JPS63196269A - 植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は植物の組織培養方法に関する。更に詳しくは、
液体培地を用いて植物を組織培養するに当って、植物ホ
ルモンを特定の条件のもとに培地に間欠的に供給するこ
とにより細胞の増殖速度が速く、かつ長期間安定した培
養が可能となる組織培養方法に関する。

〔従来技術と問題点〕

従来の組織培養方法としては、例えば植物ホルモン、を
所定濃度にした培地を用いて培養を開始しても、それ以
後には植物ホルモン等の培地成分を新たに追加供給して
その濃度を適宜調整して培養を続ける方法については試
みられ、でいないようである。

培養開始後は、植物ホルモン等の培地成分は細胞によっ
て消費され次第にその濃度を低下させてゆくので、ある
培地成分にとっては培養を継続する上で好ましくない濃
度範囲になっていることも考えられる。従来のこのよう
なバッチ培養の方法では細胞の増殖速度はかんばしくな
く、又細胞の生育安定性も良くない。

一方、連続培養方法として培養物と一緒に培養液を培養
帯域外へ排出して培地を更新して培養する方法が知られ
ている。例えば「醗酵工学」第６１巻１１７〜１２８頁
（１９８３年）には、タバコ植物細胞を培養する方法と
して２．４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）の
植物ホルモンを含む液体培地を更新させながら連続培養
する方法が示されており、この場合には培養期間中はぼ
一定濃度の植物ホルモンが培地に存在するものと考えら
れる。又培地を更新させて培養する方法として特公昭６
１−３６９１５号公報には培地液中の細胞を沈降させて
得られる培養上清を培養槽外に排出しながら新鮮培地を
加えて培養する浮遊細胞の高濃度培養の方法が示されて
いる。しかしこれら従来の方法に示された培養方法では
、培養細胞の増殖速度や生育安定性が不充分であり、従
って培養によって得られる二次代謝産物の例えばアルカ
ロイドや色素の生産量は未だ充分ではなく改善の余地が
ある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

かかる背景のもとに本発明者等は、従来法に比べて細胞
の増殖速度が速く、また生育安定性に優れ二次代謝産物
を効率良く高収率で得ることのできる培養方法について
検討したところ、植物ホルモンを培養期間中必ずしも一
定濃度に維持する必要はなく、細胞の成長に合わせてそ
の濃度を適宜変えることが良いことを認めた。そしてこ
の知見をもとに前記目的を達成できる組織培養方法に関
する発明を完成するに到った。

〔発明の概要〕

すなわち、本発明の方法によれば、液体培地を用いて組
織培養するに当たって、植物ホルモンを以下の（ａ）と
（ｂ）の条件を満足するようにして培地に間欠的に供給
しながら培養を行うことを特徴とする植物の組織培養方
法が提供される。

（ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ〔時間〕を細胞の倍増
時間の０．５〜５倍とする。

（ｂ）ＣＩ３式を満足するような量の植物ホルモンを培
地に加える。

１０−”　＜　Ａ／Ｄ　−Ｗ＜１Ｏ−ｈ（１）ここでＡ
は培地に間欠的に加えられる植物ホルモンの量〔モル〕
、Ｗは培養帯域にある細胞の新鮮重量〔ｇ〕、Ｄは植物
ホルモンの供給間隔（ｄａｙ　）を表わす。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の植物の組織培養方法が適用される植物としては
特に限定されず、従来の組織培養が適用できる植物であ
れば、本発明の方法を該植物に適用することは原理的に
可能である。このような植物として具体的には、ズボイ
シア・ミオポロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｏｐｏ
ｒｏｉｄｅｓ）、ズボイシア・ライヒハルデイ（Ｄｕｂ
ｏｉｓｉａ　１ｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ）等のズボイシ
ア属植物、ダツラ・タック（Ｄａｔｕｒａ　ｔａｔｕｌ
ａ）。

ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒａ　ａｒｂｏｒｅａ）
、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍ
ｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、スコボリア・ジャポニ
カ（５ｃｏｐｏｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）等のスコポリ
ア属植物、ヒョシアマス０ニガー（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス属植物およびアトローバ・
ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）等
のアトローパ属植物などのナス科植物、オウレン（Ｃｏ
ｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍａｋｉｎｏ）、セリバ
オウレン（Ｎａｋａｉ）　、キクバオウレン（Ｃ，ｊａ
ｐｏｎｉｋａ　Ｍａｋｉｎ。

ｖａｒ、　ｊａｐｏｎｉｋａ）、コセリバオウレン（Ｃ
，ｊａｐｏｎｉｋａＭａｋｉｎｏ　ｖａｒ、　ｎ＋ａｊ
ｏｒ　５ａｔａｋｅ）　、バイカオウレン（Ｃ，ｑｕｉ
ｎｑｕｅｆｏｌｉａ　Ｍｉｑ、）およびミツバオウレン
（Ｃ，ｔｒｉｆｏｌｉａ　５ａｌｉｓｂ、）等のコプテ
イス属の植物、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　
ｍ１ｎｕｓ　Ｌ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｃｕｍＭｉｑ、
）等のサリクトラム属の植物、サリントリザ属の植物お
よびヒドラスチス属植物等のキンポウゲ科植物、ケシ科
植物のケシ、マメ科植物のカンゾウ、セリ科植物のニン
ジン、ミシマサイコ、タデ科植物のダイオウ、キョウチ
クトウ科植物のインドジャボク、ニチニチソウ、ナス科
植物のタバコ、ムラサキ科植物のムラサキ、シソ科植物
のシソ、ハツカ、アカネ科植物のコーヒー、ゴマノハグ
サ科植物のジキタリスなどを挙げることができる。

本発明では前記植物の組織（細胞、器官を含む）を液体
培地を用いて、培養が行われるが、この場合の液体培地
としては、従来から知られている植物の組織培養に使用
されている培地が使用できる。

該培地として゛具体的には無機成分、炭素源および植物
ホルモンを必須成分とし、これにビタミン類を添加し、
更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である。該
培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナト
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバ
ルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的
には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫
酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸量、モリブ
デン酸ナトリウム、酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、
硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示でき
る。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモンとしては、インドール酢酸（ＩＡ
Ａ）　、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、Ｉ）−クロロフ
ェノキシイソ酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類およびカイネチン、
ゼアチンおよびベンジルアデニン等のサイトカイニン類
を例示できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢｌ）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンｃ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
Ｂｔ）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システィン、チロシンおよびリジン
などを例示できる。

本発明で使用される液体培地は、通常は、前記無機成分
を約０．１μＭないし約１０Ｏｎ＋Ｍ、前記炭素源を約
１　ｇ　／　１２ないし約１００　ｇ　／　ｊｌ　、前
記ビタミン類を約０．１ｍｇ　／　１２ないし約１５０
ｍｇ／ｌおよび前記アミノ類類を０ないし約１０００ｍ
ｇ／　Ｉｔ含ませて使用されることが望ましい。植物ホ
ルモンについては、本発明では培地に特定条件のもとに
特定量の植物ホルモンが間欠的に加えられるわけである
が、植物ホルモンが間欠的に加えられる直前の培地にお
ける植物ホルモン濃度は通常０　（検出限界以下の濃度
）あるいはそれに近い濃度になっているが、必要に応じ
て該濃度がＯ−１０−”Ｈの範囲にあっても差し支えな
い。又植物ホルモンが間欠的に培地に加えられた直後の
培地における植物ホルモン濃度は通常１０−４ないし１
０−　”　Ｍ、好ましくは１０−　’ないし１０−　”
Ｍの範囲にあるようにして後述する特定条件のもとに後
述の（Ｉ）式によって規定される所定量の植物ホルモン
が培地に間欠的に加えられる。

本発明で使用される培地として具体的には、従来から知
られている植物の組織培養に用いられている培地、例え
ば、ムラシゲ・スクーグ（”６２）（Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リンスマイヤー・スク
ーグ（ＲＭ−１９６５）　　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆
　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、ホワイト（’６３）　　（Ｗ
ｈｉｔｅ　）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ　）
の８−５培地、三井のＭ−９培地の培地等に前記した炭
素源を添加し、更に必要に応じて前記した植物ホルモン
、ビタミン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を
例示できるが、本発明ではこの中でも特にリンスマイヤ
ー・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調
製される培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培
地の組成に関しては、例えば、行内、中島、古谷著の「
新植物組織培養Ｊ　Ｐ３Ｂ６〜Ｐ３９１、朝食書店、１
９７９年に記載されている。

本発明では前記液体培地を用いて前記植物を組織培養す
る場合、本発明を特徴づける以下の条件のもとに培養が
実施される。以下該条件について詳述する。

本発明に係る植物組織培養方法においては、液体培地に
占める細胞濃度は任意であるが、好ましくは細胞濃度を
液体培地に対して１００〜５００（ｇ／ｆ）　、特に好
ましくは２００〜４００（ｇ／ｌ）の範囲にあるように
して培養を行うと、培養槽の単位容積当たりの細胞の収
量を高くして効率良く培養できるので望ましい。細胞濃
度が通常５００ｇ／１以上になるとスラリー濃度が高く
なり培養液の攪拌、混合が不充分となるため、効率良く
酸素供給を行うことが困難となり、培養中に細胞の壊死
などが起こって、細胞の正常な増殖が困難となりやすい
。また、酸素の供給を充分にしようとして攪拌を激しく
すると細胞の破壊、損傷が起きるなどして培養が困難と
なる。このように細胞濃度を５００（ｇ／ｌ）を越えて
高くした場合には、培養にとって好ましくないことが起
きるので通常は細胞濃度は５００（ｇ／ｌ）以下にして
培養を行うことが好ましい。培養期間中には細胞が増殖
してその量を増すので、本発明では必要に応じて培養期
間中に細胞を適宜の量培養帯域外へ適宜方法によって取
り出すことによって、培養帯域中の細胞濃度を適宜濃度
に維持することができる。なお細胞細胞濃度を算出する
際の細胞の重量は湿った（ｗｅｔ）状態で測定された新
鮮重量である。ここに新鮮重量とは通常以下の方法によ
って求められる細胞の重量である。すなわち、組織培養
物を濾布をひいたヌツチェにとり、水洗ポンプなどで５
分間濾過を行い、細胞以外の培養液を除いたときの細胞
の重量である。このようにして得られる細胞は植物によ
っても異なるが通常含水率が８０〜９５−ｔ％である。

本発明に係わる組織培養では植物の組織片や細胞などが
培養される。該組織片としては茎頂、茎、葉、花、種子
、根などの組織片を例示でき、組織片から誘導されるカ
ルスや、培養細胞も更に組織培養の原料として用いるこ
とができる。

本発明に係わるｍ織培養方法はバッチ培養でも連続培養
でも行うことができるが、連続培養に適用することが好
ましい。この連続培養の場合には、培地の栄養基質濃度
を所定の濃度に調整した液体培地を培養帯域に連続的ま
たは非連続的に供給する一方、培養帯域の他方により培
養液を連続的または非連続的に抜き出して、培養帯域中
の培養液を更新させながら組織培養を行うことができる
。

培養液の更新は連続的であっても非連続的であってもよ
い。

ここで栄養基質とは、前述した本発明で使用する液体培
地の培地成分であって、前記した無機成分、炭素源、植
物ホルモン、ビタミン類およびアミノ酸類である。

また栄養基質濃度が所定の濃度に調整された培養液とは
、前述したように無機成分を約０．１μＭ〜約１００ｍ
Ｍ、炭素源を約１〜約１００　ｇ　／　１、ビタミン類
をＯないし約１５０＋ｓｇ／　Ｉｔ　、アミノ酸類をＯ
ないし約１０００ｍｇ／　ｌの濃度範囲に調整した液体
培地である。液体培地を更新させながら行う連続培養法
の場合には、培養帯域に供給される液体培地中の植物ホ
ルモン濃度については通常Ｏ（検出限界以下の濃度）で
あることが好ましいが、必要に応じてＯ〜１０−　”−
の範囲で植物ホルモンをふくんでいても差し支えない。

培養帯域に植物ホルモンが間欠的に加えられた直後の培
養帯域における植物ホルモン濃度は前述と同様に通常１
０−４〜１０−”Ｍ、好ましくは１０−ｓ〜１０−”Ｍ
の範囲にある。本発明では培養帯域に供給される培地成
分の濃度を前記範囲になるように調整した液体培地につ
いては、通常は新鮮な液体培地を用いることが好ましい
が、培養帯域から抜き出された培地の栄養基質濃度を調
整してからこれを再度循環使用する方法を行っても差し
支えない。循環使用する場合には培養液中の細胞の代謝
によって生じる老廃物を適宜除去する処理を行うことが
好ましい。

本発明では培養液を更新させながら組織培養を行う場合
には、培養槽（培養帯域）中の培養液の量をＶ　（ｆ）
　、培養槽に供給する液体培地の量をＦ　（１／ｄａｙ
　）としてＦ　／　Ｖ　（１／　ｄａｙ−’）で定義さ
れる培地更新率と組織培養物の比増殖速度μ（ｄａｙ−
’）の関係がμ≦Ｆ／Ｖ＜２０μの範囲にあるようにし
て植物の組織培養を行うことが好ましい。ここで比増殖
速度μ（ｄａｙ−’）とは以下の方法によって定義され
る量である。

培養細胞を培養帯域外へ排出させない場合、培養のある
時期ｔｏの細胞の量をｘｏとし、を時間（日）後の細胞
の量をｘｔとした場合、比増殖速度μは次式で定義され
る。

ｘｔ ｌ、ｌ− Ｏ μ　２ また細胞の量をｘｏと維持して増殖した細胞を培養帯域
外に排出した場合、を時間（日）後培養帯域外に排出さ
れた細胞の量をｙｔとすると比増殖速度μは次式で定義
される。

ｘｔ Ｏ０ｔ そしてμのもつその物理的意味は（ｔｉｍｅ”’）の次
元をもち、μの値が大きいほど組織培養物の増殖が速い
ことになる。

本発明では比増殖速度μの値は植物の種類によっても異
なるが通常０．０２〜０．４　（ｄａｙ−’）　、好ま
しくは０．０５〜０．２　（ｄａｙ−’）の範囲にある
ようにして組織培養が行われる。本発明で連続培養法を
用いる場合には、培地の栄養基質の濃度が所定の濃度に
調整された液体培地を培養帯域に連続的または非連続的
に供給する際の供給ｆＪＦ　（β／　ｄａｙ）はμ≦Ｆ
／Ｖ＜２０μの式をもんぞくするようにして決めること
が好ましいことは前述したとおりである。この場合の培
地更新率Ｆ／Ｖの値としては通常０．０２〜８　（ｄａ
ｙ−’）　、好ましくは０．０５〜４　　（ｄａｙ−’
）の範囲にある。

本発明では培養帯域の他方より培養液を連続的または非
連続的に抜き出す場合、培養中の培養槽における細胞の
濃度を１００〜５００（ｇ／Ｊ）の範囲になるようにし
て培養することが好ましいが、この際培養槽から培養液
のみを抜き出してもよいし、あるいは必要に応じて適宜
量の細胞を培養液と共に抜き出しても差し支えない。

本発明では培地更新率（Ｆ／Ｖ）が比増殖速度μよりも
小さなＦ／Ｖ＜μの場合には、細胞の濃度が高くなりす
ぎてしまい、細胞の最適濃度を維持できなくなるなどの
理由から培養帯域から培養液だけを取り出すことよりも
適宜量の培養細胞も含めて取り出すことが好ましく、例
えば培養槽に設けられた排出管より細胞を含む培養液を
取り出すと共に、培地の栄養基質濃度が前記所定濃度に
調製された液体培地を培養槽に送入して培養槽における
細胞の濃度を適宜濃度にして培養することもできる。

本発明で連続培養法を用いる場合には培地更新率（Ｆ／
Ｖ）が比増殖速度μより極端に大きい２０μ≦Ｆ／Ｖの
場合には、細胞の黒化、壊死などの悪影響が通常おこり
易い。そこで本発明では培地更新率（Ｆ／Ｖ）をμ≦Ｆ
／Ｖ＜２０μの範囲で制御することによって組織培養を
行うことが特に好ましい。

本発明においては、培養帯域の他方により連続的または
非連続的に抜き出される培養液の量としては、通常は前
述した培養帯域に供給される培地量Ｆ　（Ｉｔ　／ｄａ
ｙ　）に相応する量であるが、必ずしもこの量に限定さ
れるものでは無く、例えば前記したＦ／Ｖ＜μの条件で
培養している場合には必要に応じて培地の抜き出し量を
Ｆ　（１／ｄａｙ　）よりも適宜置場しても差し支えな
い。

本発明では前述の如く植物ホルモンを以下の（ａ）と（
ｂ）の条件を満足にするようにして培地に間欠的に供給
して培養が行われる。

（ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ〔時間〕を細胞の倍増
時間の０．５〜５倍とする。

（、ｂ”）　　ＣＩ）式を満足するような量の植物ホル
モンを培地に加える。

ｔｏ”＜Ａ／Ｄ−Ｗ＜１ｏ−”　　ＣＩ）ここでＡは培
地に間欠的に加えられる植物ホルモンの量〔モル〕、Ｗ
は培養帯域にある細胞の新鮮重量〔ｇ〕、Ｄは植物ホル
モンの供給間隔（ｄａｙ　）を表わす。

以下本発明に係わる植物ホルモンの供給方法について詳
述する。本発明では（ｂ）の（１）式を満足するような
量（Ａ）の前記した植物ホルモンが培地に間欠的に加え
られるが、この場合の間欠的な供給の仕方としては先の
（ａ）に示したように、植物ホルモンを供給するときの
間欠的な時間間隔りが培養帯域における細胞の倍増時間
（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）の０．５〜５倍となるよ
うにして植物ホルモンは供給される。ここで細胞の倍増
時間とは、全問題としている培養帯域で培養されている
細胞が増殖してその量を２倍にするのに要する時間であ
って、該倍増時間として具体的には植物の種類や培養条
件によっても多少異なるが通常２〜２０日程度である。

本発明では植物ホルモン供給の間欠的な時間間隔りが細
胞の倍増時間の０．５倍未満の場合には、ホルモンを連
続的に供給した場合と同様に、培養期間が長くなるにつ
れて、細胞の黒化、壊死が起こり細胞の生育を著しく阻
害するなどの理由から好ましくない。またＤが細胞の倍
増時間の５倍以上となるようにして植物ホルモンを供給
した場合には、１回当りに供給するホルモン量が多くな
るため、供給直後には細胞から二次代謝産物が培地中に
放出されたり、ホルモン異常と思われる一時的な細胞の
生育阻害が起こり安定な培養を長期に亘って実施するこ
とが困難になることから好ましくないので、植物ホルモ
ンの間欠的な供給の時間間隔は前記した範囲で行われる
。

なお先のＣＩ）式に示した植物ホルモンのｉｔ　（Ａ）
は培地に間欠的に供給される量であるが、本発明ではこ
れとは別に植物ホルモンを間欠的に添加した直後の培地
における植物ホルモンの濃度は前記したように通常１０
４〜１０−　’Ｈの範囲にあるようにして培養が行われ
るので、培地に間欠的に供給される植物ホルモンの量（
八）は（１）式を満足すると同時に、植物ホルモンが間
欠的に供給された直後の培地の植物ホルモン濃度（間欠
的に供給された植物ホルモン量と供給前の培地に残存す
る植物ホルモン量を合計した量に基づく濃度）も前記し
た１０−’〜１０−’Ｈの範囲にあるように、間欠的に
供給される植物ホルモンの量（八）は選ばれなければな
らない。従って添加される植物ホルモンの量（Ａ）は、
ＣＩ）式によって制約を受ける他に培地に残存する植物
ホルモンの量も考慮して決められる。

そして本発明では培地に残存する植物ホルモンの濃度が
実質的に零になった時点で前記した（ａ）と（ｂ）の条
件を満足するようにして前記した範囲の植物ホルモン濃
度となるように植物ホルモンを培地に間欠的に供給する
方法を用いた場合には、正常な細胞の分裂−肥大のサイ
クルが保持されて、細胞の生育および二次代謝産物の生
産が長期間に亘って可能になるので特に好ましい。なお
本発明では必要に応じて培地に残存する植物ホルモンの
濃度が実質的に零でない前記した範囲の任意の濃度で、
先の（ａ）及び（ｂ）等の条件を満足するようにして植
物ホルモンを間欠的に供給する方法を用いることが出来
ることは言うまでもない。

本発明では先のＣＩ）式で（Ａ／Ｄ−Ｗ）の値が１ｏ−
１１以下の場合（間欠的に加えられる植物ホルモンの量
が少ない）には、細胞の増殖速度が遅くなり、また細胞
の生育が不充分となるので好ましくない。また咳値が１
０−以上の場合には、培地の植物ホルモンの濃度が高く
なり過ぎて細胞の壊死が起こり、しかも二次代謝産物の
生産が著しく低下することがあるなどの理由から本発明
では植物ホルモンの間欠的な添加量は前記範囲で行われ
る。

本発明の組織培養方法を用いるとベルベリン、アトロピ
ン、スコポラミンなどのアルカロイド、シコニン、ブリ
プリン、アリザリンなどの色素成分等の二次代謝産物を
高収率で効率良く得ることができる。

〔発明の効果〕

本発明に係わる植物ホルモンを特定条件のもとに間欠的
に培地に供給して行う組織培養方法によれば、従来法に
比べて細胞の増殖速度が早く、又細胞の生育安定性が優
れているので二次代謝産物を高収量で効率良く得ること
ができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって具体的に説明する
。

実施例１ オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の培養細
胞をリンスマイヤーとスクーグの培地を用いて２１の通
気攪拌型培養槽で培養を行った。培養中の培養槽におけ
る液体培地の容量は１．８１であり、オウレン細胞の濃
度がオウレン細胞の新鮮重量で表わして３００（ｇ／ｌ
）となるように、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に調
整した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍ！／日）に
供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸９ＸＩＱ
−’モル、ベンジルアデニン９Ｘ１０−”モル）を４日
間隔（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの１倍）で添加する
一方培養槽の他方から培地と増殖した細胞を抜き出しな
がら培養を行った。

６０日間に亘って連続培養を行った結果、オウレン細胞
の比増殖速度は０．１８（ｄａシー１）、オウレン細胞
中のベンベリン含量は５．０％であった。

実施例２ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍＺ／日）
に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸３Ｘ１
０−’モル、ベンジルアデニン３Ｘ１０−’モル）を１
２２日間隔ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの３倍）で添加
した以外は実施例１と同様に培養したところ、オウレン
細胞の比増殖速度は０．１７（ｄａｙ−’）、オウレン
細胞中のベンベリン含量は４．９％であった。

実施例３ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍｆ／日）
に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酸＃　４　
Ｘｌ０−’モル、ベンジルアデニン４×ｌＯ″？モル）
を１８８日間隔添加した以外は実施例１と同様に培養し
たところ、オウレン細胞の比増殖速度は０．１６（ｄａ
ｙ″’）　、オウレン細胞中のベルベリン含量は４．７
％であった。

比較例１ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍｆ　７日
）に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸５Ｘ
１０−’モル、ベンジルアデニン５ＸＩＯ−７モル）を
２１日間隔（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの５．３倍）
で添加した以外は実施例１と同様に培養したところ、培
養期間が長くなるにつれてオウレン細胞の比増殖速度お
よび細胞中のベンベリン含量は徐々に低下する傾向を示
し、６０日間培養後の比増殖速度およびベルベリン含量
はそれぞれ０．０８（ｄａｙ−’）　、２．０％であっ
た。

比較例２ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍＺ　７日
）に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸５Ｘ
１０−”モル、ベンジルアデニン５ＸＩＯ−’モル）を
４日間隔（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　、ｔｉｍｅの１倍）で添
加した以外は実施例１と同様に培養したところ、培養細
胞の黒変（壊死）が起こり、３０日間培養後の比増殖速
度およびベルベリン含量はそれぞれ０．０５（ｄａｙ−
’）　、１．５％であった。

比較例３ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍＺ／日）
に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢酸１０−
Ｓモル、ベンジルアデニン１０−”モル）を８ｈｒ間隔
（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの０．０８倍）で添加し
た以外は実施例１と同様に培養したところ、約７日間の
培養でカルスの黒化が起り始め、３０日間培養後の比増
殖速度およびベルベリン含量はそれぞれ０．１０（ｄａ
ｙ−’）　、２．５％であった。

比較例４ 実施例１において、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に
調製した液体培地を培養槽に連続的（５４０ｍＺ／日）
に供給しながら、ホルモン成分（ナフタレン酢ｆｉｌｏ
−’モル、ベンジルアデニン１０−　’　”モル）を４
日間隔（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの１倍）で添加し
た以外は実施例１と同様に培養したところ、細胞の黒化
・壊死は起こらなかったが、細胞の増殖が悪く、比増殖
速度は０．１１（ｄａｙ””）　、ベルベリン含量は５
％であった。

実施例４ タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）の培養
細胞をリンスマイヤーとスクーグの培地を用いて２ｊ２
の通気攪拌型培養槽で培養を行った。培養中の培養槽に
おける液体培地の容量は１．８１であり、タバコ細胞の
濃度がタバコ細胞の新鮮重量で表わして、２１１　　（
ｇ　／　Ｉｔ　）となるように培地の栄養基質濃度を所
定の濃度に調製した液体培地を培養槽に連続的（６００
ｍＺ／日）に供給しながらホルモン成分（２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸４Ｘ１０−’モル）を２日間隔（ｄ
ｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉ＋ｎｅの１倍）で添加する一方、
培養槽の他方から培地と増殖した細胞を抜き出しながら
培養を行った。６０日間に亘って連続培養を行った結果
、タバコ細胞の比増殖速度は０．３８（ｄａｙ−’）で
あった。

実施例５ アカネ（Ｒｕｂｉａ　ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）の培養細
胞をムラシゲとスクーグの培地を用いて２１の通気攪拌
型培養槽で培養を行った。培養中の培養槽における液体
培地の容量は１．８１であり、アカネ細胞の濃度がアカ
ネ細胞の新鮮重量で表わして、１３８ｇＣｇ／ｌ）とな
るように、培地の栄養基質濃度を所定の濃度に調製した
液体培地を培養槽に連続的（６００ｄ７日）に供給しな
がらホルモン成分（ベンジルアデニン１．Ｉ　Ｘ　１０
−’モル、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸１．Ｉ　Ｘ
　１０−’モル）を６日間隔（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍ
ｅの１倍）で添加する一方、培養槽の他方から培地と増
殖した細胞を抜き出しながら培養を行った。６０日間に
亘って連続培養を行った結果、アカネ細胞の比増殖速度
は０．１１（ｄａｙ一つ、アンスラキノン類の含量は１
．１％であった。

比較例５ 実施例４において、ホルモン成分（２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸２．４　Ｘ　１０−’モル）を１２２日間
隔ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅの６倍）で添加した以外
は実施例４と同様に培養を行った結果、タバコ細胞の比
増殖速度は０．２９（ｄａｙ−’）であった。

比較例６ 実施例５において、ホルモン成分（ベンジルアデニン１
．Ｉ　Ｘ　１０’−’モル、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸１．Ｉ　Ｘ　１０−’モル）を０．６日間隔（ｄ
ｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅの０．１倍）で添加した以外は
実施例５と同様に培養を行った結果、アカネ細胞の比増
殖速度は０．０５（ｄａｙ−’）　、アンスラキノン類
の含量は０．７％であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体培地を用いて植物を組織培養するに当たつて
   、植物ホルモンを以下の（ａ）と（ｂ）の条件を満足す
   るようにして培地に間欠的に供給しながら培養を行うこ
   とを特徴とする植物の組織培養方法。 （ａ）植物ホルモンの供給間隔Ｄ〔時間〕を細胞の倍増
   時間の０．５〜５倍とする。 （ｂ）〔 I 〕式を満足するような量の植物ホルモンを
   培地に加える。 １０＾−＾１＾２＜Ａ／Ｄ・Ｗ＜１０＾−＾６〔 I 〕 ここでＡは培地に間欠的に加えられる植物ホルモンの量
   〔モル〕、Ｗは培養帯域にある細胞の新鮮重量〔ｇ〕、
   Ｄは植物ホルモンの供給間隔〔ｄａｙ〕を表わす。
2. （２）培地に残存する植物ホルモンの濃度が実質的に零
   になつた時点で植物ホルモンを培地に間欠的に供給する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の組織培
   養方法。
3. （３）培地の栄養基質濃度を所定の濃度に調整した液体
   培地を培養帯域に連続的または非連続的に供給する一方
   、培養帯域の他方より培養液を連続的または非連続的に
   抜き出して、培養帯域中の培地を更新させながら培養を
   行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第２
   項に記載の組織培養方法。