JPS63167790A - 組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカロイド等の二次代謝産物を産生ずる植物
の組織を特定の培地を用いて組織培養して二次代謝産物
を効率よく生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

二次代謝産物の一つであるアルカロイドとして例えばス
コポラミンはＭＷ剤、鎮痛剤などとしてまたヒヨスチア
ミンは副交悪神経しゃ新薬として重用され、これらの化
合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている。

しかし天然物を原料としているため、その生産が天候に
左右されること、収穫時期が限定されていることなどが
問題となっている。そのためこれらの化合物を植物の組
織培養によって生産する研究が数多く行われている。〔
例えばＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ土、１０１
−１０３（１９８２）　）など。

〔発明が解決しようとする問題点〕

組織培養によって二次代謝産物の工業的な生産を目指す
場合、生産性を高めることが重要な課題である。本発明
者等は二次代謝産物の生産性を高めることによってこれ
を効率良く生産する方法について検討した。

〔発明の概要〕

その結果、下記方法を採用すれば前記目的を達成できる
ことを見出し本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明の方法によれば、トロパン系アルカロ
イドを産生ずる植物の組織あるいは細胞をジベレリンを
含む培地を用いて培養することを特徴とする組織培養方
法が提供される。

〔発明の詳細な説明〕

本発明方法が適用される植物として具体的には、ズボイ
シア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａｍｙｏｐｏｒ
ｏｉｄｅｓ）　、ズボイシア・ライヒハルデイ（Ｄｕｂ
ｏｉｓｉａ　１ｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ）等のズボイシ
ア属植物、ダツラ・ダツラ（ＤａＬｕｒａ　ｔａｔｕｌ
ａ）、　　ダツラ・アルボレア（Ｄａｔａｒａ　ａｒｂ
ｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ　
ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、スコポリア
・ジャポニカ（５ｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）
等のスコポリア属植物、ヒョシアマス・ニガー（Ｈｙｏ
ｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス属植物および
アトローパ・ヘラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄ
ｏｎｎａ）等のアトローパ属植物などのナス科植物、オ
ウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍａｋｉｎ
ｏ）、セリバオウレン（Ｎａｋａｉ）　、キクバオウレ
ン（Ｃ，ｊａｐｏｎｉｋａ　Ｍａｋｉｎ。

ｖａｒ、ｊａｐｏｎｉｋａ）　、コセリバオウレン（Ｃ
，ｊａｐｏｎｉｋａＭａｋｉｎｏ　ｖａｒ、　ｍａｊｏ
ｒ　５ａｔａｋｅ）　、パイ力オウレン（Ｃ，ｑｕｉｎ
ｑｕｅｆｏｌｉａ　Ｍｉｑ、）およびミツバオウレン（
Ｃ，ｔｒｉｆｏｌｉａ　５ａｌｉｓｂ、）等のコプテイ
ス属の植物、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　ｍ
１ｎｕｓ　Ｌ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｃｕｍＭｉｑ、）
等のサリクトラム属の植物、サリントリザ属の植物およ
びヒドラスチス属の植物等を挙げられる。

本発明では前記植物の組織あるいは細胞を培養するに当
たっては、従来から知られている植物の組織培養に使用
されている培地において、特定濃度のジベレリンを含有
させたことを特徴とする培地が使用される。すなわち、
本発明の方法において使用される培地はジベレリンを通
常１０−９モル／１以上、好ましくは１０−８モル／ｌ
ないし１０−３モル／１含存する培地である。そして本
発明ではジベレリン濃度を前記範囲に保持する限り、培
地中のジベレリン以外の他の培地成分を、必要に応じて
広い濃度範囲で変化させて使用することができる。

本発明の組織培養において培地を構成する必須成分とし
て使用されるジベレリンとは、（１）式で示されるジバ
ン核を持つ植物ホルモンの総称で、これ迄に約５０種類
のジベレリン〔これらは通常ＧＡｎ（ｎ＝１〜５０の整
数）で表記される〕が報告されているが、本発明ではこ
れら各種のジベレリンのいずれ伜も使用することが出来
る。本発明ではこれらジベレリンの中でも特に（２）式
で示されるジベレリンＡ１１（ＧＡ３）を用いるとベル
ベリン等のイソキノリン系アルカロイドの含有量が増す
ので好ましい。

本発明で使用される培地は、ジベレリン、無機成分およ
び炭素源を必須成分とし、これにジベレリン以外の植物
ホルモン類、ビタミン類およびアミノ酸類から選ばれる
少なくとも１種類以上の成分を添加した培地であり、更
に必要に応じてこれ以外の他の成分も併用使用すること
ができる。

該培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛
、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素
およびコバルト等の元素を含む無機塩を挙げることがで
き、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸ア
ンモニウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナト
リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄
、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナ
トリウム、二酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜
鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、イントル酢酸（ＩＡ
Ａ）　、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、Ｐ−クロロフェ
ノキシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２
，４−Ｄ）等のオーキシン類およびカイネチン、ゼアチ
ンおよびベンジルアデニン等のサイト力イニン類を例示
できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）ピリドキ
サール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、ア
スコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン
酸、ニコチン酸アミドおよびリボブラビン（ビタミンＢ
２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、フェニルアラニンおよびリジンなど
を例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μモル／ｊ２ないし約１００ｍモル／１程度、前記炭素
源を約１　ｇ　／　ｅないし約１００　ｇ　／　Ｉ！、
ジベレリン以外の前記植物ホルモン類を約０゜０１μモ
ル／ｌないし約２０μモル／２程度および前記ビタミン
類と前記アミノ類類をそれぞれ約０．１ｍｇ／／！ない
し約１５０■／ｌ程度含ませて使用される。

本発明の方法においては、培地中のジベレリンを前記濃
度範囲に保持しながらかつ該培地中の前記他成分の濃度
を調整することによりトロパン系アルカロイドを生産す
る植物の組織あるいは細胞が培養されて二次代謝産物の
トロパン系アルカ口、イドが得られる。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられて
いる培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（’６２）　　
ＣＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リ
ンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９６５）　　ＣＬｉ
ｎｓｍａｉｅｒ＆　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、ホワイト（
’６３）　　（Ｗｈｉｔｅ　〕（７）培地、ガンボルグ
（Ｇａｒｎｂｏｒｇ　）のＢ−５培地、三井のト９培地
、ニッチ・ニッチの培地（Ｎｉｔｓｃｈ　＆Ｎｉ　ｔｓ
ｃｈ　）等に前記した炭素源およびジベレリン等を添加
し、更に必要に応じて前記したビタミン類、アミノ酸類
を添加して調製される培地を例示できるが、本発明では
この中でも特にエッチ・ニッチ、リンスマイヤー・スク
ーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製される
培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培地の組成
に関しては、例えば、性向、中島、古谷著の［新植物組
織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１、朝倉書店、１９７９年
に記載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天を通常
０．５〜１％含有させた固型培地であるが本発明では液
体培地を用いることが好ましい。

本発明のジベレリンを含む培地を用いて組織培養する方
法では、トロパン系アルカロイドの産生量が増大するだ
けでなく、該二次代謝産物が細胞外へ放出される量が著
しく増大するという特徴がある。

本発明では該培養組織としてズボイシア属植物の組織を
用いる場合には不定根が特に好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の組織として具
体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽などの他に
も本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の組織培養
方法によって得られる該植物の培養細胞ないし培養組織
を例示できる。本発明では、ズボイシア属植物の場合に
はこれらの中では植物組繊を前もって組織培養して得ら
れる不定根を使用してこれを本発明に係わる培地を用い
て組織培養することが特に好ましく、この場合には原料
の不定根が本発明の培地を用いて増殖培養されて二次代
謝産物としてスコポラミン、ヒヨスチアミン等のトロパ
ン系アルカロイドが多量産生される。

〔発明の効果〕

本発明に係わるジベレリンを含む培地を用いた組織培養
方法によれば、スコポラミン、ヒヨスチアミンなどのト
ロパン系アルカロイドの産生量を増大させることができ
る。又該培養方法によれば培養中にトロパン系アルカロ
イドを細胞外へ放出させながら培養することができ、又
その放出量を増大させることができるので、従来法に比
べて培養系からのトロパン系アルカロイドの分離回収が
容易となり、かつ培養植物を廃棄することな（繰り返し
使用することができるため、トロパン系アルカロイドの
生産性を荷めることができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ 薬草図にて栽培したＤｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｐｏｒｏｉ
ｄｅｓ　Ｒ。

Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミン液に１０分間
浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後、約１　ｃｔｎ
に切断し、ナフタレン酢酸およびベンジルアデニンをそ
れぞれ１０−５Ｍおよび１０−６Ｍとなるように添加し
たリンスマイヤー・スクーグの寒天培地に置床し、２５
°Ｃで３０日間培養する。カルス形成と同時に発生した
不定根を切り出し、インドール酪酸を１０−　’Ｈにな
るように添加したニッチ・ニッチの液体培地に移植し、
２年間箱代培養した。このようにして得た不定根１０■
（乾燥重量）をインドール酪酸を１０−５Ｍになるよう
に添加しさらにジベレリンのＧＡ、を１０−５Ｍになる
ように添加したエッチ・エッチの液体培地２０ｍ１を含
む１００ｍ１容の三角フラスコに移植し、３週間振とう
培養した。得られた不定根１９０■（乾燥重量）を乾燥
後、塩基性のクロロホルム−メタノール液５０−で抽出
した。これに４０ｙｄのＩＮ硫酸を加えてアルカロイド
層を硫酸層ア に移した。さらに、アンモニー水２ｍｌおよびクロマト
グラフでアルカロイド量を分析した。ガスクロマトグラ
フの分析は以下の条件で行った。

カラム：　５ｉｌｉｃｏｎｅ　０Ｖ−１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ　（Ｍｅｓｈ　８０〜１０
０　）３　ａｘφ×１ｍガラスカラム キャリアガス：Ｎ２ カラム温度：２００℃ 同様な方法で培地中に存在するアルカロイドの量を定量
した。アルカロイドの総産生量を表１に示した。

比較例１ 培地にジベレリンＧＡ、を添加しないことを除けば実施
例１と全く同じ条件で培養した。この場合のアルカロイ
ドの総産生量を表１に示した。

表　　　１ 実施例２〜４ １００ｃｃのエルレンマイヤーフラスコに１０−　’Ｈ
のインドール酪酸を含むニッチ・ニッチの液体培地を２
０ｍ１仕込み、これに先の実施例１で用いたズたのに対
して本実施例では培養３週間口にＧＡ３を培地に１０−
６Ｍ　、１０−５Ｍ又は１０−’Ｍ添加して培養を続け
、１週間後にフラスコから液体培地のみを全量回収して
、この培地中のアルカロイドの量をガスクロマトグラフ
ィーによって分析した結果を表２に示す（Ｒｕｎｌ）。

次に先の液体培地を除いた残りの培養フラスなるよう先
と同様に添加して培養を続け、１週間後に培養フラスコ
から液体培地のみを全量回収して、この中に含まれるア
ルカロイドの量を分析した結果（Ｒｕｎ　２　）を表２
に示した。

比較例２ 常法に従い１００ｃｃ用エルレンマイヤーフラスコを用
い、１０−　’Ｈのインドール酪酸を含むニッチ・ニッ
チの液体培地（２０ｄ）にズボイシア不定根の種細胞０
．５　ｇを仕込み、４週間培養を行った後培養を止め、
不定根および培地を回収した。回収した不定根中に含ま
れるヒヨスチアミンは３９６μｇ、スコポラミンは１０
２３μｇであり、一方、培地中に存在するヒヨスチアミ
ンは２μｇ、スコポラミンは５μｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トロパン系アルカロイドを産生する植物の組織あ
   るいは細胞をジベレリンを含む培地を用いて培養するこ
   とを特徴とする組織培養方法。