JPH0822224B2 - 植物の組織培養方法 - Google Patents

植物の組織培養方法

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JPH0822224B2
JPH0822224B2 JP62026411A JP2641187A JPH0822224B2 JP H0822224 B2 JPH0822224 B2 JP H0822224B2 JP 62026411 A JP62026411 A JP 62026411A JP 2641187 A JP2641187 A JP 2641187A JP H0822224 B2 JPH0822224 B2 JP H0822224B2
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    • C12N2501/30—Hormones

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物の組織培養方法に関する。更に詳しく
は、液体培地を用いて植物を組織培養するに当つて、植
物ホルモンを特定の条件のもとに培地に間欠的に供給す
ることにより細胞の増殖速度が速く、かつ長期間安定し
た培養が可能となる組織培養方法に関する。
〔従来技術と問題点〕
従来の組織培養方法としては、例えば植物ホルモンを
所定濃度にした培地を用いて培養を開始しても、それ以
後には植物ホルモン等の培地成分を新たに追加供給して
その濃度を適宜調整して培養を続ける方法については試
みられていないようである。
培養開始後は、植物ホルモン等の培地成分は細胞によ
つて消費され次第にその濃度を低下させてゆくので、あ
る培地分にとつては培養を継続する上で好ましくない濃
度範囲になつていることも考えられる。従来のこのよう
なバツチ培養の方法では細胞の増殖速度はかんばしくな
く、又細胞の生育安定性も良くない。
一方、連続培養方法として培養物と一緒に培養液を培
養帯域外へ排出して培地を更新して培養する方法が知ら
れている。例えば「醗酵工学」第61巻117〜128頁（1983
年）には、タバコ植物細胞を培養する方法として2,4−
Ｄ（2,4−ジクロロフエノキシ酢酸）の植物ホルモンを
含む液体培地を更新させながら連続培養する方法が示さ
れており、この場合には培養期間中ほぼ一定濃度の植物
ホルモンが培地に存在するものと考えられる。又培地を
更新させて培養する方法として特公昭61−36915号公報
には培地液中の細胞を沈降させて得られる培養上清を培
養槽外に排出しながら新鮮培地を加えて培養する浮遊細
胞の高濃度培養の方法が示されている。しかしこれら従
来の方法に示された培養方法では、培養細胞の増殖速度
や生育安定性が不充分であり、従つて培養によつて得ら
れる二次代謝産物の例えばアルカロイドや色素の生産量
は未だ充分ではなく改善の余地がある。
〔発明が解決しようとする問題点〕
かかる背景のもとに本発明者等は、従来法に比べて細
胞の増殖速度が速く、また生育安定性に優れ二次代謝産
物を効率良く高収率で得ることのできる培養方法につい
て検討したところ、植物ホルモンを培養期間中必ずしも
一定濃度に維持する必要はなく、細胞の成長に合わせて
その濃度を適宜変えることが良いことを認めた。そして
この知見をもとに前記目的を達成できる組織培養方法に
関する発明を完成するに到つた。
〔発明の概要〕
すなわち、本発明の方法によれば、液体培地を用いて
組織培養するに当たつて、植物ホルモンを以下の（ａ）
と（ｂ）の条件を満足するようにして培地に間欠的に供
給しながら培養を行うことを特徴とする植物の組織培養
方法が提供される。
（ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ〔day〕を細胞の倍増
時間の0.5〜５倍とする。
（ｂ）〔Ｉ〕式を満足するような量の植物ホルモンを培
地に加える。
10-12＜A/（Ｄ・Ｗ）＜10-6 〔Ｉ〕 ここでＡは培地に間欠的に加えられる植物ホルモンの
量〔モル〕、Ｗは培養帯域にある細胞の新鮮重量
〔ｇ〕、Ｄは植物ホルモンの供給間隔〔day〕を表わ
す。
〔発明の具体的説明〕
本発明の植物の組織培養方法が適用される植物として
特に限定されず、従来の組織培養が適用できる植物であ
れば、本発明の方法を該植物に適用することは原理的に
可能である。このような植物として具体的には、ズボイ
シア・ミオポロイデス（Duboisia myoporoides），ズボ
イシア・ライヒハルデイ（Duboisia leichhardtii）等
のズボイシア属植物、ダツラ・タツラ（Datura tatul
a），ダツラ・アルボレア（Datura arborea），ダツラ
・ストラモニウム（Datura stramonium）等のダツラ属
植物、スコポリア・ジヤポニカ（Scopolia japonica）
等のスコポリア属植物、ヒヨシアマス・ニガー（Hyoscy
amus niger）等のヒヨス属植物およびアトローパ・ベラ
ドンナ（Atropa belladonna）等のアトローパ属植物な
どのナス科植物、オウレン（Copntis japonica Makin
o）、セリバオウレン（Nakai）、キクバオウレン（C.ja
ponika Makino var.japonika）、コセリバオウレン（C.
japonika Makino var.major Satake）、バイカオウレン
（C.quinquefolia Miq.）およびミツバオウレン（C.tri
folia Salisb.）等のコブテイス属の植物、アキカラマ
ツ（Thalictrum minus L.var hypolecum Miq.）等のサ
リクトラム属の植物、サリントリザ属の植物およびヒド
ラスチス属植物等のキンポウゲ科植物、ケシ科植物のケ
シ、マメ科植物のカンゾウ、セリ科植物のニンジン、ミ
シマサイコ、タデ科植物のダイオウ、キヨウチクトウ科
植物のインドジヤボク、ニチニチソウ、ナス科植物のタ
バコ、ムラサキ科植物のムラサキ、シソ科植物のシソ、
ハツカ、アカネ科植物のコーヒー、ゴマノハグサ科植物
のジキタリスなどを挙げることができる。
本発明では前記植物の組織（細胞、器官を含む）を液
体培地を用いて、培養が行われるが、この場合の液体培
地としては、従来から知られている植物の組織培養に使
用されている培地が使用できる。該培地として具体的に
は無機成分、炭素源および植物ホルモンを必須成分と
し、これにビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミ
ノ酸類を添加した培地である。該培地の無機成分として
は、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、
モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素を含む無
機塩を挙げることができ、具体的には硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸１水素カリウ
ム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化
マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２
鉄、硫酸マンガン、硫酸同、モリブデン酸ナトリウム、
酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、
塩化コバルト等の化合物を例示できる。
該培地の炭素源としては、シヨ糖等の炭水化物とその
誘導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級ア
ルコールなどを例示できる。
該培地の植物ホルモンとしては、インドール酢酸（IA
A）、ナフタレン酢酸（NAA）、ｐ−クロロフエノキシイ
ソ酪酸および2,4−ジクロロフエノキシ酢酸（2,4−Ｄ）
等のオーキシン類およびカイネチン、ゼアチンおよびベ
ンジルアデニン等のサイトカイニン類を例示できる。
該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
B2）などを例示できる。
該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラ
ニン、グルタミン酸、システイン、チロシンおよびリジ
ンなどを例示できる。
本発明で使用される液体培地は、通常は、前記無機成
分を約0.1μＭないし約100mM、前記炭素源を約1g/な
いし約100g/、前記ビタミン類を約0.1mg/ないし約1
50mg/および前記アミノ類類を０ないし約1000mg/含
ませて使用されることが望ましい。植物ホルモンについ
ては、本発明では培地に特定条件のもとに特定量の植物
ホルモンが間欠的に加えられるわけであるが、植物ホル
モンが間欠的に加えられる直前の培地における植物ホル
モン濃度は通常０（検出限界以下の濃度）あるいはそれ
に近い濃度になつているが、必要に応じて該濃度が０〜
10-11Mの範囲にあつても差し支えない。又植物ホルモン
が間欠的に培地に加えられた直後の培地における植物ホ
ルモン濃度は通常10-4ないし10-10M、好ましくは10-5な
いし10-8Mの範囲にあるようにして後述する特定条件の
もとに後述の〔Ｉ〕式によつて規定される所定量の植物
ホルモンが培地に間欠的に加えられる。
本発明で使用される培地として具体的には、従来から
知られている植物の組織培養に用いられている培地、例
えば、ムラシゲ・スクーグ（'62）〔Murashige ＆ Skoo
g〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（RM−1965）〔L
insmaier ＆ Skoog〕の培地、ホワイト（'63）〔Whit
e〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井
のＭ−９培地の培地等に前記した炭素源を添加し、更に
必要に応じて前記した植物ホルモン、ビタミン類、アミ
ノ酸類を添加して調製される培地を例示できるが、本発
明ではこの中でも特にリンスマイヤー・スクーグ又はム
ラシゲ・スクーグの培地を用いて調製される培地が好ま
しい。なお、上記した従来公知の培地の組成に関して
は、例えば、竹内、中島、古谷著の「新植物組織培養」
P386〜P391、朝倉書店、1979年に記載されている。
本発明では前記液体培地を用いて前記植物を組織培養
する場合、本発明を特徴づける以下の条件のもとに培養
が実施される。以下該条件について詳述する。
本発明に係る植物組織培養方法においては、液体培地
に占める細胞濃度は任意であるが、好ましくは細胞濃度
を液体培地に対して100〜500〔g/〕、特に好ましくは
200〜400〔g/〕の範囲にあるようにして培養を行う
と、培養槽の単位容積当たりの細胞の収量を高くして効
率良く培養できるので望ましい。細胞濃度が通常500g/
以上になるとスラリー濃度が高くなり培養液の撹拌、
混合が不充分となるため、効率良く酸素供給を行うこと
が困難となり、培養中に細胞の壊死などが起こつて、細
胞の正常な増殖が困難となりやすい。また、酸素の供給
を充分にしようとして撹拌を激しくすると細胞の破壊、
損傷が起きるなどして培養が困難となる。このような細
胞濃度を500〔g/〕を越えて高くした場合には、培養
にとつて好ましくないことが起きるので通常は細胞濃度
は500〔g/〕以下にして培養を行うことが好ましい。
培養期間中には細胞が増殖してその量を増すので、本発
明では必要に応じて培養期間中に細胞を適宜の量培養帯
域外へ適宜方法によつて取り出すことによつて、培養帯
域中の細胞濃度を適宜濃度に維持することができる。な
お細胞細胞濃度を算出する際の細胞の重量は湿つた（we
t）状態で測定された新鮮重量である。ここに新鮮重量
とは通常以下の方法によつて求められる細胞の重量であ
る。すなわち、組織培養物を濾布をひいたヌツチエにと
り、水洗ポンプなどで５分間濾過を行い、細胞以外の培
養液を除いたときの細胞の重量てある。このようにして
得られる細胞は植物によつても異なるが通常含水率が80
〜95wt％である。
本発明に係わる組織培養では植物の組織片や細胞など
が培養される。該組織片としては茎頂、茎、葉、花、種
子、根などの組織片を例示でき、組織片から誘導される
カルスや、培養細胞も更に組織培養の原料として用いる
ことができる。
本発明に係わる組織培養方法はバツチ培養でも連続培
養でも行うことがができるが、連続培養に適用すること
が好ましい。この連続培養の場合には、培地の栄養基質
濃度を所定の濃度に調整した液体培地を培養帯域に連続
的または非連続的に供給する一方、培養帯域の他方によ
り培養液を連続的または非連続的に抜き出して、培養帯
域中の培養液を更新させながら組織培養を行うことがで
きる。培養液の更新は連続的であつても非連続的であつ
てもよい。
ここで栄養基質とは、前述した本発明で使用する液体
培地の培地成分であつて、前記した無機成分、炭素源、
植物ホルモン、ビタミン類およびアミノ酸類である。
また栄養基質濃度が所定の濃度に調整された培養液と
は、前述したように無機成分を約0.1μＭ〜約100mM、炭
素源を約１〜約100g/、ビタミン類を０ないし約150mg
/、アミノ酸類を０ないし約1000mg/の濃度範囲に調
整した液体培地である。液体培地を更新させながら行う
連続培養法の場合には、培養帯域に供給される液体培地
中の植物ホルモン濃度については通常０（検出限界以下
の濃度）であることが好ましいが、必要に応じて０〜10
-11Mの範囲で植物ホルモンをふくんでいても差し支えな
い。培養帯域に植物ホルモンが間欠的に加えられた直後
の培養帯域における植物ホルモン濃度は前述と同様に通
常10-4〜10-10M、好ましくは10-5〜10-8Mの範囲にあ
る。本発明では培養帯域に供給される培地成分の濃度を
前記範囲になるように調整した液体培地については、通
常は新鮮な液体培地を用いることが好ましいが、培養帯
域から抜き出された培地の栄養基質濃度を調整してから
これを再度循環使用する方法を行つても差し支えない。
循環使用する場合には培養液中の細胞の代謝によつて生
じる老廃物を適宜除去する処理を行うことが好ましい。
本発明で培養液を更新させながら組織培養を行う場合
には、培養槽（培養帯域）中の培養液の量をＶ〔〕、
培養槽に供給する液体培地の量をＦ〔/day〕としてF/
V〔/day-1〕で定義される培地更新率と組織培養物の
比増殖速度μ〔day-1〕の関係がμ≦F/V＜20μの範囲に
あるようにして植物の組織培養を行うことが好ましい。
ここで比増殖速度μ〔day-1〕とは以下の方法によつて
定義される量である。
培養細胞を培養帯域外へ排出させない場合、培養のあ
る時期toの細胞の量をxoとし、ｔ時間（日）後の細胞の
量をxtとした場合、比増殖速度μは次式で定義される。
また細胞の量をxoと維持して増殖した細胞を培養帯域
外に排出した場合、ｔ時間（日）後培養帯域外に排出さ
れた細胞の量をytとすると比増殖速度μは次式で定義さ
れる。
そしてμのもつその物理的意味は〔time-1〕の次元を
もち、μの値が大きいほど組織培養物の増殖が速いこと
になる。
本発明では比増殖速度μの値は植物の種類によつても
異なるが通常0.02〜0.4〔day-1〕、好ましくは0.05〜0.
2〔day-1〕の範囲にあるようにして組織培養が行われ
る。本発明で連続培養法を用いる場合には、培値の栄養
基質の濃度が所定の濃度に調整された液体培地を培養帯
域に連続的または非連続的に供給する際の供給量Ｆ〔
/day〕はμ≦F/V＜20μの式を満足するようにして決め
ることが好ましいことは前述したとおりである。この場
合の培地更新率F/Vの値としては通常0.02〜８〔da
y-1〕、好ましくは0.05〜４〔day-1〕の範囲にある。
本発明では培養帯域の他方より培養液を連続的または
非連続的に抜き出す場合、培養中の培養槽における細胞
の濃度を100〜500〔g/〕の範囲になるようにして培養
することが好ましいが、この際培養槽から培養液のみを
抜き出してもよいし、あるいは必要に応じて適宜量の細
胞を培養液と共に抜き出しても差し支えない。
本発明では培地更新率（F/V）が比増殖速度μよりも
小さなF/V＜μの場合には、細胞の濃度が高くなりすぎ
てしまい、細胞の最適濃度を維持できなくなるなどの理
由から培養帯域から培養液だけを取り出すことよりも適
宜量の培養細胞も含めて取り出すことが好ましく、例え
ば培養槽に設けられた排出管より細胞を含む培養液を取
り出すと共に、培地の栄養基質濃度が前記所定濃度に調
製された液体培地を培養槽に送入して培養槽における細
胞の濃度を適宜濃度にして培養することもできる。
本発明で連続培養法を用いる場合には培地更新率（F/
V）が比増殖速度μより極端に大きい20μ≦F/Vの場合に
は、細胞の黒化、壊死などの悪影響が通常おこり易い。
そこで本発明では培地更新率（F/V）をμ≦F/V＜20μの
範囲で制御することによつて組織培養を行うことが特に
好ましい。
本発明においては、培養帯域の他方により連続的また
は非連続的に抜き出される培養液の量としては、通常は
前述した培養帯域に供給される培地量Ｆ〔/day〕に相
応する量であるが、必ずしもこの量に限定されるもので
は無く、例えば前記したF/V＜μの条件で培養している
場合には必要に応じて培地の抜き出し量をＦ〔/day〕
よりも適宜量増しても差し支えない。
本発明では前述の如く植物ホルモンを以下の（ａ）と
（ｂ）の条件を満足にするようにして培地に間欠的に供
給して培養が行われる。
（ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ〔day〕を細胞の倍増
時間の0.5〜５倍とする。
（ｂ）〔Ｉ〕式を満足するような量の植物ホルモンを培
地に加える。
10-12＜A/（Ｄ・Ｗ）＜10-6 〔Ｉ〕 ここでＡは培地に間欠的に加えられる植物ホルモンの
量〔モル〕、Ｗは培養帯域にある細胞の新鮮重量
〔ｇ〕、Ｄは植物ホルモンの供給間隔〔day〕を表わ
す。
以下本発明に係わる植物ホルモンの供給方法について
詳述する。本発明で（ｂ）の〔Ｉ〕式を満足するような
量（Ａ）の前記した植物ホルモンが培地に間欠的に加え
られるが、この場合の間欠的な供給の仕方としては先の
（ａ）に示したように、植物ホルモンを供給するときの
間欠的な時間間隔Ｄが培養帯域における細胞の倍増時間
（doubling time）の0.5〜５倍となるようにして植物ホ
ルモンは供給される。ここで細胞の倍増時間とは、今問
題としている培養帯域で培養されている細胞が増殖して
その量を２倍にするのに要する時間であつて、該倍増時
間として具体的には植物の種類や培養条件によつても多
少異なるが通常２〜20日程度である。本発明では植物ホ
ルモン供給の間欠的な時間間隔Ｄが細胞の倍増時間の0.
5倍未満の場合には、ホルモンを連続的に供給した場合
と同様に、培養期間が長くなるにつれて、細胞の黒化、
壊死が起こり細胞の生育を著しく阻害するなどの理由か
ら好ましくない。またＤが細胞の倍増時間の５倍以上と
なるようにして植物ホルモンを供給した場合には、１回
当りに供給するホルモン量が多くなるため、供給直後に
は細胞から二次代謝産物が培地中に放出されたり、ホル
モン異常と思われる一時的な細胞の生育阻害が起こり安
定な培養を長期に亘つて実施することが困難になること
から好ましくないので、植物ホルモンの間欠的な供給の
時間間隔は前記した範囲で行われる。
なお先の〔Ｉ〕式に示した植物ホルモンの量（Ａ）は
培地に間欠的に供給される量であるが、本発明ではこれ
とは別に植物ホルモンを間欠的に添加した直後の培地に
おける植物ホルモンの濃度は前記したように通常10-4〜
10-10Mの範囲にあるようにして培養が行われるので、培
地に間欠的に供給される植物ホルモンの量（Ａ）は
〔Ｉ〕式を満足すると同時に、植物ホルモンが間欠的に
供給された直後の培地の植物ホルモン濃度（間欠的に供
給された植物ホルモン量と供給前の培地に残存する植物
ホルモン量を合計した量に基づく濃度）も前記した10-4
〜10-10Mの範囲にあるように、間欠的に供給される植物
ホルモンの量（Ａ）は選ばれなければならない。従つて
添加される植物ホルモンの量（Ａ）は、〔Ｉ〕式によつ
て制約を受ける他に培地に残存する植物ホルモンの量も
考慮して決められる。そして本発明で培地に残存する植
物ホルモンの濃度が実質的に零になつた時点で前記した
（ａ）と（ｂ）の条件を満足するようにして前記した範
囲の植物ホルモン濃度となるように植物ホルモンを培地
に間欠的に供給する方法を用いた場合には、正常な細胞
の分裂→肥大のサイクルが保持されて、細胞の生育およ
び二次代謝産物の生産が長期間に亘つて可能になるので
特に好ましい。なお本発明では必要に応じて培地に残存
する植物ホルモンの濃度が実質的に零でない前記した範
囲の任意の濃度で、先の（ａ）及び（ｂ）等の条件を満
足するようにして植物ホルモンを間欠的に供給する方法
を用いることが出来ることは言うまでもない。
本発明では先の〔Ｉ〕式で（A/（Ｄ・Ｗ））の値が10
-12以下の場合（間欠的に加えられる植物ホルモンの量
が少ない）には、細胞の増殖速度が遅くなり、また細胞
の生育が不充分となるので好ましくない。また該値が10
-6以上の場合には、培地の植物ホルモンの濃度が高くな
り過ぎて細胞の壊死が起こり、しかも二次代謝産物の生
産が著しく低下することがあるなどの理由から本発明で
は植物ホルモンの間欠的な添加量は前記範囲で行われ
る。
本発明の組織培養方法を用いるとベルベリン、アトロ
ピン、スコポラミンなどのアルロイド、シコニン、プリ
プリン、アリザリンなどの色素成分等の二次代謝産物を
高収率で効率良く得ることができる。
〔発明の効果〕
本発明に係わる植物ホルモンを特定条件のもとに間欠
的に培地に供給して行う組織培養方法によれば、従来法
に比べて細胞の増殖速度が早く、又細胞の生育安定性が
優れているので二次代謝産物を高収量で効率良く得るこ
とができる。
〔実施例〕
以下、本発明の方法を実施例によって具体的に説明す
る。なお、式〔Ｉ〕におけるＡは、培地に加える植物ホ
ルモンの量が複数である場合はそのすべての植物ホルモ
ンの総量を意味するが、本実施例では計算の都合上微量
ホルモンの添加量はＡに含めないで計算している。
実施例 １ オウレン（Coptis japonica）の培養細胞をリンスマ
イヤーとスクーグの培地を用いて２の通気撹拌型培養
槽で培養を行つた。培養中の培養槽における液体培地の
容量は1.8であり、オウレン細胞の濃度がオウレン細
胞の新鮮重量で表わして300〔g/〕となるように、培
地の栄養基質濃度を所定の濃度に調整した液体培地を培
養槽に連続的（540ml/日）に供給しながら、ホルモン成
分（ナフタレン酢酸９×10-5モル、ベンジルアデニン９
×10-8モル）を４日間隔（doubling timeの１倍）で添
加する一方培養槽の他方から培地と増殖した細胞を抜き
出しながら培養を行つた。
60日間に亘つて連続培養を行つた結果、オウレン細胞
の比増殖速度は0.18（day-1）、オウレン細胞中のベル
ベリン含量は5.0％であつた。
実施例 ２ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸３×10-4モ
ル、ベンジルアデニン３×10-7モル）を12日間隔（doub
ling timeの３倍）で添加した以外は実施例１と同様に
培養したところ、オウレン細胞の比増殖速度は0.17（da
y-1）、オウレン細胞中のベルベリン含量は4.9％であつ
た。
実施例 ３ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸４×10-4モ
ル、ベンジルアデニン４×10-7モル）を18日間隔で添加
した以外は実施例１と同様に培養したところ、オウレン
細胞の比増殖速度は0.16（day-1）、オウレン細胞中の
ベルベリン含量は4.7％であつた。
比較例 １ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸５×10-4モ
ル、ベンジルアデニン５×10-7モル）を21日間隔（doub
ling timeの5.3倍）で添加した以外は実施例１と同様に
培養したところ、培養期間が長くなるにつれてオウレン
細胞の比増殖速度および細胞中のベルベリン含量は徐々
に低下する傾向を示し、60日間培養後の比増殖速度およ
びベルベリン含量はそれぞれ0.08（day-1）、2.0％であ
つた。
比較例 ２ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸５×10-2モ
ル、ベンジルアデニン５×10-5モル）を４日間隔（doub
ling timeの１倍）で添加した以外は実施例１と同様に
培養したところ、培養細胞の黒変（壊死）が起こり、30
日間培養後の比増殖速度およびベルベリン含量はそれぞ
れ0.05（day-1）、1.5％であつた。
比較例 ３ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸10-5モル、
ベンジルアデニン10-8モル）を8hr間隔（doubling time
の0.08倍）で添加した以外は実施例１と同様に培養した
ところ、約７日間の培養でカルスの黒化が起り始め、30
日間培養後の比増殖速度およびベルベリン含量はそれぞ
れ0.10（day-1）、2.5％であつた。
比較例 ４ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度
に調製した液体培地を培養槽に連続的（540ml/日）に供
給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸10-9モル、
ベンジルアデニン10-12モル）を４日間隔（doubling ti
meの１倍）で添加した以外は実施例１と同様に培養した
ところ、細胞の黒化・壊死は起こらなかつたが、細胞の
増殖が悪く、比増殖速度は0.11（day-1）、ベルベリン
含量は５％であつた。
実施例 ４ タバコ（Nicotiana tabacum）の培養細胞をリンスマ
イヤーとスクーグの培地を用いて２の通気撹拌型培養
槽で培養を行つた。培養中の培養槽における液体培地の
容量は1.8であり、タバコ細胞の濃度がタバコ細胞の
新鮮重量で表わして、211〔g/〕となるように培地の
栄養基質濃度を所定の濃度に調製した液体培地を培養槽
に連続的（600ml/日）に供給しながらホルモン成分（2,
4−ジクロロフエノキシ酢酸４×10-5モル）を２日間隔
（doubling timeの１倍）で添加する一方、培養槽の他
方から培地と増殖した細胞を抜き出しながら培養を行つ
た。60日間に亘つて連続培養を行つた結果、タバコ細胞
の比増殖速度は0.38（day-1）であつた。
実施例 ５ アカネ（Rubia cordifolia）の培養細胞をムラシゲと
スクーグの培地を用いて２の通気撹拌型培養槽で培養
を行つた。培養中の培養槽における液体培地の容量は1.
8であり、アカネ細胞の濃度がアカネ細胞の新鮮重量
で表わして、138g〔g/〕となるように、培地の栄養基
質濃度を所定の濃度に調製した液体培地を培養槽に連続
的（600ml/日）に供給しながらホルモン成分（ベンジル
アデニン1.1×10-5モル、2,4−ジクロロフエノキシ酢酸
1.1×10-6モル）を６日間隔（doubling timeの１倍）で
添加する一方、培養槽の他方から倍地と増殖した細胞を
抜き出しながら培養を行つた。60日間に亘つて連続培養
を行つた結果、アカネ細胞の比増殖速度は0.11（da
y-1）、アンスラキノン類の含量は1.1％であつた。
比較例 ５ 実施例４において、ホルモン成分（2,4−ジクロロフ
エノキシ酢酸2.4×10-4モル）を12日間隔（doubling ti
meの６倍）で添加した以外は実施例４と同様に培養を行
つた結果、タバコ細胞の比増殖速度は0.29（day-1）で
あつた。
比較例 ６ 実施例５において、ホルモン成分（ベンジルアデニン
1.1×10-6モル、2,4−ジクロロフエノキシ酢酸1.1×10
-7モル）を0.6日間隔（doubling timeの0.1倍）で添加
した以外は実施例５と同様に培養を行つた結果、アカネ
細胞の比増殖速度は0.05（day-1）、アンスラキノン類
の含量は0.7％であつた。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体培地を用いて植物を組織培養するに当
    たつて、植物ホルモンを以下の（ａ）と（ｂ）の条件を
    満足するようにして培地に間欠的に供給しながら培養を
    行うことを特徴とする植物の組織培養方法。 （ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ（day）を細胞の倍増
    時間の0.5〜５倍とする。 （ｂ）〔Ｉ〕式を満足するような量の植物ホルモンを培
    地に加える。 10-12＜A/（Ｄ・Ｗ）＜10-6 〔Ｉ〕 ここでＡは培地に間欠的に加えられる植物ホルモンの量
    〔モル〕、Ｗは培養帯域にある細胞の新鮮重量〔ｇ〕、
    Ｄは植物ホルモンの供給間隔〔day〕を表す。
  2. 【請求項２】培地に残存する植物ホルモンの濃度が実質
    的に零になつた時点で植物ホルモンを培地に間欠的に供
    給することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
    組織培養方法。
  3. 【請求項３】培地の栄養基質濃度を所定の濃度に調整し
    た液体培地を培養帯域に連続的または非連続的に供給す
    る一方、培養帯域の他方より培養液を連続的または非連
    続的に抜き出して、培養帯域中の培地を更新させながら
    培養を行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項ない
    し第２項に記載の組織培養方法。
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