JPH01124383A - 植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物の組織を培養する方法、特に代謝生産物を
効率よく生産するのに適した方法に関する。

〔従来の技術］ 植物体中に含有される有用な物質としては、例えば、゛
スコポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤および副交感神経しゃ断
薬として、またヒヨスチアミンは副交感神経しゃ断薬と
して、それぞれ医薬として重用されている。これらのト
ロパン系アルカロイド化合物は、天然の植物体中から抽
出して製造されているが、天然物を原料としているため
、その生産が天候に左右されること、収穫時期が限定さ
れていることなどが問題となっている。そのためこれら
の化合物を植物の組織培養により生産する研究が内外で
数多く行われた。カルスによる生産では、山田らによる
ヒヨスのカルスによる生産例が知られている（　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ上、１０１〜１０３（
１９８２）　）が、スコポラミン含有は２０ｐｐｍと、
天然の植物体中の含量と比較して低いものであった。ま
た山田らは、ズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｌｅｉｃ
ｈ−ｈｓｒｄｔｉｉ　Ｆ、Ｍｕｅｌｌ）の組織培養によ
り得られる不定根中に著量のスコポラミンおよびヒヨス
チアミンが存在することを見出している（　Ｐｌａｎｔ
　　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ　３．１８６〜１８８（１
９８４）　）、が、その量はまだ充分とは言えないもの
であった。そこで、ズボイシア不定根の各種培養条件を
検討し、培地のアンモニウムイオンと硝酸イオンの比率
を０．２以上にすること、培地の溶存酸素濃度を１０な
いし６５ｐｐｍとすることにより、トロパン系アルカロ
イドの生産性を向上させることを見出し、本出願人はそ
れぞれ特願昭６０−１４３８８２号、特願昭６０−１４
３８８１号として特許出願しているが、工業的な見地か
らはその生産性を更に高めることが望まれる。

（発明が解決しようとする問題点〕 したがってこのような組織培養により、例えばトロパン
系アルカロイド等の有用な植物代謝物の工業的な生産を
目指す場合、さらに生産性を高めることが重要な課題で
あった。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、植物の不定
根等の組織、細胞を効果的に培養する方法を研究した結
果、次のような事実を見出した。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち植物の組織を、　（アリールメチル）ブタンニ
酸類又はその誘導体を含有する培地を用いて組織培養を
行うと、得られる培養細胞あるいは不定根等の培養によ
って得られる培養組織中の代謝生産物の含量が向上する
ことを見い出し本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明の方法によれば、植物の組織を（アリ
ールメチル）ブタンニ酸類又はその誘導体を含有する培
地を用いて組織培養することを特徴とする植物の組織培
養方法が提供される。

本発明の組織培養に使用できる植物としては、例えばト
ロパン系アルカロイドを産生ずる植物が挙げられ、具体
的には、ズボイシア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉ
ａ　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）、ズボイシア・ライヒハ
ルディ（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　１ｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
）等のズボイシア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒ
ａ　ｊａｔｕｌａ）。

ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒａ　ａｒｂｏｒｅａ）
、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍ
ｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、スコボリア・ジャポニ
カ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ　ｊａ−ｐｏｎｉｃａ）等のスコ
ポリア属植物、ヒョシアマスニガー（Ｈｙｏｓｃｙａｍ
ｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス属植物およびアトローバ
・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）
等のアトローパ属植物などのナス科植物を例示すること
ができる。

植物として上記のようなトロパン系アルカロイドを産生
ずる植物を用いた場合、本発明の組織培養方法によって
スコポラミンやヒヨスチアミン等のトロパン系アルカロ
イドを効率よく生産することができる。

本発明で前記植物の組織を培養するに当たって（アリー
ルメチル）ブタン二酸又はその誘導体を含有する培地が
用いられる。以下にこれについて詳述する。

本発明で使用される培地は（アリールメチル）ブタン二
酸又はその誘導体を必須成分として含む培地であって、
該成分以外の他の成分として無機成分および炭素源を必
須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加
し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である
。

本発明に係わる（アリールメチル）ブタン二酸又はその
誘導体について以下詳述する。

本発明に係る（アリールメチル）ブタン二酸又はその誘
導体は下記一般式（’Ｉ）で表わされる。

〔式中、Ａｒは炭、化水素基又はハロゲンで置換されて
いてもよいアリール基を示し、Ｒ，、Ｒ，は水素、炭化
水素又はハロゲンを示し、Ｒ，、Ｒ，は０１１゜Ｎ＋ｌ
ｚ、　０Ｒ（Ｒはアルキル基）又はＯＭ　（Ｍは金属イ
オン）を示す］具体的には（フェニルメチル）プタンニ
酸、（３，５−メチルフェニルメチル）プタンニ酸、（
３−イソプロピルフェニルメチル）ブタンニ酸、（３，
５−ジイソプロピルフェニルメチル）ブタン二酸、３−
カルボキシル−４−（５，５−ジイソプロピルフェニル
）−４−メチルペンタン酸などを例示できる。本発明で
はこれら化合物のうち該化合物中のカルボキシル基が培
地を構成する後述の無機成分と同じ金属イオンと塩を形
成しても良く、本発明ではこの塩も培地成分として使用
できる。

本発明では培地に含まれる前記した（アリールメチル）
ブタンニ酸類の使用割合としては１０−７〜１０−’Ｈ
の範囲が好ましく、該範囲の中でも１０−６〜３　Ｘｌ
０−５Ｍの範囲が特に好ましい。トロパン系アルカロイ
ドを生産する場合は、培地中の（フェニルメチル）プタ
ンニ酸類含有量が上記範囲外では、トロパン系アルカロ
イドの生成量はそれ程向上しないので、前記成分の含有
量を前記範囲にした培地を用いて組織培養が行われる。

また、　（アリールメチル）ブタンニ酸類を培養初期に
添加する場合細胞収量が低下するので培養途中で添加す
るほうが好ましい。

本発明で使用される培地において前記した（アリールメ
チル）ブタンニ酸以外の培地成分については、無機成分
としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホ
ウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素を
含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝酸カリウ
ム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸１水素カ
リウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第
２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム
、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ
酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡ＾）、ｐ−クロ
ロフェノキシ酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＭ）およびこれ
らの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニン（
ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン類を
例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常は培地
に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添加する
場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０−’Ｍ（０
，０２ｍｇ／　ｌ　）以下の低濃度で使用することが好
ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＢ＆）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
Ｂ２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、フェニルアラニンおよびリジンなど
を例示できる。

本発明の培地は、通常は、前記無機成分を約０゜１ＭＭ
ないし約１００ｍＭ　、前記炭素源を約１ｇ／２ないし
約１００ｇ／ｊｌ！、前記植物ホルモン類を約０．０１
ＭＭないし約１００μＭ、前記ビタミン類を約０．１■
／ｌないし約１５０ｍｇ／４２および前記アミノ酸類を
０ないし約１００ｍｇ／／２含ませて使用されることが
望ましい。

ズボイシア属植物を用いて組織培養する場合に用いられ
る培地として具体的には、従来から知られている植物の
組織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・ス
クーグ（’６２）　　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆　Ｓｋｏ
ｏｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１
９６５）　　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ　
）の培地、ホワイト（’６３）　（Ｗｈｉｔｅ　）の培
地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ−５培地、三井
のＭ−９培地、ニッチ・エッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　Ｎ１ｔ
ｓｃｈ　）の培地等に前記した炭素源および植物ホルモ
ンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミン類、ア
ミノ酸類を添加して調製される培地を例示できるが、本
発明ではこの中でも特にエッチ・エッチ、リンスマイヤ
ー・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調
製される培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培
地の組成に関しては、例えば、性向、中島、古谷著の「
新植物組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１、朝食書店、１
９７９年に記載されている。

本発明で使用できる培地は液体培地でも寒天やゼラチン
等を通常０．５〜１％含有させた固型培地でもよいが、
特に液体培地を用いるのが好ましい。

本発明の組織培養方法によって、トロパン系アルカロイ
ド等を代謝産生ずる植物の組織片を、前記培地を用いて
組繊培養することにより、トロパン系アルカロイド等の
代謝産物を含有する培養細胞ないし培養組織を得ること
ができる。

本発明では該培養組織としては不定根が特に好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の組織として具
体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽などの他に
も本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の組織培養
方法によって得られる該植物の培養細胞ないし培養組織
を例示できる。トロパン系アルカロイドを産生ずる植物
を用いる場合は、植物ｍ織を前もって組織培養して得ら
れる不定根を使用してこれを本発明に係わる培地を用い
て組織培養することが特に好ましく、この場合には原料
の不定根が本発明の培地を用いて増殖培養されてトロパ
ン系アルカロイドを多量含有する不定根が得られる。

本発明では通常前記した組織片あるいは細胞からカルス
が誘導され、該カルスを継代培養して得られる培養細胞
ないしは培養組織は本発明の前記培地を用いて増殖培養
されてトロパン系アルカロイド等の代謝産物を多量含有
する培養物、特に不定根を得るというような組織培養の
方法を用いることが好ましい。

本発明では不定根を用いる場合に、植物の組織片を例え
ば毛根病菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈ　
ｉｚｏｇｅｎｅｓ）で感染させ、これによって出現する
毛根を用いることもできる　（例えば本出願人に係わる
特願昭６１−８９９７５号で提案した方法を用いること
もできる。） トロパン系アルカロイドを産生ずる植物に本発明方法を
適用した場合に得られるトロパン系アルカロイドとして
具体的には、スコポラミン、ヒヨスチアミン及びこれら
の化合物のアセチル化合物を例示できるが、この中では
スコポラミンとヒヨスチアミンが好ましい。

本発明方法によって得られた、代謝産物を含有する培養
細胞から該代謝産物を分離するには、通常その物質の単
離精製に使用する方法を採用すればよい。

トロパン系アルカロイドを含有する培養細胞から該アル
カロイドを分離する方法としては、例えば薬局法等に記
載されている、トロパン系アルカロイドを含有する植物
からこれら化合物を単離精製する場合に用いられてきた
通常の方法を採用することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１．２．　４．　５ 当社薬草面にて栽培した口ｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｐｏｒ
ｏｉｄｅｓＢ、Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミ
ン液に１０分間浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後
、約１ｃｍに切断し、ナフタレン酢酸およびベンジルア
デニンをそれぞれ１０−’Ｍおよび１０−’Ｍとなるよ
うに添加したリンスマイヤー・スクーグの寒天培地に置
床し、２５°Ｃで３０日間培養する。カルス形成と同時
に発生した不定根を切り出し、インドール酪酸を１０−
’Ｈになるように添加、したエッチ・ニッチの液体培地
に移植し、２年間継代培養した。このようにして得た不
定根１０■（乾燥重量）をインドール酪酸を１０−’Ｍ
になるように添加したニッチ・エッチの液体培地２０ｍ
を含む１００ｍ１容の三角フラスコに移植して培養開始
後１０日目に（フェニルメチル）プタンニ酸濃度が１０
−’Ｍ、　１０−６Ｍ、　１０−’門、１０−’Ｍとな
るように（フェニルメチル）ブタンニ酸を先の液体培地
に添加してさらに１１日間振とう培養した。得られた不
定根を乾燥後、塩基性のクロロホルム−メタノール液５
０−で抽出した。これに４０＋ｎｊのＩＮ硫酸を加えて
アルカロイド層を硫酸層に移した。さらに、アンモニア
水２ｍｆおよびクロロホルム４０ｍ１を加えてアルカロ
イドをクロロホルム層に移し、これを減圧濃縮し、ガス
クロマトグラフでアルカロイド量を分析した。この場合
のアルカロイドの生産量を表１に示した。なお、ガスク
ロマトグラフの分析は以下の条件で行った。

カラム：　５ｉｌｉｃｏｎｅ　０Ｖ−１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏａ＋ｏｓｏｒｂ　Ｗ　（Ｍｅｓｈ　８０〜１
０１００）３φＸ１ｍガラス力ラム キャリャガス二Ｎ２ カラム温度　：　　２００″Ｃ 実施例３ 実施例１において２年間継代培養して得られた不定根１
０■を（フェニルメチル）ブタンニ酸濃度が１０−５Ｍ
となるように（フェニルメチル）ブタン二酸を添加し、
又インドール酪酸を１０−’Ｍとなるように添加したエ
ッチ・ニッチの液体培地２０ＦＢ！を含む１００　ｍｆ
容の三角フ′ラスコに移植して３週間振とう培養して得
られた不定根を乾燥後、実施例１と同様に処理してアル
カロイドを分析した結果を表１に示した。

比較例１ 実施例１において（フェニルメチル）ブタンニ酸を添加
しない培地を用いた以外は該実施例と同様に行なった結
果を表１に示した。

実施例６〜８ 実施例１において（フェニルメチル）ブタン二を１０−
’Ｍ、　１０−５Ｍ、　’１０−’Ｍ用いた以外は該実
施例と同様に行なった結果を表１に示した。

実施例９ ズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅ
ｓ　Ｒ，Ｂｒ）の葉を１０％アンチホルミンで処理した
のち、ベンジルアデニン１０−’Ｍを含むリンスマイヤ
ー・スクーグ（ＬＳ）の寒天培地に置床した。１ケ月後
発生した苗条を同じ培地で４０日日間化培養して得られ
るまだ本化していなズボイシア苗条の茎を１〜２　ｃｍ
程度切断し、２４時間振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＨＲＩ−１の懸濁液
（１０’個／−）に浸漬後、植物ホルモンを含まないＬ
Ｓ寒天培地に置床した。

３週間後苗条の茎の切断部位から不定根が発生した。こ
れをアンピシリン０．１■／−含むＬＳ液体培地で２日
間処理し菌を含まない自己増殖性のズボイシア感染不定
根を得た。このズボイシア感染不定根をＬＳ液体培地で
１年間継代培養した。この不定１１０■（乾燥重量）を
（フェニルメチル）ブタンニ酸を１０−’Ｍになるよう
に添加したＬＳ液体培地２０−を含む１０〇−容三角フ
ラスコに移植し、３週間振とう培養した。得られた不定
根１５０ｍｇ（乾燥重量）を乾燥し、実施例Ｉと同じ方
法で抽出し、アルカロイド量を分析した。この場合のア
ルカロイドの生産量を表２に示した。

実施例１０ 実施例９で（フェニルメチル）ブタンニ酸の代わりに類
似化合物である を用いて該化合物濃度が１０−’Ｍとなるようにした以
外は該実施例と同様にして行った結果を表２に示した。

比較例２ 実施例９において（フェニルメチル）プタンニ酸を添加
しなかった以外は該実施例と同様にして行った結果を表
２に示した。

（来夏以下余白） （発明の効果〕 本発明の組織培養によれば、植物の代謝産物を効率よく
生産でき、特にトロパン系アルカロイドを、中でも特に
スコポラミンおよび／又はヒヨスチアミンを従来法に比
べ大量に効率よ（生産することができる。

出願人　生体機能利用化学品新製造技術研究組合代理人
　弁理士　平　木゛祐　輔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物の組織を（アリールメチル）ブタン二酸又はそ
   の誘導体を含有する培地を用いて組織培養することを特
   徴とする植物の組織培養方法。 ２、植物がトロパン系アルカロイドを産生する植物であ
   る特許請求の範囲第１項記載の植物の組織培養方法。 ３、（アリールメチル）ブタン二酸又はその誘導体が（
   フェニルメチル）ブタン二酸又はその誘導体である特許
   請求の範囲第１項又は２項記載の植物の組織培養方法。