végű 3,2 kb-s DNS-fragmentumot - amely tartalmaz egy mutáns EPSP szintáz aroA kifejezőegységet (64) - az Ndelgyel hasított pDPG 165-höz, amelyet előzőleg tompa végűvé tettünk és defoszforileztünk (az Ndel bevezet egy egyedi restrikciós hasítást mintegy 200 bp-vel lefelé a barkifejező egység Tr7 3 ’-végétől). aroA-val bíró transzformánsokat azonosítunk mindkét orientációban a barhoz viszonyítva.

F) Előnyös eljárások a DNS beszállításához a sejtekbe

Egy előnyös DNS-szállítási rendszer, amely nem igényel protoplasztizolálást vagy Agrobacterium DNS-bevezetést, a mikrolövedékes bombázás (8.; 23.). A mikrolövedékes bombázásnak számos lehetséges celluláris célpontja lehet a termő transzgenikus növények előállításánál: pollen, mikrospórák, merisztémák és tenyész15

HU 218 465 Β tett embiogén sejtek lehetnek többek között erre példák. A csíravonal-transzformálást kukoricában még sohasem írták le ezen típusok egyikének bombázásával sem.

Az exogén DNS-konstrukciók növényi sejtekbe való bevezetésére szolgáló, újonnan felbukkant technikák egyike magában foglalja a mikrolövedékes bombázás alkalmazását. Ennek a technikának a részleteit és ennek felhasználását exogén DNS bevitelére különböző növényi sejtekbe az alábbi irodalmi helyek tárgyalják: Klein (1989), Wang és munkatársai (1988) és Christou és munkatársai (1988) (22.; 50.; 8.). A sejtekbe mikrolövedékes bombázással történő DNS-beszállítás hatékonyságának meghatározására az egyik eljárás a β-glükoronidáz (GUS) átmeneti kifejeződésének kimutatását alkalmazza a bombázott sejtekben. Ennél az eljárásnál növényi sejteket bombázunk olyan DNS-konstrukcióval, amely irányítja a GUS-enzim szintézisét.

Állnak rendelkezésre olyan berendezések, amelyek végbeviszik a mikrolövedékes bombázást. Kereskedelmi forgalomban van egy berendezés, amelyet a Biolistics, Inc. (most már DuPont) hoz forgalomba, de a találmány oltalmi körén belül vannak más mikrolövedékes vagy gyorsítási eljárások is. Természetesen más „génpuskák” is alkalmazhatók DNS bevezetésére a sejtekbe.

A feltalálók elvégezték a mikrolövedékes bombázás számos módosítását. így például rozsdamentesacélszita-szűrőket építünk be a bombázóberendezés zárólemeze alá, vagyis az „ágyú” és a sejtek közé. Ezenkívül a meglévő technikák olyan módosításait is kifejlesztették a feltalálók, amelyben a DNS-t rácsapják a mikrolövedékekre.

3. példa

Mikrolövedékes bombázás

A bombázáshoz morzsalékos, embriogén, II. típusú kalluszt (1) indítunk be éretlen embriókból lényegében ugyanúgy, ahogyan a fenti 1. és 2. példában leírtuk. A kalluszt N6 tápközegen (5) indítjuk be és tartjuk fenn, amely tápközeg tartalmaz 2 mg/1 glicint, 2,9 g/1 prolint, 100 mg/1 kazeinhidrolizátumot, 13,2 mg/1 dicambát vagy 1 mg/1 2,4-D-t, 20 g/1 szacharózt; a tápközeg pH-ja 5,8 és 2 g/1 Gelgróval (ICN Biochemicals) van megszilárdítva. Az ezekből a kallusztenyészetekből beindított szuszpenziós tenyészeteket alkalmazzuk a bombázáshoz.

Az SC82 esetében az SC82 szuszpenziós tenyészetét olyan II. típusú kalluszból indítjuk be, amelyet 3 hónapon keresztül tartunk fenn tenyészetben. SC82 sejteket (lásd az 1. példát) növesztünk folyékony tápközegben mintegy 4 hónapon át a bombázás előtt (lásd a 2. táblázat 1. és 2. kísérletét). Az SC82 sejteket fagyasztással is tartósítjuk 5 hónappal a szuszpenziós tenyészet beindítása után, fagyasztva tárolhatjuk 5 hónapon át, ami után felengedtetjük és bombázáshoz felhasználjuk (6. kísérlet).

Az SC716 szuszpenziós tenyészet esetében (lásd a

2. példát) ezt olyan II. típusú kalluszból indítjuk el, amelyet 5 hónapig tartunk fel tenyészetben. Az SC716 sejteket folyékony tápközegben tenyésztjük 5 hónapon át, fagyasztva tartósítjuk 8 hónapon át, felengedtetjük, és két hónappal később felhasználjuk a 4. és 5. bombázási kísérletben. Az SC94-et 10 hónapos II. típusú kalluszból indítjuk, és folyékony tápközegben tenyésztjük 5 hónapon át a bombázás előtt (3. kísérlet). Az SC94 más néven A188xB84, ahol a keresztezés B84 része Maize DB ID 47643 néven van elhelyezve.

A bombázás előtt a nemrégiben átoltott szuszpenziós tenyészet sejtjeit átszűqük és 1000 pm-es rozsdamentes acélszitán. A szitán áthaladó sejtcsomóffakcióból mintegy 0,5 ml tömörödött (becsomagolt) sejttérfogatot 5 cm-es szűrőkre pipettázunk (Whatman 4) és vákuummal szűrjük Büchner-tölcséren keresztül. A szűrőket átvisszük Petri-csészékre, amelyek 37 cm-es szűrőt (Whatman 4) tartalmaznak 2,5 ml szuszpenziós tenyésztő tápközeggel nedvesítve.

Az immobilizált sejtszuszpenziót befogadó szűrőket tartalmazó csészét 6 cm-re a lexonlemez alá helyezzük el, amely azt a célt szolgálja, hogy megállítsa a nejlon makrolövedéket. Ami a DNS-t illeti, amikor több mint egyetlen plazmidot alkalmazunk, a plazmid DNSt ekvimoláris arányban volfrámrészecskékre csapjuk (átlagos átmérő mintegy 1,2 pm, GTE Sylvania) a Klein és munkatársai által leírt (1987) munkamenet egyik módosított változatát alkalmazva. A módosított munkamenetben a volfrámot etanolban inkubáljuk 65 °C hőmérsékleten 12 órával azelőtt, mielőtt a kicsapáshoz felhasználnánk. A kicsapási keverék magában foglal 1,25 mg volfrámrészecskét, 25 pg plazmid DNS-t,

1,1 mol/1 CaCl₂-ot és 8,7 mmol/1 spermidint 575 pl össztérfogatban. Miután a komponenseket a fenti sorrendben hozzáadtuk, a keveréket Vortex keverőben kevertetjük 4 °C hőmérsékleten 10 percen át, centrifugáljuk (500xg) 5 percen át, és 550 pl szuszpenziót dekantálunk. A fennmaradó 25 pl szuszpenzióból 1 ples alikvotokat pipettázunk a makrolövedékekre a bombázáshoz.

A szuszpenziós sejtek mindegyik lemezét kétszer bombázzuk 9,36 -10³ Pa vákuumban. Az A188xB73 és A188xB84 embriogén szuszpenziók bombázásánál 100 pm-es vagy 1000 pm-es rozsdamentes acélszitákat helyezünk mintegy 2,5 cm-re a zárólemez alá abból a célból, hogy növeljük a gócok számát, ugyanakkor csökkentsük méretüket és csökkentsük a bombázott szövetek sérüléseit. A bombázás után a szuszpenziós sejteket és a támasztószűrőt szilárd tápközegre visszük át, vagy a sejteket lekaparjuk a szűrőről és újra szuszpendáljuk folyékony tenyésztő tápközegben.

Kukorica embriogén szuszpenziós tenyészeteiből való sejteket bombázunk a bárt tartalmazó pDPG165 plazmiddal önmagában vagy kombinálva a GUS-t kódoló pDPG208 plazmiddal (1. ábra). Azokban a kísérletekben, amelyekben GUS-plazmid is érdekelt, a bombázott sejteket tartalmazó szűrők közül kettőt hisztokémiailag megfestünk 48 órával a bombázás után. Az átmenetileg GUS-t kifejező gócok (sejtcsomók) teljes száma szűrőnként legalább 1000 darab. Két külön kísérletben, amelyek azt célozzák, hogy megbecsüljük az átmenetileg kifejező sejtek mennyiségét [SC82 (Al 88 χ B73) szuszpenziós tenyészetet alkalmazva], a GUS-festődő gócok szű16

HU 218 465 Β rőnkénti átlagos száma és a standard eltérés 1472±211, és 2930±(n=3, illetve 4). A sejtek száma GUS-t kifejező egyes gócokban átlagban 2-3 (1 és 10 közötti tartományban). Bár a hisztokémiai festést alkalmazhatjuk a GUS-t kódoló génnel transzformált sejtek kimutatására, ezek a sejtek a festés után már nem növekednek tovább és nem osztódnak. Arra a célra, hogy kimutassuk a stabil transzformánsokat és tovább növesszük ezeket például növényekké, olyan szelektív rendszer szükséges, amely az életképességgel összeférhető.

G) Eljárások transzformált sejtek azonosítására

Úgy véljük, hogy a DNS csak a sejtek nagyon kis százalékában vezetődik be mindegyik kísérletben. Abból a célból, hogy hatékonyabb rendszert nyújtsunk azoknak a sejteknek az azonosítására, amelyek befogadják a DNS-t, és genomjukban integrálják, valamely eszközt kell alkalmaznunk azoknak a sejteknek a szelektálására, amelyek stabilan transzformálódtak. Egy ilyen megoldásra példa lehet valamely olyan markergén bevezetése a gazdasejtbe, amely rezisztenciát ad át valamely szene, például antibiotikumra vagy herbicidre. A potenciálisan transzformált sejteket azután a nevezett szer hatásának tesszük ki. A túlélő sejtek populációjában vannak azok a sejtek, amelyek általában integrálták a rezisztenciaátadó gént, és ezt kifejezik olyan szinten, hogy túléljenek. A sejteket tovább vizsgálhatjuk az exogén DNS stabil integrálódásának igazolására. Embriogén szuszpenziós tenyészeteket alkalmazva mintegy 1/1000 átmenetileg kifejező góc gyakorisággal nyerünk stabil transzformánsokat. Ennek a munkamenetnek egy speciális kiviteli módját mutatjuk be az 5. példában.

A gabonafélék, például a kukorica transzformálásánál a nehézségek egyike egy hatékony szelektív szer hiánya a transzformált sejtekben a teljes hatású tenyészetekből (36). Stabil transzformánsokat nyernek ki a bombázott nem embriogén fekete mexikói édes (BMS)-kukorica szuszpenzióstenyészet-sejtekből a neo gén alkalmazásával és a kanamicin aminoglükoziddal végzett szelekcióval (22). Ez a megközelítés csak korlátozott lehetőséget nyújt, mivel sok egyszikű érzéketlen aminoglükozidoknak még nagy koncentrációira is (12.; 19.). A sejtnövekedés stádiuma, az antibiotikumnak kitevés időtartama, az antibiotikumok koncentrációja mind kritikusak lehetnek az aminoglükozidok mint szelektív szerek sikeres alkalmazásánál a transzformánsok azonosításához (26.; 51.; 52.). Ezenkívül az aminoglükozidok, mint a kanamicin vagy a G418, alkalmazása a stabil transzformánsok szelektálására embriogén kukoricatenyészetekből a feltalálók tapasztalatai szerint gyakran eredményezi olyan rezisztens kalluszok izolálását, amelyek nem tartalmazzák a neo gént.

Az egyik herbicid, amelyet javasoltak a rezisztenciatanulmányokban, a széles spektrumú bialafoszherbicid. A bialafosz egy tripeptidantibiotikum, amelyet a Streptomyces hygroscopicus termel és foszfinotricinből (PPT) - amely az L-glutaminsav analógja -, valamint két alaningyökből áll. Az L-alaningyökök eltávolításakor intracelluláris peptidázok segítségével a PPT felszabadul, ez pedig a glutamin szintetáz (GS) lehetséges inhibitora; ez az enzim az ammóniaasszimilációban és a nitrogénmetabolizmusban érdekelt kulcsenzim (33). A GS gátlása a PPT-vel növényekben az ammónia gyors felhalmozódását és a növényi sejtek pusztulását idézi elő.

A bialafoszt termelő organizmus szintetizál egy enzimet is, a foszfinotricin acetil transzferázt (PAT), amelyet a bar gén kódol. A foszfinotricin acetil transzferázt (PAT) kódoló herbicidrezisztencia-gén alkalmazását ismerteti a 3642 829 A számú német szabadalmi közrebocsátást irat, ahol a gént Streptomyces viridochromogenesből izolálják. Ez az enzim acetilezi a PPT szabad aminocsoportját, és így megakadályozza az autotoxicitást (45.). A bar gént már klónozták (29., 45.) és kifejezték transzgenikus dohány-, paradicsom- és burgonyanövényekben (10.), valamint Brassica-félékben (11.). Korábbi beszámolók szerint bizonyos transzgenikus növények, amelyek kifejezik a rezisztenciagént, teljesen rezisztensek a kereskedelmi PPT-re és bialafoszra az üvegházakban.

A WO 87/00141 számú PCT szabadalmi közrebocsátást irat utal egy eljárás alkalmazására a növényi sejtek és növények védelmére a glutamin szintetáz inhibitorok tevékenysége ellen. Ez az irat utal egy olyan eljárás alkalmazására is, amelyben herbicidrezisztenciát fejlesztenek ki meghatározott növényekben. A BASTA herbicidre (Hoechst foszfinotricin) vagy a Herbiacere (Meiji Seika bialafosz) rezisztenciát kódoló génről írták le, hogy bevezették Agrobacterium-fertőzés segítségével dohányba (Nicotiana tabacum cu Petit Havan SRI), burgonyába (Solanum tuberosum cv Benolima) és paradicsomokba (Lycopersicum esculentum), és így a növényeknek rezisztenciát adtak át a herbicidek alkalmazásánál.

Azokra a vektorokra, amelyek képesek DNS-t szállítani növényi gazdasejtekbe, példa lehet a pDPG165 plazmid. Ezt a plazmidot az 1A. és IC. ábra mutatja be. Ennek a plazmidnak nagyon fontos alkotórésze a genetikai transzformálás céljaira a bar gén, amely markerként működik a transzformált sejtek szelektálásához.

4. példa

A bar transzformánsok szelektálása bialafosz alkalmazásával

A kiindulási kísérletekben (lásd a 3. példát) alkalmazott szuszpenziós tenyészet (amelyet SC82-nek nevezünk) az A188xB73 embriogén II. típusú kalluszból származik. A bombázást követően (lásd a 3. példát) a szűrőn lévő sejteket újraszuszpendáljuk nem szelektív folyékony tápközegben, 1-2 héten át tenyésztjük, és átvisszük 1 vagy 3 mg/1 bialafoszt tartalmazó szilárd tápközeget felülrétegező szűrőre. A szövetnövekedés gátlása a szelekció során függ a sejtek sűrűségétől a szűrőn és az alkalmazott bialafoszkoncentrációtól. A szélesztett sűrűségnél (0,5 PVC/szűrő) az 1 mg/1 bialafoszon tenyésztett sejtek növekedése csak részben gátolt (a nem szelektált növekedés ~30-50%-a), és 3-4 hét múlva ezen szövet egy részét átvisszük elkülönült csomók (~5 mm átmérő) formájában azonos tápközegre. A 3 mg/1 bialafoszt tartalmazó tápközegen a sejtek növekedése az eredeti szelekciós szűrőn erősen gátolt (a nem

HU 218 465 Β szelektált növekedés mintegy 10%-a), és a szelekciót úgy végezzük, hogy a szövetet nem távolítjuk el az eredeti szűrőről.

Bármelyik szelekciós munkamenetet alkalmazzuk (1 vagy 3 mg/1 bialafosz), rezisztens sejttelepek bukkannak fel mintegy 6-7 héttel a bombázás után a pDPG165-tel bombázott SC82 szelekciós lemezeken (2A. ábra). Bialafoszrezisztens kalluszokat tartunk fenn és terjesztünk szét szelekciós tápközegen. Ezen szövetek jó része embriogén (2B. ábra). Nincs telepnövekedés azokon a lemezeken, amelyekhez olyan szuszpenziós tenyészetekből való sejteket adunk, amelyeken nem történtek transzformációs próbálkozások. Ezek a kontrollok, amelyek igazolják azt a várt hatást, hogy a bar gén nélküli sejtek nem rezisztensek bialafoszra.

A szilárd támasztóanyagon a telepek úgy láthatók mint sejtek csoportjai, amelyek az ilyen szilárd támasztóanyagon szélesztett sejtek növekedésével és osztódásával alakulnak ki. A telepek a 2A. ábrán láthatók Petricsészében. Ezen az ábrán a növekedésre képes sejtek azok, amelyek rezisztensek a bialafoszherbicid jelenlétére, ahol az említett rezisztencia a bar gén integrálásának és kifejezésének eredménye. A sejteket 1 mg/l-ig terjedő bialafoszkoncentrációknak tesszük ki. A 2B. ábra egy szelekciós tápközegen fenntartott bialafoszrezisztens tenyészet morfológiáját mutatja be, jelezve, hogy a növekedés embriogén.

Annak igazolására, hogy a telepeket formáló, 2. ábrán bemutatott sejtek valóban beépítik a bar gént és kifejezik azt, bialafoszrezisztens kalluszvonalakat elemzünk a bar géntermék, a foszfinotricin acetil transzferáz (PAT) aktivitására vékonyréteg-kromatográfiával. Az SC82 bombázási kísérletekből izolált 11 kalluszvonalból (El-11) való fehérjekivonatot tartalmaz PAT-aktivitást, amint ezt a 3. ábrán bemutatjuk, és az aktivitási szintek az izolátumok között mintegy tízszeres szintig eltérően váltakoznak.

A bar gén jelenlétének további és közvetlenebb igazolását a lehetséges transzformánsok genomikus DNSének elemzésével kapjuk meg, DNS-gélfoltok segítségével (4. ábra). A DNS-ek, amelyeket elektroforézisnek vetünk alá a gél mentén, forrásai az El -11-nek nevezett bialafoszrezisztens kalluszvonalak, és egy nem szelektált kontroll, az EO. (Az 1. ábra jelzi az enzimek hasítási helyeit a bar gén-plazmidon belül). Miután a DNS-t elektroforézisnek vetettük alá a gél mentén és átvittük nejlonmembránokra, az így létrejövő foltot hibridizáljuk a pDPG165 plazmidból való ³²P-jelzett bar gén-szekvenciával. A foltonként kapott radioaktivitás 25 10⁶ Cerenkov-beütés/perc. A 4. ábrán „l” és „5” kópiával jelzett vonal 1,9, illetve 9,5 pg 1,9 kb-s barkifejező egységet tartalmaz, amelyet a pDPG165 plazmid bocsát ki EcoRI és HindlII enzimek alkalmazásával; ezek a mennyiségek mintegy 1, illetve 5 kópiát képviselnek diploid genomonként.

Mind a 11 bialafoszrezisztens izolátumból való genomikus DNS tartalmaz barral hibridizáló szekvenciákat, amint ezt a 4. ábrán bemutatjuk. Hibridizálás történik mindegyik izolátumban egy olyan fragmentumhoz, amely valamivel jobban vándorol, mint a 2 kb-s fragmentum, és ez valószínűleg az ebben a barvizsgáló minta (próba)-készítményben található szennyező pUC19 szekvenciáknak tulajdonítható; ilyen hibridizálás nem fordul elő ezt követő kísérletekben, ugyanazt a genomikus DNS-t és a barvizsgáló minta eltérő készítményét alkalmazva. A hibridizálás egy 1,9 kb-s fragmentumhoz 11 izolátum közül 8-ban azt jelzi, hogy ezek az izolátumok az 1,9 kb-s barkifejező egység ép kópiáit tartalmazzák. Az ép egység becsült kópiaszáma 1 vagy 2-től (El, E7, E8, E10, Eli) mintegy 20-ig terjedhet (E3, E4, E6). A hibridizálás a barvizsgáló mintával az E2 és E5 izolátumokban csak egy egyedi, nagy molekulatömegű fragmentumnál (~3 kb) történik meg.

Abból a célból, hogy megállapítsuk: a PAT-kódolószekvencia ép az E2 és E5 izolátumokban, genomikus DNS-t emésztünk Smal-gyel, amely egy 559 bp-s a PAT-struktúrgént tartalmazó fragmentumot szabadít fel, és ezt DNS-folt-elemzésnek vetjük alá, ³²P-jelzett bárt alkalmazva. Ez az elemzés igazolja a bar egy egyedi ép kópiájának jelenlétét. A PAT kifejeződése ezekben az izolátumokban valószínűleg nem függ a 35S promotortól vagy a Tr7 3’-végtől. Néhány izolátum hibridizációs képei azonosak (E2 és E5; E7 és E8; E3, E4 és E6); ennélfogva valószínű, hogy bizonyos izolátumok nem független transzformációs eseményekből jönnek létre, hanem olyan transzformánsokat képviselnek, amelyek a szelekció során különülnek el.

hibridizációs kép egyedi, így valószínűleg hét független egysejt-transzformációs eseményt képvisel. A hét transzformánsnál a hibridizálás képei és intenzitásai változatlanok négy hónapos tenyésztés során, így nyújtva bizonyítékot az integrált szekvenciák stabilitására. A hét független transzformáns két eltérő bombázási kísérletből származik. Négy független transzformánst, amelyek az E2/E5, E3/E4/E6, El és E7/E8 izolátumokat képviselik, összesen négy eredeti szűrőről nyerjük ki az 1. bombázási kísérletből, és a három független transzformánst, az E9-et, E 10-et és Ell-et a 2. kísérletben szereplő 6 bombázott szűrőből eredő szövetből szelektáljuk. Ezeket az adatokat a 2. táblázatban foglaljuk össze.

2. táblázat

A kukoricatranszformálási kísérletek összefoglalása

A kísérlet száma	A bombázott tenyészet	A bombázott szűrők száma	A kinyert független bar transzformánsok száma	Ép bar kifejezőegyscgekkel	GUS kó- dolószek- vcnciával	GUS aktivitással	Együttinteg- rálódási gyakoriság	Együttkife- jezési gyakoriság
1.	SC82	4	4	3	n. a.
2.	SC82	6	3	2	n. a.

HU 218 465 Β

2. táblázat (folytatás)

A kísérlet száma	A bombázott tenyészet	A bombázott szűrők száma	A kinyert független bar transzformánsok száma	Ép bar kifejezőegyscgckkel	GUS kódolószekvenciával	GUS aktivitással	Együttinteg- rálódási gyakoriság	Együttkife- jezési gyakoriság
3.	SC94	10	8	6	n. a.
4.	SC716*	8	13	8	11	3	85	23
5.	SC716*	8	7	4	6	1	86	14
6.	SC82*	4	19	17	13	3	68	16
Össze- sen		40	54	40	30	7	77 (30/39)	18 (7/39)

* tenyészet fagyasztva tartósított sejtekből újraindítva.

n. a.: nem alkalmas; csak pDPG165 DNS-t alkalmaztunk, vagy együtt-transzformálási elemzést nem végeztünk.

A más embriogén szuszpenziós tenyészetekkel végzett tanulmányok hasonló eredményeket mutatnak. Akár SC82 tenyészetet alkalmazunk, amelyet fagyasztva tartósított sejtekből indítunk újra (6. kísérlet), akár A188xB84 (SC94) szuszpenziós tenyészetet alkalmazunk, számos független transzformánst nyerünk ki (18., illetve 19.; 2. táblázat). Az összes transzformánsok tartalmazzák a bar gént és PAT-ot fejeznek ki. A barral hibridizáló szekvenciák kópiaszáma és a PAT-kifejeződés szintje a fentebb leírt tanulmányok eredményeihez hasonló.

5. példa

A bar gén integrálódása az SC716 szuszpenziós tenyészetből származó sejtvonalakba

Bombázási tanulmányokat és ezt követő elemzést végzünk az A188 χ B73 szuszpenziós tenyészetben, amelyet SC716-nak nevezünk (lásd az 1. példát). A létrejött transzformált növényi sejteket elemezzük a bar gének integrálódására. Ennek az elemzésnek a kivitelezése érdekében genomikus DNS-t nyerünk ki az R1-R21 izolátumokból; 6 pg DNS-t emésztünk EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal, és DNS-gélfolt-elemzést hajtunk végre, vizsgálómintaként (próbaként) a bar gént alkalmazva. A 9. ábrán szerepelnek a molekulatömegek is a jobb és a bal oldalon. A nem transzformált kontrollt „R0”-val jelöljük, és jobb oldalon az utolsó oszlop a bargénkifejező egység két kópiájának ekvivalensét tartalmazza diploid genomonként. Az alkalmazott DNS-terhelésnél két kópia barkifejező egység diploid genomonként 5,7 pg 1,9 kb-s EcoRI/HindlII fragmentumnak felel meg a pDPG165 plazmidból. A gélfolton elkülönített DNS-t ³²P-jelzett barvizsgáló mintához hibridizáljuk. A jelzési aktivitás a hibridizálásban mintegy 10· 10⁶ Cerenkov-beütés/perc. Az A-ban egy ép barkifejező egység jelenléte a barvizsgáló minta hibridizálásából következik egy 1,9 kb-s csíkhoz a gélen.

6. példa

Vizsgálatok a GUS integrálódására és kifejezésére

Az 5. példában tárgyalt SC716 transzformánsokat tovább elemezzük a GUS-t kódoló gén integrálódására és kifejezésére. Amint ezt hisztokémiai vizsgálattal meghatározzuk, az SC716 transzformánsok közül négynek (R5, R7, R16 és R21) van kimutatható aktivitása 3 hónappal a bombázás után. A négy, együttkifejező kalluszvonalban megfigyelt kifejezési minták változók. A GUS-aktivitással bíró sejtek száma bármelyik mintaként megfigyelt transzformánsban a ~5% és -90% közti tartományban van, és a GUS-aktivitás szintje ezeken a sejteken belül is változó. Az együttintegrálódási frekvenciát úgy határozzuk meg, hogy a barral hibridizált genomikus foltot (9A. ábra) mossuk és átvizsgáljuk ³²P-vel jelzett GUS-szekvenciával, amint ezt a 9B. ábrán bemutatjuk. Az EcoRI és a HindlII, amelyek kimetszik a barkifejező egységet a pDPG 165-ből, a pDPG208-ból kibocsátanak egy GUS-kódoló szekvenciát és egy nos 3’-véget tartalmazó 2,1 kb-s fragmentumot (IB. ábra).

független bar transzformáns tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek hibridizálódnak a GUS-vizsgáló mintához; három viszont - R2, R14 és R19 - nem hibridizálódik. Azok a transzformánsok, amelyekben GUS-aktivitás mutatható ki (R5, R7, R16 és R21), a

2,1 kb-s, GUS-struktúrgént tartalmazó EcoRI/HindlII fragmentum ép kópiáival bírnak (9B. ábra). Az olyan transzformánsok, amelyek nagyszámú, barhoz hibridizáló fragmentumot tartalmaznak (Rl, R5, R21), hasonló számú olyan fragmentumot is tartalmaznak, amelyek a GUS-t kódoló génhez hibridizálnak (9A. és B. ábra). Ez a megfigyelés egybevág azzal, amelyet A188xBM5 protoplasztok PEG-gel közvetített transzformációjában alkalmazott független plazmidokkal kapcsolatban leírtak [Lyznik és munkatársai (1989)], és amelyet a jelen találmány feltalálói korábbi tanulmányaikban elvégeztek BMS szuszpenziós sejtek bombázással közvetített transzformálásával kapcsolatban.

H) Együtt-transzformálás

Az együtt-transzformálást olyan vektor alkalmazásával érjük el, amely tartalmazza a markert és tartalmazza az adott gént vagy géneket. Egy másik eljárás szerint a különböző vektorok, például plazmidok tartalmazhatják a különböző adott géneket, és ezeket a plazmidokat együtt szállítjuk be a befogadósejtekbe. Ennek az eljárásnak az alkalmazásával az a feltételezésünk, hogy a sejteknek, amelyekbe a markert bevezettük, bizonyos százaléka befogadja az adott gént vagy géneket is. Amint az ez után következő példákból láthatjuk, nem az összes olyan sejt, amelyet a marker segítségével sze19

HU 218 465 Β lektáltuk, fejezi ki a további adott géneket, amelyeket pedig egyidejűleg bevezettünk sejtekbe. így például a 7. példában sikeres együtt-transzformálás történt 17 esetben 20 független transzformálásból (lásd a 2. táblázatot), együttkifejeződés viszont csak 4 esetben alakult ki 20-ból. Bizonyos transzformánsokban a kifejezés váltakozó a transzformált sejtek között.

7. példa

A bar gén és a GUS-gén együttintegrálódása és együttkifejezése az SC82 szuszpenziós tenyészetből származó sejtvonalakban

A különböző plazmidokkal transzformált, fagyasztva tartósított SC82 újrabeindításából szelektált bialafoszrezisztens izolátumok közül 19 független transzformánst választunk ki ebben a kísérletben (6. kísérlet, 2. táblázat). Az együttintegrálódás és együttkifejeződés gyakorisága ezekben az izolátumokban hasonló ahhoz, amelyet az SC716 izolátumoknál leírtunk (2. táblázat). A GUS-festési minták ezekben a transzformánsokban hasonló módon változók, mint azokban, amelyeket az SC716 transzformánsok együttkifejezésénél leírtunk. Az egyik transzformáns, az Y13, amely ép GUS-kódoló szekvenciát tartalmaz, a GUS-aktivitás különböző szintjeit mutatja, amint ezt a 8. ábrán bemutatjuk. A kifejezési minták ilyen típusát már leírták az együtttranszformált BMS-sejteknél [Klein és munkatársai (1989)]. Az egyedi transzformánsból származó sejtekben kimutatott változó aktivitás a GUS szubsztrátuma nem egyenlő behatolásának tulajdonítható, vagy az eltérő kifejezésnek, metilezésnek, esetleg a gén hiányának bizonyos sejtekben.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy mind a bar gén, mind a GUS-gén jelen van bizonyos sejtekben, amelyeket az ezeket a géneket tartalmazó két plazmiddal bombáztunk. Az együtt-transzformálás tehát végbemegy. Az itt leírt együtt-transzformálási példákat a 2. táblázatban foglaljuk össze; a nem szelektált gének együtt-transzformálási gyakorisága 77%; az együttkifejezési gyakoriság 19%.

I) Növények regenerálása transzformált sejtekből

A mezőgazdaságban való felhasználáshoz a sejtek in vitro transzformálása csak egy lépés ezeknek az új eljárásoknak a kereskedelmi-ipari felhasználása felé. A transzformált sejtekből a növényeket regenerálni kell, és a regenerált növényeket teljes növényekké kell kifejleszteni, amelyek képesek termést hozni szabad földön. Erre a célra termő kukoricanövények szükségesek. Az itt bemutatott találmány a termő kukoricanövények első sikeres előállítását írja le transzformált sejtekből (lásd például a 11 A. ábrát).

Az egyik hatékony regenerálási rendszer magában foglalja az embriogén kallusz átvitelét MS [Murashige és Skoog (1962)] tápközegre, amely 0,25 mg/1 2,4diklór-fenoxi-ecetsavat és 10,0 mg/1 6-benzil-aminopurint is tartalmaz. A szöveteket ezen a tápközegen tartjuk 2 hétig, majd átvisszük olyan MS tápközegbe, amely nem tartalmaz hormonokat (Shillito és munkatársai, 1989). Azokat a hajtásokat, amelyek 2-4 héten belül kifejlődnek a hormonmentes tápközegen, átvisszük olyan MS tápközegre, amely 1% szacharózt is tartalmaz és meg van szilárdítva 2 g/1 Gelgroval; ez a tápközeg „Plánt Con” tárolóedényekben van, ahol a gyökérképződés végbemehet.

Egy másik sikeres regenerálási munkamenet magában foglalja az embriogén kallusz átvitelét két hétre NG tápközegre [Chu és munkatársai (1975)], amely tartalmaz még 6% szacharózt és nem tartalmaz hormonokat [Armstrong és Green (1985)], majd az átvitelt hormonmentes MS tápközegre, amint fentebb leírtuk. A regenerálást 25 °C hőmérsékleten végezzük fluoreszcens fény alatt (250 mikroeinstein m^-2· s^_1). Mintegy 2 hét múlva a kifejlődő palántákat átvisszük földbe, beültetjük növesztőkamrába (85% relatív nedvességtartalom, 600 ppm CO₂, 250 mikroeinstein m^-2^-¹), és érettségig növesztjük növesztőkamrában vagy üvegházban.

A növények regenerálása transzformált sejtekből minden részletében nagy gondosságot igényel, és a szövettenyésztő technikák pontos betartását. A fontosabb tényezők egyike a szövettenyésztő tápközegek kiválasztása. Számos tápközeg van, amely elősegíti a növényi sejtek növekedését szuszpenziós tenyészetekben, de egyes tápközegek jobb eredményeket adnak, mint mások a fejlődés különböző stádiumaiban. Ezenkívül különböző sejtvonalak különböző módon válaszolnak speciális tápközegekre. Tovább bonyolítja a helyzetet az, hogy a kalluszbeindításból való sejtek kezelése a transzformálás során, végül az üvegházban növényként kifejlődés során sokváltozós megközelítést igényel. Olyan, sokféle tápközegtípust magában foglaló munkamenet lehetséges, amelyben egymás után különböző tápközegeket alkalmazunk; ilyen módon optimalizálhatjuk a transzformáit növények arányát, amelyek az egyes sejtvonalakból kialakulnak. A 3. táblázat szövettenyésztő tápközegek kombinációinak egymás utáni alkalmazását mutatja be a sejtekhez a fejlődés különböző stádiumaiban. A sikeres folyamatot a regenerált növények teljes száma bizonyítja.

HU 218 465 B

3. táblázat

Növények az SC716-bombázásból (1., 2. kísérlet; 2. táblázat), földbe ültetve Regeneráló tápközegek sorozata

FÖLDBE ÜLTETETT NÖVÉ- NYEK SZÁMA	6* 34*	40*	♦ * * * * * * CN'trCTf-TfviOCOr-'CC 00 CM Tf	219*	40* 219* 259*
£t X> fi- — Γ'- — γί © r- o öl öl — —	X X	X	ΧΧΧΧοοοοοοοχο	o	X ο o
227b 177 101	X X	X	χχχχοοηχχχοχχ	CM	X π n
_D r- r«-> m — rj Ό r- ©	X X	X	οο — οοοχοοχοοχ	-	X ~
£> r- Ki m — r·) o o (Ν (N - -	X X	X	ο © —' —,οοοχχχοοχ	CM	X π n
r- — m — ΓΊ © Γ- © (N fS - -	X X	X	ΧΧ~Χ2°2ΧΧΧ'ΛΧΧ	© CM	θ' Os rS CM CM
227b 173 101	CM ΓCM	CN CM	XX-X^^-OOOO-O	OS F-	OS OS 00 CM C ©
X) Γ- VI — — CM © Γ-> © η n - -	X X	X	οοοο-ιοοχχχοοχ	-	X - -t
x> r- m — — gj © r- ©	X X	X	ΟΟΟΟΓ-ΟΧΟΟΧΟΟΧ	r^·	X <- t
X5 r-, η — — (Ν «Ί r- o CM — —	X X	X	οο-ι-ο^ιοοχοχοχχ	so	SD Ό
X) X> cm © r- © rj π - -	X X	X	χχ-χοοοχχχοχχ	-	X - -
227b 171 101		-	Υ'ΓΊνΊΝΧΓ'ΠΟΟΟ’ΤΟ'. Ο ΓΜ —· —	Os r-	—1 OS © -« Γ- OS
227b 101	X X	X	ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ.ΝΧΧ	CM	X cl rl
Scjtvonal	KONTROL- LOK A01C-11 A01C-01	ÖSSZESEN	Ο — nn'tfinN-cöO'O-^’to-ir^ fe S 1 1 1 ! 1 I 1 1 1 1 1 1 1 Εα'^υουυυυυυυυυυο ^^ooooooooooooo 3 <<<<<<<<<<<<< κ	ÖSSZESEN	EGYESÍTVE kontrollok transzformált összesen

X=Regenerálást ezen az úton nem kíséreltünk meg; *=Több növény is átvihető lett volna a földbe; 201b=201 1 mg/1 bialafosszal;

227b=227 1 mg/1 bialafosszal.

HU 218 465 Β

Látható, hogy tápközegek ugyanazon csoportját alkalmazva a sejtvonalak sikerességi aránya (a növények száma) váltakozó (3. táblázat). Bár itt is vannak változások a sikerességi arányban, összességében mégis az A01-15 vonal alakítja ki a legnagyobb számú növényt (meg kell jegyeznünk azonban, hogy mivel a rendelkezésre álló szövet korlátozott, a tápközegek nem minden kombinációját alkalmazhatjuk az összes sejtvonalra, így az általános összehasonlítás korlátozott értékű).

A sejtvonalakhoz való alkalmazásra egyik előnyös kiviteli mód általában - legalábbis a beindításnál - a 2. oszlopban bemutatott regenerálótápközegsorozatkombináció (227., 171., 101., 501. tápközegek). A 227. tápközeg jó tápközeg a kísérletek szelektív részéhez, például a kallusz növekedéséhez bialafosz jelenlétében. Ez a tápközeg dicambahormont tartalmaz. Más tápközegekben NAA és 2,4-D-hormonok találhatók. Folyékony tápközegekben ezek általában kapszulázva vannak szabályozott kibocsátás céljából.

így az 1. táblázatban látható, hogy a különböző tápközegek úgy vannak módosítva, hogy különösen alkalmassá tegyük ezeket a transzformált növények kifejlesztéséhez a transzformálási munkamenet különböző stádiumaiban. így például a sejtek altenyésztése a 171. tápközegben a szelektív szer alkalmazása után nagyon kis embriókat alakít ki. Ezenkívül úgy véljük, hogy a BAP jelenléte a tápközegekben megkönnyíti a hajtások kifejlődését. A mio-inozitról úgy véljük, hogy hasznos a sejtfal szintézisében. A hajtás megnyúlása és a gyökér kifejlődése az után következik be, miután a hajtást átvittük 101. tápközegbe. A 101. és az 501. nem tartalmaznak hormonokat, amelyek viszont a regenerálás korai stádiumaiban szükségesek.

A regenerálódó növények átvitele egy bizonyos agarral szilárdított tápközegre előnyösen teljessé teszi a folyamatot; ennek a tápközegnek az összetételét oldatban Clark fejlesztette ki (1982; 6. referencia), ez az 501. tápközeg. Ennek a tápközegnek az összetétele megkönnyíti a fejlődő növények megszilárdulását, hogy kiültetéssel átvihetők legyenek üvegházba a végső, növényként való növekedéshez. Ennek a tápközegnek a sókoncentrációja jelentősen eltér annak a három tápközegnek a sókoncentrációjától, amelyet a korábbi stádiumokban alkalmaztunk; ez a sókoncentráció kényszeríti a növényt, hogy kifejlessze saját metabolikus rendszerét. Ezek a lépések a független növekedés irányában még az előtt szükségesek, mielőtt a növényeket átvinnénk a szövettenyésztő edényekből (például Petri-csészékből, növényfejlesztő edényekből) az üvegházba.

A kiindulási SC82 és SC716 kísérletből származó transzformált kalluszvonalak mintegy 50%-a regenerálható a vizsgált munkamenetekkel. Hét független

SC82 transzformánsból négy transzgenikus növény és húsz független SC716 transzformánsból tíz transzgenikus növény regenerálódik.

Az SC716 13 független transzformált sejtvonalának és két kontrollvonalának regenerálását folytatjuk le. A 13 transzformánsból 10-nek a regenerálása sikeres. Bár összesen 458 palántát regenerálunk, időbeli és térbeli nehézségek miatt csak 219 transzformált növényt (amelyek a regenerált növények mintegy 48%-át képviselik) viszünk át foldmentes keverékbe (lásd később). 20 regenerálási munkamenetet vizsgálunk, és az egyes munkamenetekből regenerált növények számát menynyiségileg értékeljük (3. táblázat). Úgy tűnik, hogy nincs jelentős előnye annak, hogy a szövetet 201., 52., 163. vagy 205. tápközegeken érleljük a 171. vagy 173. tápközegre való átvitel előtt (a tápközegek származásával kapcsolatban lásd az 1. táblázatot). A növények többsége úgy alakul ki, hogy az embriogén kalluszt közvetlenül a 227.-ből visszük át altenyésztésre a 171.-be vagy 173.-ba. Ezek a növénykék gyökeret fejlesztenek ki anélkül, hogy exogén auxint adnánk hozzájuk; ezután a növényt foldmentes keverékbe visszük át, amely a legtöbb, SC82-ből regenerált transzformánsnál szükséges.

Az alkalmazott foldmentes keverék ProMixből, Micromaxból, Osmocote 14-14-14-ből és vermikulitból áll. A ProMix kereskedelmi termék, amelyet arra használnak, hogy növelje a termőképességet és a porozitást, valamint csökkentse a keverék tömegét. Az Osmocote szintén kereskedelmi termék, amely lassú kibocsátású műtrágya 14:14:14 nitrogén-foszfor-kálium aránnyal. A Micromax további kereskedelmi forgalomban levő műtrágya, amely tartalmazza az összes eszenciális mikrotápanyagot. A foldmentes keverék előállításához alkalmazott arány a következő: 84,9 liter ProMix, 45,4 liter vermikulit; 3,175 kg Osmocote; 46 ml Micromax. A földmentes keveréket kiegészíthetjük egy vagy két alkalommal valamely oldható Fe-vegyülettel, hogy csökkentsük az erek közti klorózist a csírázás és növénynövekedés korai szakaszában.

A transzformált SC82 szelektált sejtvonalak regenerálása 76 foldmentes keverékre átvitt növényt eredményez, ebből 73 túlél. A növényeket 6 bialafoszrezisztens izolátumból regeneráljuk, ezek a két, klónozásilag független transzformánsból négyet képviselnek. Tizennyolcféle munkamenetet alkalmazunk sikeresen a hetvenhat növény regenerálására (4. táblázat). A morfológiai különbségek a sejtvonalak között annak tulajdoníthatók, hogy bizonyos munkamenetek alkalmasabbak, mint mások a regeneráláshoz.

HU 218 465 B

4. táblázat

A tápközegek egymásutániságának hatása a regenerált növények számára (SC82*)

NÖVÉ- NYEK SZÁ- MA	©©©’-^OOOOOCN© CN CN	© r-
cq m — CN — — — CN © «Τ» C- © © Γ4 CN — — V»	xx-xxxxxxxx	-
CQ CQ _ _ oo — — cn © r- © © tS N — — VT	XXXXXXXXXX-	-
cq m cn ο © r- ο o N ÖJ öl - - Ά	X-XXXXXXXXX	-
CQ r- r-~ — — cn r- © © cn — — irt	XXXXXXXX-X	©
CQ CQ r-.--.ir)—,—,— CN © © Γ- © © CN (N (N — — va	X-XXXXXXXXX	-
CQ Γ- OO — — n r- o c rq — — ΙΓ»	^XXXXXXXXXX	V~i
CQ CQ r-- — m — — CN © Γ- © © cn cn — — ír»	XXrJXXXXXXXX	CN
CQ CQ ^ — — r*'» — ’— C4 © u- r~- © © cn cn — — — <n	χ xcχ χ χ χ χ χ χ X	©
CQ r*- cn — — — cn in r- © © CN —· — tn	c-lXXXXXXXXXX	CN
CQ 0- öl rA — - CN in r- © © rq — — V,	χ χ χ χ χ χ χ X X r·, ~	m
CQ U-NrA-Γ4 «ΖΊ Γ- © © cn — — in	-XXXXXXXX-X	m
CQ r- — cn — — CN Γ- r- © © cn — — — »n	—,—,ΧΧΧΧΧΧΧ — X	m
00 < r-r-cn’— — cn cn r- © © CN CN — — V»	X^XXXXXXXXX	Tt
CQ < CN CN © © © η η (N - ά	xxx-xxxxxxx	-
CQ < r-r-in — — cn cn © © © CN CN <N — in	X-XXXXXXXX-	CN
CQ CN Γ~- © © <N — —< tr»	2-xxxxxxxSx	00 CN
CQ r— m — —CN r-~ © © cn — — >n	XXXXXXXXX-r-,	Tt
CQ r-- cn — — CN Tt © © cn — — n	—xxxxxxxxxx	-
	Tt © r- © m <N —ι in ir> cn ·—' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 7 7 Ί ι ι ι ι ι ι ι mcncncncncnmcncnmcn fflCQCQCQCOCQCOCOfflCŰCŰ	ÖSSZE- SEN:

Wl o

£

C’J q © SP

C/3 o .22 — c on — 2 *-}!> ΓΊ =

Oű ε

•“2 ·<5 Γ- fII <

HU 218 465 Β

A regenerálás előtt a kalluszt átvisszük a.) N6-alapú tápközegre, amely dicambát vagy 2,4-D-t tartalmaz, vagy b.) MS-alapú tápközegre, amely 2,4-D-t tartalmaz. Ezek a lépések lehetővé teszik a további embrióid fejlődést az érettség előtt. Az érést segítő tápközeg magas BAP-szintet tartalmaz (5-10 mg/1), hogy fokozza a hajtás fejlődését és buijánzást idézzen elő. A regeneráláshoz nagyon hatékonynak találjuk azt az MS-alapú tápközeget, amelynek 2,4-D-szintje alacsony (0,25 mg/1) és BAP-szintje magas (10 mg/1); ezt a tápközeget Shillito és munkatársai írták le (1989).

Hasonló módon segíti ezen transzformánsok növénnyé regenerálódását az az MS-alapú tápközeg, amely 1 pmol/l NAA-t, 1 pmol/l IAA-t, 2 pmol/l 2-IP-t és 5 mg/1 BAP-t tartalmaz [ez Congor és munkatársai (1987) tápközegének módosítása]. Miután a regeneráló munkamenetek bármelyikével nyert palánták 5 cm-re megnőttek, ezeket átvisszük Gelgróval szilárdított tápoldatba, amelynek összetételét Clark írta le (1982). Azokat a palántákat, amelyek lassan fejlesztik gyökerüket, 0,3%-os IBA 3 μΐ-es cseppecskéivel kezeljük a hajtás tövénél a gyökérképezés stimulálására. A jól kifejlett gyökérrendszerrel bíró növényeket földmentes keverékre visszük át és szabályozott környezeti körülményeket biztosító kamrában növesztjük 5-10 napig, mielőtt üvegházba vinnénk át.

J) Vizsgálatok exogén DNS integrálódására és DNS kifejeződésére ffi-R/ növényekben

Találmányokat végzünk annak érdekében, hogy meghatározzuk a transzformált gének kifejeződését transzgenikus Ro és R_t növényekben. A PAT működési aktivitását úgy becsüljük meg, hogy egy PPT-tartalmú kereskedelmi herbicidkiszerelést alkalmazunk helyileg SC82 Rq és R, növények levelein. Nem figyelhető meg elhalás azonban az Ro leveleken, amelyek magas szinten (E2/E5) vagy alacsony szinten (E3/E4) tartalmaznak PAT-ot. A herbiciddel kezelt E3/E4/E6 és kontroli-leveleket a 10A. ábrán mutatjuk be. Herbicidet alkalmazunk a bárt kiválasztó E2/E5 utódlevelekre is. Amint a 10B. ábrából látható, a bárt kifejező Ej növények levelei nem mutatnak elhalást 6 nappal a herbicid alkalmazása után, míg a bar nélküli R | növények elhalásos károsodásokat szenvednek. Elhalás nem figyelhető meg a transzformált leveleken még 30 nappal a herbicid alkalmazása után sem.

Ro növényt, amelyek a négy regenerálható transzformáit SC82 kalluszvonal valamelyikét képviselik, elemzőnk a PAT bar géntermék kifejeződésére vékonyréteg-kromatográfiás technikákkal. A növények leveleiből való fehérjekivonatokat vizsgáljuk. Az 5. ábra bemutatja egy kalluszvonalból regenerált növény PATaktivitását.

Mind a 21 vizsgált növény tartalmaz PAT-aktivitást. Az aktivitási szintek hasonlók azokban a kalluszvonalakban található szintekhez, amelyekből a növényeket regeneráltuk. A nem transzformált növények nem mutatnak PAT-akti vitást (nincsen csík a várt acetilezett PPT-nek megfelelő helyen a PAT-kromatogramból kapott autoradiogramon). Egy csík tűnik fel a BMS-vonalban, amely nem jelenik meg a növénylevelekből kapott fehérjekivonatokat tartalmazó vonalakban. Ez a többletcsík véleményünk szerint valamely mesterséges termék.

Egy másik eljárásban annak igazolására, hogy a gének bejutottak a sejtekbe és integrálódtak, genomikus (kromoszomális) DNS-t izolálunk egy nem transzformáit növényből, a négy regenerálható kalluszvonalból és két Rq növényből, amelyek az egyes kalluszvonalakból származnak. A 6. ábra mutatja be a négy transzformáit kalluszból (C) és az ezekből származó Ro növényekből való genomikus DNS gélfoltelemzésének eredményeit. A transzformált kallusz és az összes transzformáit kalluszból regenerált növény tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek hibidizálnak a barvizsgáló mintához (próbához), olyan DNS-szekvenciák jelenlétét jelezve, amelyek a barral komplementerek. Ezenkívül a növényi DNS-ben megfigyelt összes hibridizációs eloszlás mind eloszlásban, mind intenzitásban azonos a megfelelő kallusz-DNS hibridizálási profiljaival.

Az E3/E4/E6 kalluszból ez a kívánt Rq növényekből való DNS mintegy 20 ép kópiát tartalmaz az 1,9 kb-s barkifejező egységből (karfíol-mozaikvírus 35S promotor-bar-Agrobacterium 7. átirat 3’-vég), tartalmaz továbbá egy sor egyéb, barral hibridizáló fragmentumot. Az E10 kallusz és az ehhez tartozó növények 1-2 kópiát tartalmaznak az ép barkifejező egységből. Az E2/E5 DNS egy egyedi, mintegy 3 kb-s fragmentumot tartalmaz, amely hibridizál a vizsgálómintához. Annak igazolására, hogy az összes növényben megfigyelt hibridizálószekvencia a kromoszomális DNS-ben van integrálva, az egyes független transzformánsokból egy-egy növény emésztetlen genomikus DNS-ét elemezzük DNS-gélfolt-hibridizálással. A barhoz hibridizálás csak nagy molekulatömegű DNS-ben figyelhető meg, ez nyújt bizonyítékot arra, hogy a bar integrálva van a kukoricagenomba.

Az együttkifejező Y13 kalluszvonalból növényeket regenerálunk (8. ábra). Az Y13-ból regenerált növényeket (6. kísérlet; 2. táblázat) megvizsgáljuk GUS-aktivitásra; az egyes növények hisztokémiailag festett levélszöveteit a 10C., D. és E. ábrákon mutatjuk be. Számos sejttípus, ideértve a hámsejteket, védősejteket, mezofil sejteket és nyalábsejteket, GUS-aktivitásra pozitív festődést mutat. A festődési intenzitás a legnagyobb az edénynyalábsejtekben. Bár a vizsgált regenerált növényekből való összes levélminta (5/5) kifejezi a nem szelektált gént, számos nem kifejező levélszektor is megfigyelhető. Megvizsgálunk levélszövet-kivonatokat három Y13 és három kontrollnövényből GUS-aktivitásra fluorometriás elemzéssel is [Jefferson (1987)]. A három vizsgált Y13 növény mindegyikében a két szembenálló levélben kimutatott aktivitás legalább 100-szor nagyobb, mint ez az aktivitás a kontrollnövények leveleiben.

8. példa

Általános eljárások a vizsgálatokhoz

A foszfmotricin acetil transzferáz (PAT)-aktivitás jelenlétének kimutatására alkalmas eljáráshoz vékonyréteg-kromatográfiát alkalmazunk.

HU 218 465 Β

Az ilyen kimutatásra az 5. ábrán mutatunk be példát, ahol különböző fehérjekivonatokat vizsgálunk PPT-vel és ¹⁴C-acetil-koenzim A-val végzett inkubálással; a nevezett fehéijekivonatok valószínűleg transzformált sejtek homogenizátumaiból és olyan kontrollsejtekből készülnek, amelyek nincsenek transzformálva és bialafoszszelekciónak nem voltak kitéve. Vonalanként 25 pg fehéijeextraktumot viszünk fel. Az El-Eli vonalakban a források SC82 transzformánsok; a B13 egy BMS (fekete mexikói édeskukorica, nem embriogén) bar transzformáns. Az E nem szelektált, nem transzformált kontroll.

Amint a nyíllal jelölt helynél látható (ez a hely, amely mozgékonyság alapján ¹⁴C-N-AcPPT-nek várható), a nem transzformált kontroll kivételével az öszszes vonalnak van aktivitása a megfelelő mozgékonysággal. A transzformánsok közötti változások elérik a tízszeres különbséget is, amint ez a csíkok relatív intenzitásából látható. Ennek a vizsgálatnak az eredményei a bar gén kifejezésének bizonyítását jelentik, amely gén a PAT-ot kódolja. A PAT-aktivitás elemzéséhez növényi szövetekben 100-200 mg levélszövetet extrahálunk zsugorított üveg homogenizálóban, és a korábbiak szerint megvizsgáljuk.

A GUS-aktivitást hisztokémiailag becsüljük meg, amint ezt Jefferson és munkatársai leírták (1987), vagyis 5-bróm-4-klór-3-indolil-glukuronid alkalmazásával; a szövet kék sejtekkel mintázódik 18-24 órával a szubsztrátum hozzáadása után. Fluorometriás elemzést is végezhetünk a Jefferson által leírtak szerint (1987), 4-metilumbelliferil-glükoronidot alkalmazva.

DNS-gélfolt-elemzést végzünk a következőképpen. Genomikus DNS-t izolálunk Shure és munkatársai (1983) eljárásának módosított változatát alkalmazva. Mintegy 1 g kalluszszövetet finom porrá őrölünk folyékony N₂-ben, mozsárt és mozsártörőt alkalmazva. A porított szövetet alaposan összekevetjük 4 ml extrakciós pufferral 7 mol/1 karbamid, 0,35 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 trisz.HCl (pH 8,0), 0,01 mol/1 EDTA, 1% szarkozin],

A szövetpuffer-homogenizátumot 4 ml fenol/kloroformmal extraháljuk. A vizes fázist centrifugálással elkülönítjük, Miraclothon keresztülbocsátjuk, és kétszer kicsapjuk 1/10 térfogat 4,4 mol/literes ammónium-acetát (pH 5,2) és azonos térfogatú izopropanol alkalmazásával. A csapadékot 70%-os etanollal mossuk és újraszuszpendáljuk 200-500 pl TE-ben [0,01 mol/1 trisz.HCl; 0,001 mol/1 EDTA (pH 8,0)]. Növényi szöveteket is alkalmazhatunk DNS izolálásához a fenti munkamenet alkalmazásával.

A genomikus DNS-t restrikciós enzimek háromszoros fölöslegével emésztjük, elektroforézisnek vetjük alá 0,8%-os agarózon (FMC), és átvisszük Nytranra (Schleicher and Schuell) [Southern (1975)] 10 χ SCP alkalmazásával (20xSCP: 2 mol/1 NaCl; 0,6 mol/1 dinátriumfoszfát; 0,02 mol/1 dinátrium-EDTA). A szűrőket előhibridizáljuk 65 °C hőmérsékleten 15 percen át olyan keverékben, amely 6xSCP-t, 10% dextrán-szulfátot, 2% szarkozint és 500 pg/ml heparint tartalmaz [Chomet és munkatársai (1987)]. A szűrőket egy éjszakán át hibridizáljuk 65 °C hőmérsékleten 6xSCP-ben, amely 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS-t és ³²P-vel jelzett vizsgálómintát (próbát) is tartalmaz. A pDPG165ből való, 0,6 kb-s Smal fragmentumot és a pCEV5-ből való, 1,8 kb-s BamHI/EcoRI fragmentumot alkalmazzuk a véletlenszerű beindító (priming)-reakciókhoz [Feinberg és Vogelstein (1983); Boehringer-Mannheim], hogy jelzett vizsgálómintákat alakítsunk ki a PAT-ot, illetve GUS-t kódoló szekvenciák kimutatására. A szűrőket 2xSCP-t és 1% SDS-t tartalmazó oldattal mossuk 65 °C hőmérsékleten 30 percen át, és autoradiográfíával tesszük láthatóvá Kodak XAR5 film alkalmazásával. A második vizsgálómintával való újrahibridizálás előtt a szűrőket 10 percen át forraljuk desztillált H₂O-ban, hogy az első vizsgálómintát eltávolítsuk, majd ugyanúgy előhibridizálunk, ahogy korábban leírtuk.

9. példa

Herbicidalkalmazás

Az alkalmazott Basta TX márkanevű herbicidkiszerelés 200 g/1 glufozinátot tartalmaz; ez a foszfinotricin ammóniumsója. Fiatal leveleket ecsetelünk 2%-os (térfogat/térfogat) Basta oldattal, amely 0,1% (térfogat/térfogat) Tween-20-at is tartalmaz. Az előírt alkalmazási arány ebből a kiszerelésből 0,5-1%.

A 10A. ábrán a Basta oldatot nagy területen alkalmazzuk (mintegy 4x8 cm) egy nem transzformált A188xB73 növény (baloldalt) és egy transzgenikus Ro E3/E4/E6 növény (jobboldalt) leveleinek közepén. A 10B. ábrán szintén Bastát alkalmazunk négy R, növény levelein; ezek közül két növény tartalmaz és két növény nem tartalmaz bárt. A herbicidet az R[ növényeken 1 cm-es körökben alkalmazzuk, egy-egy levélen négy helyen, a középső levélborda mindkét oldalán. Az alkalmazás után 6 nappal fényképeket készítünk.

K) A transzgenikus növények termőképessége

Abból a célból, hogy utódokat kapjunk, genetikailag transzformált kukoricanövényeket (amelyeket R^nak nevezünk) visszakeresztezünk magból származó nem transzformált növényekből gyűjtött pollennel, és olyan utódokat (amelyeket R,-nek nevezünk) nyerünk ki, amelyek tartalmazzák és kifejezik a bárt.

A találmány egyik fontos szempontja alapján első ízben állítunk elő termő, genetikailag transzformált kukoricanövényeket (Ro) és utódokat (Rj). Ezeket transzformáit embriogén sejtekből regeneráljuk. R, növénynek azokat a növényeket nevezzük, amelyek Ro növények visszakeresztezésének eredményeként alakulnak ki.

A transzgenikus Ro virágzat beporzása nem transzformált B73 pollennel csövek kifejlődését eredményezi. Ezenkívül csövek fejlődnek ki nőivarú virágokból is olyan hím virágzatokon, amelyek nem transzformált B73 pollennel vannak beporozva. Az SC82-ből való transzformált Ro növényeken a csövek normálisan fejlődnek mintegy 10-14 napig a beporzás után, de ez után az időpont után a csövek a növekedést beszüntetik és gyakran összezsugorodnak. Ekkor a legtöbb növény idő előtti elöregedést mutat. Összesen 153 cső fejlődik ki elszórtan a sok növényen (lásd az 5. táblázatot): a 37 E2/E5 növényen 8, a 22 E10 növényen 2 és a 6 Eli növényen 3. Élő utódokat nyerünk embriókiszabadítással 11 E2/E5 növényből és 1 E10 növényből.

HU 218 465 Β

5. táblázat

Regenerált növények (R_o) és utódok (R_t)

A kísérlet száma	A bombázott tenyészet	A kinyert független bar transzformán- sok száma	A regenerálható transzformáit kalluszvo- nalak száma	Az Ro növények száma	Az érettséget elérők száma	A csöveket kialakító R() növények száma	A kapott csövek száma	Az R, növények száma
1,2.	SC82	7	4	76	73	23	153	40
4,5.	SC716	20	10	219	(35)	(9)	(51)	(31)
3.	SC94	8	2a	lla	(0)	(0)	(0)	(0)
6.	SC82	19	4a	23“	(0)	(0)	(0)	(0)

^a A regenerálás folyamatban van.

() A kísérletek még folyamatban vannak, az adatgyűjtés folyik.

SC16 Rq növényeket is keresztezünk vissza mageredetű B73 növényekkel. Jelenleg 35 érett SC716 R₍₎ növényből 9 növény (amelyek négy független kalluszvonalat képviselnek) 51 csövet alakít ki, amelyek közül 31 alakít ki életerős Rj palántákat (5. táblázat). A legtöbb cső, amely SC716 növényeken fejlődik ki, nem igényel embriókiszabadítást. A csövek gyakran 30-40 napig fejlődnek a növényen, és közülük néhányat földben csíráztatunk ki. A további magokat MSalapú tápközegen csíráztatjuk ki, hogy megfigyelhessük a csírázást, és ezeket csak néhány nap múlva visszük át a földbe. Az SC716 Rj, növényeknél megfigyelt javított csőfejlődésen (az SC716 Rq növényekhez viszonyítva) kívül pollen hasad ki számos SC716 növény portokjából, és ebből a pollenból bizonyos menynyiséget in vitro csíráztatunk [Pfahler (1967)]. Az idegen gén átvitele végbemegy mind az SC716 R, virágzatok révén, mind az SC716 R, eredetű pollen alkalmazásával nem transzformált virágzatokon.

A transzformált Rj növényekből kapott pollent sikeresen alkalmazhatjuk B73 virágzatok beporzására, így nagyszámú magot nyerünk ki (lásd a 1 IC. ábrát). Az Rj növényből származó transzformált virágzat nem transzformáit, beltenyésztett növényből származó pollennal való keresztezését mutatjuk be a 11D. ábrán. Az Rj generáció termékenységi jellemzőit igazoljuk mind abból a szempontból, hogy a pollen képes megtermékenyíteni a nem transzformált virágzatokat, mind abból a szempontból, hogy az Rj virágzatok képesek megtermékenyülni nem transzformált növények pollenjével.

10. példa

Transzformált R_o növények utódjainak (R_t) elemzése PAT-ra és bárrá

E2/E5 növényeknek összesen 40 utódját elemezzük PAT-aktivitásra; ezek közül tizet mutatunk be a 7A. ábrán. 36 vizsgált utódból 18-nak van PAT-aktivitása. Ugyanabból a 10 utódból, amelyet PAT-aktivitásra elemeztünk, genomikus DNS-t elemzünk DNS-gélfolt-hibridizálással bar jelenlétére, amint ezt a 7B. ábrán bemutatjuk. A vizsgált, PAT-ot kifejező 6 utód egy kópiabart tartalmaz, amely mozgékonyság alapján azonos azzal, amelyet a kalluszban és az R^ növényben mutatunk ki; a vizsgált 4 PAT-negatív utód nem tartalmaz bárral hibridizáló szekvenciákat. A vizsgálatok egyik sorozatában a bar géntermék jelenléte 36 utód közül 18-ban az E2/E5 R_ű növényekben talált bar egyedi kópiájának 1:1 arányú regenerációját jelzi, amely egybevág a PATkifejezés mint egyedi domináns jellemző öröklődésével. Az öröklődés domináns típusa jelezheti legalább egy kópia PAT-ot kódoló gén jelenlétét a növényben. Az E10 E_o növényből kinyert egyedi utód vizsgálata pozitív eredményt ad PAT-aktivitásra.

Megállapítható, hogy a találmányban leírt eljárás transzformált Rq és Rj növényeket eredményez, amelyek működőképesen aktív PAT-ot termelnek. Ezt Basta (PPT) alkalmazásával határozzuk meg a növények levelein, meghatározva, hogy lép-e fel elhalás (szövetpusztulás), amely ennek az alkalmazásnak az eredménye. Ha a növények termelnek működőképesen aktív PAT-ot, a levélszövet védett lesz az elhalástól. Nem figyelhető meg elhalás olyan R_o növényeken, amelyek magas szinten fejeznek ki PAT-ot (E2/E5), de olyan növényeken sem, amelyek alacsony szinten fejeznek ki PAT-ot (E3/E4/E5) (10A. ábra).

Herbicidet alkalmazunk bárt szegregáló R, utódokra is. Ezekben a tanulmányokban elhalás nem figyelhető meg azokon az Rj növényeken, amelyek tartalmaznak és kifejeznek bárt; megfigyelhető azonban elhalás azokon a növényeken, amelyekből hiányzik a bar gén. Ezeket az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be.

A bar szegregációja nem gyakorol befolyást a változatosságra az R, növények fenotípusos jellemzőiben, például a növény magasságában és a címer morfológiájában. A 9B. ábrán a jobb oldalon levő növény tartalmaz bárt, míg a bal oldalon levő növény nem. A legtöbb Rj növény életerősebb, mint az R_o növények.

Az eddig az SC716 transzformánsokból kinyert 23 Rj palánta közül 16-nak van PAT-aktivitása. Az R18 kalluszsejtvonalat képviselő R^ növényekből való 10 utódból 4-ben, és az R₉ kalluszsejtvonalat képviselő R₍₎ növényekből való 6 utódból 6-ban mutatható ki PAT-aktivitás.

L) Embriókiszabaditás

Azokban az esetekben, ahol emberiókiszabadítás szükséges, a fejlődő embriókat kimetsszük a felületükön fertőtlenített csövekből 10-20 nappal a beporzás után, és olyan tápközegen tenyésztjük, amely tartalmaz MS-sókat, 2% szacharózt és 5,5 g/1 Seakem agarózt. Nagy embriók (>3 mm) alakulnak ki közvetlenül a fen26

HU 218 465 Β tebb leírt tápközegen. A kisebb embriókat mintegy 1 hétig tenyésztjük a fenti tápközegen, amely még 10~⁵ mol/1 abszcizinsavat is tartalmaz, és átvisszük csírázás céljából hormonmentes tápközegre. Számos embrió bakteriálisán fertőzötté válik; ezeket az embriókat átvisszük olyan tápközegre, amely 300 pg/ml cefoxitint is tartalmaz. A fejlődő növényeket ezután úgy kezeljük, amint ezt az Rq növények regenerálásánál leírtuk.

11. példa

Embriókiszabadítás

Élő utódokat, amelyeket hét SC82 E2/E5 növényből és egy SC82 E10 növényből nyerünk, embriókiszabadítással hozunk létre. Ez az eljárás az embriók kimetszéséből áll olyan csövekből, amelyek Rq növényeken fejlődnek ki. Az embriók hosszmérete a 0,5 és 4 mm közti tartományban van. A kis embriókat érlelő tápközegen tenyésztjük, amely abszcizinsavat is tartalmaz, míg a nagyobb embriókat közvetlenül a csíráztató tápközegen tenyésztjük. A mintegy negyven, az SC82 Rq növényből ilyen módon kinyert élő utódból kettőt mutatunk be a 1 IB. ábrán.

M) A transzgenikus növények fenotípusa

Az SC82 transzformánsokból regenerált Rq növények legnagyobb része A188xB73 hibrid fenotipust mutat. A növények magasságban hasonlóak a magról származó A188 növényekhez (92-153 cm), de B73 jellemvonásai vannak, például antocianinfelgyülemlés a szárakban és a támasztógyökerekben, és a függőlegesen álló levelek jelenléte. Több növény - tekintet nélkül a kalluszvonalra, amelyből regenerálódott - fenotípusos rendellenességeket mutat, ezek közé értve a levélhasadást, a villaszerűén elágazó leveleket, a csomónkénti többszörös virágzatot és a durva kukoricahajat. Bár sok fenotípusos jellemző közös az összes Rq növényben, bizonyos jellemzők egyediek azokban a növényekben, amelyek speciális kallusznövényekből vannak regenerálva. Az ilyen jellemzők kimutathatók, tekintet nélkül a választott regenerálási útra és a regenerálás során a tenyészetben eltöltött időre.

A nem transzformált kontrollnövények nem regenerálódnak ebből a tenyészetből, és ezért nem hasonlíthatók össze fenotípusosan. Nőivarú virágok fejlődnek ki egy Eli (1/6), több E10 (3/22) és csaknem 1/3-nyi E2/E5 (17/37) növény címerén, címerenként 3 és mintegy 20 közötti magkezdeménnyel. A legtöbb E2/E5, E10 és El 1 növényen gyakran fejlődnek ki primer és szekunder virágzatok; a 11 A. ábrán egy érett E2/E5 növényt mutatunk be. Az SC82 transzformánsokból regenerált növények címéréből ritkán emelkednek ki portokok, és a korlátozott számú portokok, amelyek mégis kiemelkednek, nem pattantanak ki pollent. Számos megfigyelt fenotípusos jellemző egyedi egy speciális kalluszvonalból regenerált növényre; ilyen például a virágzat hiánya az E3/E4/E6 növényeken, és az összes Eli növény egy „füszerű” fenotipust (akár 21 magányos keskeny levéllel) mutat.

Az összes SC82 növény idő előtt elöregszik; a levélelhalás mintegy két héttel a portokképezés (antézis) után elkezdődik. Az SC82 transzformált sejtvonalakból regenerált Rq növények is hajlamosak az idő előtti öregedésre; tipikusan érettek már a csövek kifejlődése előtt. Ez szükségessé teszi az embriókiszabadítás alkalmazását, hogy utódokat nyerjünk (R, generáció). A bar szegregációja az R, generációban nincs korrelációban a változatossággal vagy a címer morfológiájával. A 11B. ábrán a jobb oldali növény tartalmaz bárt, a bal oldali növény pedig nem. Ezenkívül a legtöbb R[ növény életerősebben, mint az Rq növények. A transzformált utódok (R,) elkezdenek csöveket kialakítani, és R₂ palánták nyerhetők ki ezekből.

A 10 független SCI6 transzformánsból regenerált 219 növényből mintegy 35 éri el az érettséget (5. táblázat). Az SC716 növények nem mutatják azokat a fenotípusos különbségeket, amelyek az egyes SC82 kalluszvonalakat jellemzik. Ezek a növények egységesebbek és a rendellenességek kevésbé gyakoriak. Ezeknek a növényeknek a fenotípusa erősen emlékeztet azoknak a kontrollnövényeknek a fenotípusára, amelyeket SC716 fagyasztva tartósított, nem bombázott tenyészetéből regenerálunk. A növény magassága 92-153 cm közti tartományban van a növények többségénél. A legtöbb érett növény nagy, többszörösen elágazó címert, valamint primer és szekunder virágzatot alakít ki. Számos SC716 növény címerein nőivarú virágok is kifejlődnek. Bár a portok-kiemelkedés mintegy hasonlóan kis gyakorisággal megy végbe, mint az SC82 növényekben, egy kis mennyiségű pollen kipattan néhány kiemelkedő portokból. A legtöbb SC716 növénynél, amely eléri az érettséget, elöregedés nem kezdődik legalább 30 napig az antézis után. Az SC716 növények javuló jellemzői az SC82 növényekhez viszonyítva azt jelzik, hogy ezért a szuszpenziós tenyészetek közti különbségek a felelősek.

A találmány szerinti eljárás alapján lehetséges számos módosítást és változatot kialakítani; a speciális kiviteli módokat csak a példa kedvéért mutattuk be részletesen a leírás és az ábrák segítségével. A szakember számára azonban világos, hogy nem áll szándékunkban a találmány oltalmi körét csak egyes adott formákra korlátozni; szándékunk szerint a találmány magában foglalja az összes módosítást, egyenértékű megoldást és változatot, amely a találmány szellemén belül található; az oltalmi kört a mellékelt igénypontok határozzák meg.

Irodalmi hivatkozások

Az alább felsorolt irodalmi hivatkozások (referenciák) a bejelentésbe beépülnek, kiegészítik azt, és magyarázzák, hátteret biztosítanak vagy módszertani útmutatást adnak az alkalmazott tecnikákhoz és kompozíciókhoz.

1. referencia Armstrong C. L., Green C. E.: Planta

764,207-214(1985).

2. referencia Bottino P. J.: Botany 75, 1-16 (1975).

3. referencia Carlsson J., Drevin H., Axen R.;

Biochem. J. 173: 723 (1978).

4. referencia Chomet P. S., Wessler S., Dellaporta

S. L.: EMBO J. 6, 295-302 (1978).

5. referencia Chu C. C., Wang C. C., Sun C. S.,

Hsu C„ Yin K. C., Chu C. Y., Bi F. Y.: Scientia Sinica 18:

659-668 (1975).

HU 218 465 Β

6. referencia

7. referencia

8. referencia

9. referencia 10. referencia

11. referencia

12. referencia

13. referencia

14. referencia

15. referencia

16. referencia

17. referencia

18. referencia

19. referencia

Clark R.: J. of Plánt Nutrition 5,

1039 (1982).

Comai L., Gacciotti D., Hiatt W. R., Thompson G., Rose R. E., Stalker D.: Natúré 317: 741 -744 (1985);

Conger, Β. V., Novak, F. J., Afza, R., Erdelsky, K.: Plánt Cell Rep. 6, 345-347 (1987).

Cristou P., McCabe D. E.,

Swain W. F.: Plánt Physiol. 87, 671-674(1988).

DE 3642 B29 A

De Block M., Botterman J., Vandiwiele M., Dockx J., Thoen C., Gossele V., Movva N. R.,

Thompson C., Van Montagu M., Leemans J.: EMBO J. 6,

2513-2518 (1987); lásd még a WO 87/05629 számú PCT szabadalmi közrebocsátási iratot, amely 1987. 09. 24-én jelent meg.

De Block M., Botterman J., Vandiwiele M., Dockx J., Thoen C., Gossele V., Movva N. R.,

Thompson C., Van Montagu M., Leemans J.: Plánt Physiol. 91, 694-701 (1989).

Dekeyser R., Claes B., Marichal M., Van Montagu M., Caplan A.: Plánt Physiol. 90, 217-223 (1989). Delannay X., LeVallee B. J.,

Proksch R. K., Fuchs R. L.,

Sims S. R., Greenplate J. R.,

Marrone P. G., Dodson R. B., Augustine J. J., Layton J. G., FischoffD. A.: Bio/Technol. 7, 1265-1269(1989).

Feinberg A. P., Vogelstein B.: Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983).

Finkle B. J., Ulrich J. M., Rains W., Savarek S. J.: Plánt Sci.

42, 133-140(1985).

FischoffD. A., Bowdish K. S.,

Perlak F. J., Marrone P. G., McCormick S. M., Niedermeyer J. G., Dean D. A., Kusano-Kretzmer K., Mayer Ε. M., Rochester D. E.,

Rogers S. G., Fraley R. T.: Bio/Technol. 5, 807-813.

Fromm Μ. E., Taylor L. P.,

Walbot V.: Natúré 312,

791-793 (1986).

Haughn G. W., Smith J., Mazur B., Somerville, C.: Mól. Gén Génét. 211, 266-271 (1988).

Hauptmann R. M., Vasil V., Ozias-Aikins P., Tabaeizadeh Z., Rogers S. G., Fraley R. T.,

Horsch R. B., Vasil I. K.: Plánt Physiol. 86, 602-606 (1988).

21. referencia

22. referencia

23. referencia

24. referencia

25. referencia

26. referencia

27. referencia

28. referencia

29. referencia

30. referencia

31. referencia

32. referencia 35

33. referencia

34. referencia 40

35. referencia

36. referencia

37. referencia

38. referencia

39. referencia

40. referencia

Jefferson R. A.: Pl Mól. Bioi. Repr.

5, 387-405 (1987).

Klein T. M., Komstein L.,

Sanford J. C., Fromm Μ. E.: Plánt

Physiol. 91, 440-444 (1989).

Klein T. M., Komstein L.,

Sanford J. C., Fromm Μ. E.: Natúré 327, 70-73 (1987).

Kozák M.: Nucl. Acids Rés. 12, 857-872 (1984).

Lorz H., Baker B., Schnell J.: Mól. Gén. Génét. 199, 178-182 (1985). Lyznik L. A., Ryan R. D.,

Ritchie S. W., Hodges T. K.: Plánt Mól. Bioi. 13, 151-56(1989). McCabe D. E. Swain W. F.,

Martinell B. J., Cristou P: Bio/Technol. 6, 923-926 (1988). McDaniel C. N., Poethig R. S.: Planta 175, 13 - 22 (1988).

Murakami T., Anzai H., Imái S.,

Satoh A., Nagaoka K.,

Thompson C. J.: Mól. Gén. Génét. 205, 42-50 (1986).

Murashige T., Skoog F.: Physiol.

Plánt 75, 473-497(1962).

Nelson R. S., McCormick S. M., Delannay X., Dube P., Layton J., Anderson E. J., Kaniewska M., Proksch R. K., Horsch R. B.,

Rogers S. G., Fraley R. T.,

Beachy R. N.: Bio/Technol. 6, 403-409 (1988).

Nester E. W. és munkatársai: Ann. Rév. Plánt Physiol. 35,

387-413 (1984).

Ogawa Y. és munkatársai: Sci. Rep., Meija Seika 13, 42-48 (1973).

WO 87/-00141 PCT szabadalmi közrebocsátási irat.

Pfahler P. L.: Can. J. Bot. 45,

836-845 (1967).

Potrykus I.: Trends Biotechnoi. 7, 269-273 (1989).

Prioli L. M., Sondahl M. R.: Bio/Technol. 7, 589-594 (1989). Rhodes C. A., Pierce D. A.,

Mettler I. J., Mascarenhas D.,

Detmer J. J.: Science 240,

204-207 (1988).

Shillito R. D., Carswell G. K.,

Johnson C. M., DiMaio J. J.,

Harms C. T.: Bio/Technol. 7, 581-587(1989).

Shah D. M., Horsch R. B., Klee H. J., Kishore G. M., Winter J. A.,

Tumer N. E., Hironaka C. M.,

Sanders P. R., Gasser C. S., Aykent S., Siegel N. R., Rogers S. G., Fraley R. T.: Science 233, 476-481 (1986).

HU 218 465 Β

41. referencia

42. referencia

43. referencia

44. referencia

45. referencia

46. referencia

47. referencia

48. referencia

49. referencia

50. referencia

51. referencia

52. referencia

53. referencia

54. referencia

55. referencia

56. referencia

57. referencia

Shimamoto K., Terada R., Izawa T., Fujimoto H.: Natúré 338,

274-276 (1989).

Shure M., Wesler S., Federoff, N.:

Cell 35, 225-233 (1983).

Southern Ε. M.: J. Mól. Bioi. 98, 503-517(1975).

Szoka: 4,394,448 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

Thompson C. K., Movva N. R.,

Tizard R., Crameri R., Davies J. E., Lauwereys M., Botterman J.:

EMBO J. 6, 2519-2623 (1987).

Tömés D.: Annual Meting Proceedings, 26th Annual Com Breeders School, University of Illinois, 1990. február 26-27., 7-9. oldal. Twell D., Klein T. M., Fromm Μ. E., McCormick S.: Plánt PhysioL 91, 1270-1274(1989).

Vaeck M., Reynaerts A., Hofte H., Jansens S., De Beuckeleer M.,

Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J.: Natúré 328, 33-37(1987).

Withers L. A., King P. J.: Plánt PhysioL 64, 675-678 (1979).

Wong Y. C. és munkatársai : Plánt Mól. Bioi. 11, 433-439(1988).

Yang H., Zhang Μ. H., Davey M. R., Mulligan B. J., Cocking E. C.: Plánt Cell Rep. 7,421-425 (1988).

Zhang Μ. H., Yang H., Rech E. L., Golds T. J., Dávid A. S.,

Mulligan B. J., Cocking E. C.,

Davey E. R.: Plánt Cell Rep. 7, 379-384 (1988).

White J„ Chang S. P., Bibb M. J.: Nucl. Acids Rés. 18, 1062 (1990). Dellaporta S., Greenblatt I.,

Kermicle J., Hicks J. B., Wessler S. : a „Citromosomé Structure and Function: Impact of New Concepts,

18th Stadler Genetics Symposium” című könyvben; Gustafson J. P. és Appels R. (szerkesztők); Plenum Press New York (kiadó), 263-282. oldal (1988).

Chandler V. L., Radicella J. P., Robbins P. P„ Chen J., Turks D.:

The Plánt Cell 1, 1175-1183 (1989). Doring Η. P. és Starlinger: Ann. Rév. Génét. 20, 175-200(1986).

Federoff, N.: „Maize Transposable Elements”, a „Mobile DNA” című könyvben; Wowe Μ. M. és Berg D. E. (szerkesztők); Amer. Soc. Microbiol., Washington, D. D., 377-411. oldal (1989).

58. referencia

59. referencia 5

61. referencia

62. referencia

63. referencia

64. referencia

65. referencia

66. referencia

67. referencia

68. referencia

69. referencia

70. referencia

71. referencia 45

72. referencia

73. referencia 50

74. referencia

75. referencia

Shapiro J. A.: Mobile Genetic

Elements, Academic Press (kiadó)

New York, (1983).

Dellaporta S. L., Greenblatt I. M., Kermicle J., Hicks J. B. és Wessler S.: Stadler Symposium 11, 263-282 (1988).

Thillet J., Absil J., Stone S. R.,

Pictet R.: J. Bioi. Chem. 263,

500-12 508 (1988).

0217571 A2 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat, publikálva 1987. 04. 15-én.

Coe Ε. H., Neuffer M. G. és Hoisington D. A.: a „Com and Com Inprovement” című szakkönyvben; Sprague G. F. és Dudley J. W. (szerkesztők), 81-258. oldal (1988).

Comai L.: 4,535,060 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és 39256 számú ATTC deponálás.

Barkai-Golan R., Mirelman D., Sharon N.: Arch. Microbiol. 116,

119-124 (1978).

Berg D. E„ Egner C., Hirschel B. J., Howard J„ Jorgensen R. és Tisty T. D.: Cold Spring Harbor Symposium 45, 448-465 (1980). Hinchee M. A. W„ Connor-Ward D. V., Newell C. A., McDonell R. E., Sato S. J., Gasser C. S„ Fischoff D. A., Re C. B., Fraley R. T., Horsch R. B.: Bio/Technol 6, 915-922 (1988).

Odell J. T., Nagy F., Chua Ν. H.: Natúré 313, 810-812 (1985).

Lawton M. A., Tiemey M. A., Nakamura I., Anderson E.,

Komeda Y„ Dube P., Hoffman N., Fraley R. T„ Beachy R. N.:

Plánt Mól. Bioi. 9, 315-324 (1987). Ebért P. R., Ha S. B., An G.: PNAS 84, 5745-5749(1987).

Walker J. C., Howard E. A.,

Dennis E. S., Peacock W. J.: PNAS 84, 6624-6628 (1987).

Yang N. S„ Russel D.: PNAS 87, 4144-4148 (1990).

Conkling M. A., Cheng C. L., Yamamoto Y. T., Goodman Η. M.: Plánt Physiol 93, 1203-1211 (1990).

Fromm H., Katagiri F., Chua Ν. H.: The Plánt Cell 1, 977-984 (1989). Ingelbrecht I. L. W., Hermán L. M. F., Dekeyser R. A., Van Montagu M. C„ Depicker A. G.: The Plánt Cell 1: 671-680 (1989); Bevan M„ Bames W. M., Chilton M. D.: Nucleic Acid Rés. 11, 369-385 (1983).

HU 218 465 Β

76. referencia

77. referencia

78. referencia

79. referencia

80. referencia

81. referencia

82. referencia

83. referencia

84. referencia

85. referencia

86. referencia

87. referencia

88. referencia

89. referencia

90. referencia

91. referencia

92. referencia

Callis J., Fromm M., Walbot V.: Genes and Develop.

1: 1183-1200(1987).

Vasil V., Clancy M., Feri R. J.,

Vasil I. K., Hannah L. C.: Plánt Physiol. 91, 1575-1579 (1989).

Gallie D. R., Lucas W. J., Walbot V.: The Plánt Cell 1, 301-311 (1989). Sambrook J., Fritsch E. F. és Maniatis T.: Molecular Cloning,

A Laboratory Manual; 2. kiadás (1989).

Gelvin S. B., Schilperoort R. A., Varma D. P. S. (szerkesztők): Plánt Molecular Biology Manual (1990). Gatehouse A. M., Dewey F. M.,

Dove J., Fenton K. A., Dusztai A.:

J. Sci. Food Agric. 35, 373-380(1984).

Potrykus I., Saul M. W., Petruska J., Paszkowski J., Shillito R. D.: Mól. Gén. Génét. 199, 183-188 (1985). Stalker D. M., Malyj L, D.,

McBride K. E.: J. Bioi. Chem. 263, 6310-6314(1988).

Ikeda H., Kotaki H., Omura S.:

J. Bacteriol. 169, 5615-5621 (1987). Avermectin and Abamectin.

Campbell W. C. (szerkesztő);

(1989).

Watrud L. S., Perlak F. J., Tran Μ. T., Kusano K., Mayer E. J,, Miller-Widemann M. A., Obukowicz M. G., Nelson D. R., Kreitinger J. P. és Kaufman R. J.: az „Engineered Organisms and the Environment” című szakkönyvben; Halvorson Η. O. és munkatársai (szerkesztők); Am. Soc. Microbiol., Washington, D. C. (1985).

Cutler A. J., Saleem M., Kendell E., Gusta L. V., Georges F.,

Fletcher G. L.: J. Plánt Physiol. 135, 351-354(1989).

Hilder V. A., Gatehouse A. M. R., Sheerman S. E., Barker R. F.,

Boulter D.: Natúré 330, 160-163(1987).

Neuffer M. G.: Growing Maize fór Genetic Purposes; In: Maize fór Biological Research, 19-30 (1982). Green C. L. és munkatársai: Plánt Regeneration in Tissue Cultures of Maize; In: Maize far Biological Research. 367-372 (1982).

Dhaese P. és munkatársai: EMBO joumal 2, 419-426 (1983).

Höffle H. és munkatársai: Microbiological Reviews 53,

Claims (45)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás termő, transzgenikus kukoricanövények előállítására, azzal jellemezve, hogy

   5 (a) előállítunk egy DNS-kompozíciót, amelynek komponenseit kifejezni kívánjuk kukoricanövényben vagy be kívánjuk vezetni valamely kukoricanövény genomjába;

   (b) a befogadó kukoricasejteket mikrolövedékes

   10 bombázással érintkezésbe hozzuk az említett DNSkompozicióval;

   (c) a befogadósejtekből, amelyek befogadták a nevezett DNS-komponenst, növényeket regenerálunk; és

   15 (d) azonosítjuk azokat a termő, transzgenikus kukoricanövényeket, amelyek tartalmazzák a kívánt DNSkomponenst.

   (Elsőbbség: 1989.08.09.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

   20 hogy az említett befogadósejtekként kalluszsejteket alkalmazunk.

   (Elsőbbség: 1989. 08. 09.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett befogadósejtekként gamétasejteket

   25 vagy merisztémasejteket alkalmazunk.

   (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett befogadósejtekként szuszpenziós tenyészetből kapott sejteket alkalmazunk.

   30 (Elsőbbség: 1989.08.09.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuszpenziós tenyészetként embriogén kalluszból készített szuszpenziós tenyészetből kapott sejteket alkalmazunk.

   35 (Elsőbbség: 1989. 08. 09.)
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuszpenziós tenyészetként II. típusú kalluszból készített szuszpenziós tenyészetből kapott sejteket alkalmazunk.

   40 (Elsőbbség: 1989.08. 09.)
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy elvégezzük egy növényisejt-kompozíció, amely magában foglalja a befogadósejteket, előállítását is, mielőtt az említett befogadósejteket érintkezésbe hoznánk

   45 az említett DNS-kompozícióval.

   (Elsőbbség: 1989.08.09.)
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényisejt-kompozíciót úgy állítjuk elő, hogy

   50 (a) embriogén kalluszt állítunk elő; és (b) az említett kalluszból olyan sejteket választunk ki, amelyek befogadósejteket tartalmaznak.

   (Elsőbbség: 1989.08.09.)
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 55 hogy a kiválasztott kalluszsejteket szuszpenziós tenyészetben tenyésztjük, mielőtt a DNS-kompozícióval érintkezésbe hoznánk.

   (Elsőbbség: 1989.08.09.)
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 60 hogy az említett növényisejt-kompozíciót fagyasztva tá30

    HU 218 465 Β rolásnak vetjük alá, mielőtt érintkezésbe hoznánk a DNS-kompozícióval.

    (Elsőbbség: 1990.04. 17.)
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzpozont tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1990.08.08.)
12. 12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzpozonként Ac, Ds vagy Mu elemet tartalmazó DNS-kompoziciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1990.08.08.)
13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő, amely valamely szelektálható vagy átvizsgálható markergénnel bír.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektálható vagy átvizsgálható markergénként neo génnel, GUS-génnel vagy bar génnel bíró exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő. (Elsőbbség: 1989. 08. 09.)
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektálható vagy átvizsgálható markergénként az R komplexből valamely génnel bíró exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő. (Elsőbbsége: 1990. 04. 17.)
17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektálható vagy átvizsgálható markergént valamely mutáns EPSP szintáz génnel, nitrilázgénnel vagy acetolaktát szintáz génnel bíró exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1990. 08. 08.)
18. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén génként kukoricagént tartalmazó DNSkompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
19. 19. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén génként valamely kívánt jellemvonást kódoló gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő. (Elsőbbség: 1989. 08. 09.)
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén génként egy herbicidrezisztencia-génnel vagy rovarrezisztencia-génnel bíró exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén génként egy fagyellenes fehérjegénnel vagy gombaellenes génnel bíró exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1990. 08. 08.)
22. 22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-kompozícióként plazmidot tartalmazó kompozíciót állítunk elő.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
23. 23. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő, amelyben az említett exogén génhez valamely promotor és 3’-terület van működőképesen csatlakoztatva.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő, amelyben az említett exogén génhez promotorként CaMV35S vagy ADH-promotor van csatlakoztatva. (Elsőbbség: 1989.08.09.)
25. 25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan exogén gént tartalmazó DNS-kompozíciót állítunk elő, amelyben az említett exogén génhez promotorként szacharóz szintáz, R alléi vagy CaMV 19S, nos vagy gyökérsejtpromotor van csatlakoztatva. (Elsőbbség: 1990.08.08.)
26. 26. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogadósejteket egynél több exogén génnel transzformáljuk együtt.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
27. 27. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogadósejteket olyan DNS-szegmenssel hozzuk érintkezésbe, amelyben legalább két exogén gén van elhelyezve.

    (Elsőbbség: 1990.04. 17.)
28. 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azokat a sejteket, amelyek befogadtak egy DNS-komponenst, a regenerálás előtt szelektáljuk. (Elsőbbség: 1989.08.09.)
29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket szelektív tápközeggel érintkeztetve végzett inkubálással szelektáljuk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogadósejteket olyan DNS-kompozícióval hozzuk érintkezésbe, amely bialafoszrezisztencia-gént foglal magában, és azokat a sejteket, amelyek a bialafoszrezisztencia-gént befogadták, olyan szelektív tápközegben szelektáljuk, amely bialafoszt vagy PPT-t tartalmaz. (Elsőbbség: 1989. 08. 09.)
31. 31. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) lépésben a DNS-kompozíció felvételét a befogadósejtbe a sejtek mikrolövedékes bombázásával oly módon érjük el, hogy a részecskéket, amelyek a DNS-kompozícióval be vannak borítva, először átjuttatjuk egy szűrőn, majd bejuttatjuk a sejtekbe.

    (Elsőbbség: 1990.04. 17.)
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy volfrámot tartalmazó részecskékkel bombázunk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy platinát tartalmazó részecskékkel bombázunk. (Elsőbbség: 1990. 04.17.)
34. 34. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy befogadósejtekként embriogén kukoricasejteket alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
35. 35. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növények regenerálásánál a befogadósejtekből a következő lépéseket végezzük el:

    HU 218 465 Β (a) azokat a befogadósejteket, amelyek a DNS-t befogadták, olyan tápközegben tenyésztjük, amíg a kallusz szerveződése észlelhető, amely valamely embriógenezist elősegítő hormont tartalmaz;

    (b) az említett sejteket ezután olyan tápközegre viszszük át, amely szövetszerveződést elősegítő hormont tartalmaz;

    (c) az említett sejteket altenyésztjük olyan tápközegben, amely nem tartalmazza az említett hormonok egyikét sem, hogy lehetővé tegyük a szár megnyúlását és a gyökér kifejlődését; és (d) az említett sejteket minimáltápközegre visszük át, hogy elősegítsük a növény megszilárdulását. (Elsőbbség: 1989.08.09.)
36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy embriogenezist elősegítő hormonként dicambát alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
37. 37. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy embriogenezist elősegítő hormonként 2,4-D-t alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
38. 38. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetszerveződést elősegítő hormonként BAP-ot, mio-inozitot vagy 2,4-D-t alkalmazunk. (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
39. 39. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetszerveződést elősegítő hormonként ABA-t, BAP-ot, NAA-t, IAA-t, 2-lP-t vagy mio-inozitot alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
40. 40. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (c) lépésben olyan tápközeget alkalmazunk, amely mio-inozitot is tartalmaz.

    (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
41. 41. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejtek növesztéséhez gyökerezést stimuláló hormont is alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
42. 42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyökerezést stimuláló hormonként IBA-t alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1990. 04. 17.)
43. 43. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy minimáltápközegként Clark-féle tápközeget alkalmazunk.

    (Elsőbbség: 1990.04. 17.)
44. 44. Eljárás termő, transzgenikus kukoricanövények előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) embriogén kukoricasejteket növesztünk szuszpenziós tenyészetben egy vagy több hormont is tartalmazó tápközegben;

    (b) valamely kívánt gént kódoló DNS-szegmenseket állítunk elő;

    (c) az említett DNS-szegmenseket bevezetjük a befogadó kukoricasejtekbe mikrolövedékes bombázással; és (d) a befogadó kukoricasejtekből növényeket regenerálunk.

    (Elsőbbség: 1989.08.09.)
45. 45. Az 1. igénypont szerinti eljárás a bialafoszherbiciddel szemben rezisztens transzgenikus kukoricanövények előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) a bialafosz elleni rezisztenciát kódoló gént magában foglaló DNS-kompozíciót állítunk elő;

    (b) a befogadó kukoricasejteket mikrolövedékes bombázással az (a) lépésben előállított DNS-kompozícióval hozzuk érintkezésbe;

    (c) a nevezett DNS-komponenst befogadott sejtekből kukoricanövényeket regenerálunk.