JPH01240194A - トロパン系アルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はズボイシア、ダツラ、ハシリドコロ、ヒヨス等
のトロパン系アルカロイドを代謝産生ずる植物の組織を
特定の培地を用いて組織培養することによりスコポラミ
ンおよび／又はヒヨスチアミン等のトロパン系アルカロ
イドを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

スコポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤および副交感神経しゃ断
薬として、またヒヨスチアミンは副交感神経しゃ断薬と
して、それぞれ医薬として重用されている。これらの化
合物は、天然の植物体中から抽出して製造されているが
、天然物を原料としているため、その生産が天候に左右
されること、収穫時期が限定されていることなどが問題
となっている。そのためこれらの化合物を植物の組織培
養により生産する研究が内外で数多く行われた。

カルスによる生産では、山田らによるヒヨスのカルスに
よる生産例が知られている（　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲ
ｅｐｏｒ　ｔｓ上、１０１〜１０３（１９８２）　）が
、スコポラミン含有は２０ｐｐｍと、天然の植物体中の
含量と比較して低いものであった。また山田らは、ズボ
イシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｌｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
　Ｆ、　Ｍｕｅｌｌ）の組織培養により得られる不定根
中に著量のスコポラミンおよびヒヨスチアミンが存在す
ることを見出している（　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ
ｐｏｒｔｓ　３．１８６〜１８８（１９８４）　）が、
その量はまだ充分とは言えないものであった。

そこで、ズボイシア不定根の各種培養条件を検討し、培
地のアンモニウムイオンと硝酸イオンの比率を０．２以
上にすること、培地の溶存酸素濃度を１０ないし６５ｐ
ｐｍとすることにより、トロパン系アルカロイドの生産
性を向上させることを見出し、本出願人はそれぞれ特願
昭６０−１４３８８２号および特願昭６０−１４３８８
１号として特許出願をしているが、工業的な見地からは
その生産性を更に高めることが望まれる。

（発明が解決しようとする課題〕 したがってこのような組織培養によりトロパン系アルカ
ロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産性を高
めることが重要な課題であった。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、ズボイシア
、ダツラ、ハシリドコロおよびヒヨス属等のトロパン系
アルカロイドを産生ずる植物の不定根等の組織、細胞を
効率よく培養する方法を研究した結果、次のような事実
を見出した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち該植物の組織を、特定のアミノ酸を含有する培
地を用いて特定の方法で組織培養を行うと、得られる培
養細胞あるいは不定根等の培養によって得られる培養組
織中のトロパン系アルカロイドの含量が向上するか、あ
るいは培養細胞、不定根等の培養組織の生育が促進され
、結果としてトロパン系アルカロイドの生産性が向上す
ることを見出し本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明によれば、トロパン系アルカロイドを
産生する植物の組織をフェニルアラニン及び／又はその
誘導体を含有する培地を用いて組織培養するに際し、一
度に添加するフェニルアラニン及び／又はその誘導体量
を０．５ｍＭ以下とし、培養期間を通じて複数回にわた
って逐次添加して培養を行ないトロパン系アルカロイド
を生産することを特徴とするトロパン系アルカロイドの
生産方法が提供される。

本発明では組繊培養はトロパン系アルカロイドを産生ず
る植物を用いて行われるが、該当する植物として具体的
には、ズボイシア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ
　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）＋　ズボイシア・ライヒハ
ルディ（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｉｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
）等のズボイシア属植物、ダツラ・タック（Ｄａｔｕｒ
ａ　ｔａｔｕｌａ）、ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒ
ａ　ａｒｂｏｒｅａ）＋ダツラ°ストラモニウム（Ｄａ
ｔｕｒａ　５ｔｒａａ＋ｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物
、スコポリア・ジャポニカ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐ
ｏｎｉｃａ）等のスコボリア属植物、ヒョシアマス・ニ
ガー（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス
属植物およびアトローパ・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　
ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）等のアトローパ属植物などのナ
ス科植物を例示することができる。

本発明では前記植物の組織を培養してトロパン系アルカ
ロイドを生産するにあたって培地に一度に添加するフェ
ニルアラニン及び／又はその誘導体の量を０．５ｍＭ未
満とし、培養期間を通じて複数回にわたって逐次添加し
て培養する方法が用いられる。

本発明で使用される培地はフェニルアラニン及び／又は
その誘導体を必須成分として含む培地であって、該成分
以外の他の成分として無機成分および炭素源を必須成分
とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更
に必要に応じて本発明に係わるフェニルアラニン及び／
又はその誘導体以外の他のグリシン、グルタミン酸、リ
ジン等のアミノ酸類を添加した培地である。

本発明に係わるフェニルアラニン及び／又はその誘導体
は一般式（１） ％式％（１） 〔式中、Ｒ８はＨ又はＲ−Ｃ−（Ｒは１１又は低級アル
キル基）を示し、ＲｚはＯＨ，ＮＨｚ又ＯＭ　（Ｍは金
属イオンを示す）で表す。〕 で表わされるアミノ酸とその誘導体であって、具体的に
はフェニルアラニンおよびＮ−アセチルフェニルアラニ
ン等のＮ−アシルフェニルアラニン、フェニルアラニン
アミド等のアミド誘導体を例示できる０本発明ではこれ
ら化合物のうち該化合物中のカルボキシル基が培地を構
成する後述の無機成分と同じ金属イオンと塩を形成して
いても良く、本発明ではこの塩も培地成分として使用で
きる。

本発明では、トロパン系アルカロイドを産生ずる植物の
組織培養の期間中に培地に添加されるフェニルアラニン
および／又はその誘導体の全添加量の合計量としては、
培養に供される例えば不定根等の該植物の組織の乾燥重
量１０■当たりで表示して通常は０．２〜２．０ｍＭの
範囲にある。

本発明ではこの全添加量を複数回に分けて、しかも各１
回毎の添加量が０．５ｍＭ未満となるようにして添加し
て培養が行われる。本発明において複数回とは２回以上
を意味する。

本発明では、１回の添加量が０．５ｍＭ以上になると細
胞の生育量が低下し、ひどい場合には壊死し、スコポラ
ミン、ヒヨスチアミンの生成量が低下するので、１回の
添加量は０．５ｍＭ未満にして行われる。１回の添加量
の下限については特に制限はないが添加量をあまり少な
くすると、スコポラミン等の生産性が落ち経済的ではな
いことから、通常は０．００１ｍＭ〜０．５０ｍＭ、好
ましくは０．０１ｍＭ〜０．３　ｍＭの範囲で行われる
。

本発明で使用される培地において、前記したフェニルア
ラニンとその誘導体以外の他の培地成分については、無
機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、
カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜
鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の
元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝酸
カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸１
水素カリウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、
硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛
、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、’ｐ
−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＭ）およ
びこれらの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデ
ニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニ
ン類を例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常
は培地に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添
加する場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０−　
’Ｍ　（０，０２■／ｌ）以下の低濃度で使用すること
が好ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＢ、）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
Ｂ、）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸およびリジンなどを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μＨないし約１１００Ｉｌ１、前記炭素源を約１ｇ／ｌ
ないし約１００ｇ／ｌ、前記植物ホルモン類を約０．０
１μ門ないし約１００μｎ、前記ビタミン類を約０．１
■／２ないし約１５０ｍｇ／ｆおよび前記アミノ酸類を
０ないし約１０Ｏｎ＋ｇ／ｊ！含ませて使用されること
が望ましい。

本発明のズボイシア属植物の組織培養に用いられる前記
培地として具体的には、従来から知られている植物の組
織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スク
ーグ（’６２）　　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏ
ｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９
６５）　　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）
の培地、ホワイト（’６３）　（Ｗｈｉｔｅ）の培地、
ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ−５培地、三井のＭ
−９培地、エッチ・エッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　Ｎ１ｔｓｃ
ｈ　）の培地等に前記した炭素源および植物ホルモンを
添加し、更に必要に応じて前記したビタミン類、アミノ
酸類を添加して調製される培地を例示できるが、本発明
ではこの中でも特にニッチ・エッチ、リンスマイヤー・
スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製さ
れる培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培地の
組成に関しては、例えば、行内、中島、古谷著の［新植
物組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１、朝食書店、１９７
９年に記載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天やゼラ
チン等を通常０．５〜１％含有させた固型培地であるが
本発明では液体培地を用いることが好ましい。

本発明の組織培養ではトロパン系アルカロイドを代謝産
生ずる植物の組織片は、前記培地を用いて組織培養され
てトロパン系アルカロイドを含有する培養細胞ないし培
養組織が得られる。

本発明では該培養組織としては不定根が特に好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の組繊として具
体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽などの他に
も本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の組織培養
方法によって得られる該植物の培養細胞ないし培養組織
を例示できる。本発明では、これらの中では植物組織を
前もって組織培養して得られる不定根を使用してこれを
本発明に係わる培地を用いて組織培養することが特に好
ましく、この場合には原料の不定根が本発明の培地を用
いて増殖培養されてトロパン系アルカロイドを多量含有
する不定根が得られる。

本発明では通常前記した組織片あるいは細胞からカルス
が誘導され、該カルスを継代培養して得られる培養細胞
ないしは培養組織は本発明の前記培地を用いて増殖培養
されてトロパン系アルカロイドを多量含有する培養物、
特に不定根を得るというような組織培養の方法を用いる
ことが好ましい。

本発明では不定根を用いる場合に、植物の組織片を例え
ば毛根病菌（例えば＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓ）で感染させ、これによって出現する毛
根を用いることもできる（例えば本出願人に係わる特願
昭６１−８９９７５号で提案した方法を用いることもで
きる。） 本発明の方法によって得られるトロパン系アルカロイド
として具体的には、スコポラミン、ヒヨスチアミン及び
これらの化合物のアセチル化合物を例示できるが、この
中ではスコポラミンとヒヨスチアミンが好ましい。

本発明ではトロパン系アルカロイドを含有する培養細胞
から該アルカロイドを分離する方法としては、例えば薬
局法等に記載されている、トロパン系アルカロイドを含
有する植物からこれら化合物を単離精製する場合に用い
られてきた通常の方法を採用することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ 当社薬草園にて栽培したＤｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｐｏｒ
ｏｉｄｅｓＢ、Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミ
ン液に１０分間浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後
、約ＩＣｌ１１に切断し、ナフタレン酢酸およびベンジ
ルアデニンをそれぞれ１０−　’Ｍおよび１０−ｈＭと
なるように添加したリンスマイヤー・スクーグの寒天培
地に置床し、２５°Ｃで３０日間培養する。カルス形成
と同時に発生した不定根を切り出し、インドール酪酸を
１０−’ｌ’ｌになるように添加したエッチ・エッチの
液体培地に移植し、２年間継代培養した。このようにし
て得た不定根１０■（乾燥重量）をフェニルアラニン濃
度が０．０５０ｍＭとなるようにフェニルアラニンを添
加し、又、インドール酪酸を１０−’Ｍとなるように添
加したエッチ・エッチの液体培地２０ｄを含む１０〇−
容の三角フラスコに移植して振とう培養を開始、２日ご
とにフェニルアラニン濃度を０．０５＋ａＭ増加するよ
うにフェニルアラニンを逐次添加し、３週間培養した。

得られた不定根を乾燥後、塩基性のクロロホルム−メタ
ノール液５０ｍＺで抽出した。これに４０−のＩＮ硫酸
を加えてアルカロイド層を硫酸層に移した。さらに、ア
ンモニア水２ｄおよびクロロホルム４０ｍ／を加えてア
ルカロイドをクロロホルム層に移し、これを減圧濃縮し
、ガスクロマトグラフィーでアルカロイド量を分析し　
た。この場合のアルカロイドの生産量を表１に示　した
。なお、ガスクロマトグラフィーの分析は以　下の条件
で行った。

カラム：　５ｉｌｉｃｏｎｅ　０Ｖ−１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ　（Ｍｅｓｈ　８０〜１０
０）３ＩＩＩＩｎφＸ１ｍガラスカラム キャリャガス二Ｎ２ カラム温度　＝２００°Ｃ 実施例２ ズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅ
ｓ　Ｒ，Ｂｒ）の葉を１０％アンチホルミンで処理した
のち、ベンジルアデニン１０−’Ｍ含むリンスマイヤー
・スクーグ（ＬＳ）の寒天培地に置床した。１ケ月後発
生した苗条を同じ培地で４０日間継代培養して得られる
まだ本化していないズボイシア苗条の茎を１〜２ｃｍ程
度に切断し、２４時間振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＨＲＩ−１の懸濁液
（１０７個／ｒｎｌ）に浸漬後、植物ホルモンを含まな
いＬＳ寒天培地に置床した。

３週間後面条の茎の切断部位から不定根が発生した。こ
れをアンピシリン０．１■／ｍｆ含むＬＳ液体培地で２
日間処理し菌を含まない自己増殖性のズボイシア感染不
定根を得た。このズボイシア感染不定根をＬＳ液体培地
で１年間継代培養した。この不定根１０■（乾燥重量）
をＬ−フェニルアラニンが濃度５０μ門になるように添
加したＬＳ液体培地２０ｄを含む１００ｄ容三角フラス
コに移植し、２日ごとにフェニルアラニン濃度を５０μ
台増加するようにフェニルアラニンを逐次添加し、３週
間培養して得られた不定根を乾燥後、実施例１と同様に
処理してアルカロイドを分析した結果を表１に示した。

比較例１ 実施例１悼おいてフェニルアラニンを添加しない培地を
用いた以外は該実施例と同様に行った結果を表１に示し
た。

比較例２ 実施例１においてフェニルアラニンを培養初期にのみ２
ｍＭ添加した以外は、該実施例と同様に行った結果を表
１に示した。

比較例３，４ 実施例１においてフェニルアラニンを培養初期にのみ１
．０ｍＭ、０　、５０ｍＭ添加した以外は、該実施例と
同様に行った結果を表１に示した。

実施例１と比較例４について説明すると、再実験は培養
期間中のフェニルアラニンの添加量の合計量はいずれも
０．５０ｍＭと同じであるが、実施例１ではこれを１０
回に分けて各回の添加量が０．０５０ｍＭとなるように
して添加し培養したのに対して・比較例４では最初に全
量の０．５抛門を添加した。このときの両者の結果をみ
ると、複数回に分けて添加した実施例１では不定根の生
育量はほぼ同じだが、スコポラミン、ヒヨスチアミンの
生成量が増大した。

比較例５ 実施例２においてフェニルアラニンを添加しない培地を
用いた以外は、該実施例と同様に行った結果を表１に示
した。

（本頁以下余白） 〔発明の効果〕 本発明の組繊培養によるトロパン系アルカロイドの生産
方法を採用すれば、従来法に比べてトロパン系アルカロ
イドを、中でも特にスコポラミンおよび／又はヒヨスチ
アミンを大量に効率よく生産することができる。

出願人　生体機能利用化学品新製造技術研究組合代理人
　弁理士　平　木　祐　輔

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. トロパン系アルカロイドを産生する植物の組織をフェニ
   ルアラニン及び／又はその誘導体を含有する培地を用い
   て組織培養するに際し、一度に添加するフェニルアラニ
   ン及び／又はその誘導体の量を０．５ｍＭ未満とし、培
   養期間を通じて複数回にわたって逐次添加して組織培養
   を行ない、トロパン系アルカロイドを生産することを特
   徴とするトロパン系アルカロイドの生産方法。