JPH0220291A - トロパン系アルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はズボイシア、ダクラ、ハシリドコロ、ヒヨス等
のトロパン系アルカロイドを代謝産生ずる植物の組織又
は細胞を特定の培地を用いて組織培養することによりス
コポラミンおよび／又はヒヨスチアミン等のトロパン系
アルカロイドを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

トロパン系アルカロイドについては、スコポラミンは鎮
痙剤、鎮痛剤および副交感神経しゃ断薬として、またヒ
ヨスチアミンは副交感神経しゃ断薬として、それぞれ医
薬として重用されている。

これらの化合物は、天然の植物体中から抽出して製造さ
れているが、天然物を原料としているため、その生産が
天候に左右されること、収穫時期が限定されていること
などが問題となっている。そのためこれらの化合物を植
物の組織培養により生産する研究が内外で数多く行われ
た。カルスによる生産では、山田らによるヒヨスのカル
スによる生産例が知られている〔Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅｐｏｒｔｓ上、１０１〜１０３（１９８２）　）
が、スコポラミン含量は２０ｐｐｍと、天然の植物体中
の含量と比較して低いものであった。また山田らは、ズ
ボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａしｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
　Ｆ、　Ｍｕｅｌｌ）の組織培養により得られる不定根
中に著量のスコポラミンおよびヒヨスチアミンが存在す
ることを見出している（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ　３．１８６〜１８８（１９８４）　：］が、そ
の量はまだ充分とは言えないものであった。そこで、ズ
ボイシア不定根の各種培養条件を検討し、培地のアンモ
ニウムイオンと硝酸イオンの比率を０．２以上にするこ
と、培地の溶存酸素濃度を１０ないし６５ｐｐｍとする
ことにより、トロパン系アルカロイドの生産性を向上さ
せることを見出し、本出願人はそれぞれ特願昭６０−１
４３８８２号および特願昭６０−１４３８８１号として
特許出願をしているが、工業的な見地からはその生産性
を更に高めることが望まれる。

〔発明が解決しようとする課題〕

したがってこのような組織培養によりトロパン系アルカ
ロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産性を高
めることが重要な課題であった。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、ズボイシア
、ダツラ、ハシリドコロおよびヒヨス属等のトロパン系
アルカロイドを産生ずる植物の不定根等の組織、細胞を
効率よく培養する方法を研究した結果、次のような事実
を見出した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわちトロパン系アルカロイドを産生ずる植物の組織
を、特定の培地を用いて組織培養を行うと、得られる培
養細胞あるいは不定根等の培養によって得られる培養組
織中のトロパン系アルカロイドの含量が向上するか、あ
るいは培養細胞、不定根等の培養組織の生育が促進され
、結果としてトロパン系アルカロイドの生産性が向上す
ることを見出し本発明を完成するに到った。

即ち、本発明によれば、トロパン系アルカロイドを産生
ずる植物の組織又は細胞を構成アミノ酸としてフェニル
アラニンを含むオリゴペプタイドを含有する培地を用い
て組織培養することによりトロパン系アルカロイドを生
産することを特徴とするトロパン系アルカロイドの生産
方法が提供される。

本発明では組織培養はトロパン系アルカロイドを産生ず
る植物を用いて行われるが、該当する植物として具体的
には、ズボイシア・ミオポロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ
　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）、ズボイシア・ライヒハル
デ４　（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｉｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
）等のズボイシア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒ
ａ　ｔａｔｕｌａ）、ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒ
ａ　ａｒｂｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａ
ｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、
スコポリア・ジャポニカ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐｏ
ｎｉｃａ）等のスコボリア属植物、ヒョシアマス・ニガ
ー（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス属
植物およびアトローパ・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂ
ｅｌｌａｄｏｎｎａ）等のアトローパ属植物などのナス
科植物を例示することができる。

本発明では、前記植物の組織又は細胞を培養してトロパ
ン系アルカロイドを生産するに当たり構成アミノ酸とし
てフェニルアラニンを含むオリゴペプタイドを含有する
培地が用いられる。以上これについて詳述する。

本発明で使用される培地は構成アミノ酸としてフェニル
アラニンを含むオリゴベプタイドを必須成分として含む
培地であって、該成分以外の他の成分として、無機成分
および炭素源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、
ビタミン類を添加し、更に必要に応じて本発明に係わる
フェニルアラニンを含むオリゴペプタイド以外の他のグ
リシン、グルタミン酸、リジン等のアミノ酸類を添加し
ても良い培地である。

本発明に係る構成アミノ酸としてフェニルアラニンを含
むオリゴペプタイドは、一般式〔１〕Ｈ （式中Ｒは種々のアミノ酸残基を示し、ｎは工ないし５
の整数を示す〕 で表されるペプタイドであって、具体的にはフェニルア
ラニル−メチオニン、ジ−フェニルアラニン、フェニル
アラニルプロリン、フェニルアラニルチロシン、フェニ
ルアラニルアラニン、トリフェニルアラニン等を例示で
きる。

本発明では、培地に含まれる前記したオリゴペプタイド
の使用割合については、使用されるオリゴペプタイドの
種類によっても異なるが、通常は０．５μＭ〜５００μ
Ｈ１好ましくは１μＭ〜１００μＨの範囲である。

本発明で使用される培地において、前記したフェニルア
ラニンを含むオリゴペプタイド以外の他の培地成分につ
いては、無機成分として、窒素、リン、カリウム、ナト
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバ
ルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的
には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸
第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデ
ン酸ナトリウム、三酸化モ１）ブデン、ヨウ化カリウム
、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示で
きる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノル等のｌアルコー
ルなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＴＡＡ）　、Ｉ）
クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＡ）および
これらの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニ
ン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン
類を例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常は
培地に添加しないことが望ましいが、必要に応して添加
する場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０−７旧
０．０２ｍｇ／　ｊ２　）以下の低濃度で使用すること
が好ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
Ｂ２）などを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μ門ないし約１００ｍＭ　、前記炭素源を約１ｇ／！な
いし約１００ｇ／　ｆｆｉ、前記植物ホルモン類を約０
．０１μ門ないし約１００μ門、前記ビタミン類を約０
、１　ｍｇ／　１２ないし約１５０ｍｇ／ｆｆｉ含ませ
て使用されることが望ましい。

本発明のズボイシア属植物の組織培養に用いられる前記
培地として具体的には、従来から知られている植物の組
織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スク
ーグ（’６２）　　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏ
ｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ１９６
５）　　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）の
培地、ホワイト（’６３）　（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガ
ンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ−５培地、三井のＭ−
９培地、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　Ｎ１ｔｓｃｈ
　）の培地等に本発明に係わるオリゴペプタイド及び前
記した炭素源および植物ホルモンを添加し、更に必要に
応じて前記したビタミン類等を添加して調製される培地
を例示できるが、本発明ではこの中でも特にニッチ・エ
ッチ、リンスマイヤー・スクーグ又はムラシゲ・スクー
グの培地を用いて調製される培地が好ましい。なお、上
記した従来公知の培地の組成に関しては、例えば、性向
、中隔、古谷著の「新植物組織培養」Ｐ３８６〜Ｐ３９
１、朝食書店、１９７９年に記載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天やゼラ
チン等を通常０．５〜１％含有させた固型培地であるが
本発明では液体培地を用いることが好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の組織又は細胞
として具体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽な
どの組織片又は細胞の他にも本発明に係わる組織培養あ
るいは他の従来の組織培養方法によって得られる該植物
の培養細胞ないし培養組織を例示できる。本発明では、
これらの中では植物組織を前もって組織培養して得られ
る不定根を使用してこれを本発明に係わる培地を用いて
組織培養することが特に好ましく、この場合には原料の
不定根が本発明の培地を用いて増殖培養されてトロパン
系アルカロイドを多量含有する不定根が得られる。

また、本発明では前記した組織片あるいは細胞からカル
スを誘導し、該カルスを継代培養して得られる培養細胞
ないしは培養組織を本発明の前記培地を用いて増殖培養
しトロパン系アルカロイドを多量含有する培養物、特に
不定根を得るというような組織培養の方法を用いること
も好ましい。

本発明において不定根を用いる場合、植物の組織片を例
えば毛根病菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈ
　ｉｚｏｇｅｎｅｓ）で感染させ、これによって出現す
る毛根を用いることもできる（例えば本出願人に係わる
特開昭６２−２４８４２９号で提案した方法を用いるこ
ともできる。） 本発明の方法によって得られるトロパン系アルカロイド
として具体的には、スコポラミン、ヒヨスチアミン及び
これらの化合物のアセチル化合物を例示できるが、この
中ではスコポラミンとヒヨスチアミンが好ましい。

本発明ではトロパン系アルカロイドを含有する培養細胞
から該アルカロイドを分離する方法としては、例えば薬
局法等に記載されている、トロパン系アルカロイドを含
有する植物からこれら化合物を単離精製する場合に用い
られてきた通常の方法を採用することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１．．２．３ 当社薬草面にて栽培したＤｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｐｏｒ
ｏｉｄｅｓＲ，Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミ
ン液に１０分間浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後
、約１ｃｍに切断し、ナフタレン酢酸およびヘンシルア
デニンをそれぞれ１０−５Ｍおよび１０−’Ｍとなるよ
うに添加したリンスマイヤー・スクーグの寒天培地に置
床し、２５°Ｃで３０日間培養する。カルス形成と同時
に発生した不定根を切り出し、インドール酪酸を１０−
’Ｍになるように添加したニッチ・エッチの液体培地に
移植し、２年間継代培養した。

このようにして得た不定根１０ｍｇ　（乾燥重量）をイ
ンドール酪酸を１０−５Ｍになるように添加したエッチ
・エッチの液体培地２０−を含む１００艷容の三角フラ
スコに移植して培養開始時にフェニルアラニルメチオニ
ン濃度がそれぞれ１０μ門、１００μ翫５００　μ門と
なるようにフェニルアラニルメチオニンを先の液体培地
に添加して、更に３週間振盪培養した。得られた不定根
を乾燥後、塩基性のクロロホルム−メタノールＭ５０ｒ
ｎｌで抽出した。これに４０＋ｎｆのＩＮ硫酸を加えて
アルカロイド層を硫酸層に移した。さらに、アンモニア
水２−およびクロロホルム４０艷を加えてアルカロイド
をクロロホルム層に移し、これを減圧濃縮し、ガスクロ
マトグラフでアルカロイド量を分析した。この場合のア
ルカロイドの生産量を表１に示した。なお、ガスクロマ
トグラフの分析は以下の条件で行った。

カラム：　５ｉｌｉｃｏｎｅ　０Ｖ−１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｈ（Ｍｅｓｈ　８０〜１００
）３ｆｆｌＩｎφＸ１ｍガラスカラム キャリヤガス：Ｎ２ カラム温度　：　　２００’Ｃ 比較例１ 実施例１においてフェニルアラニルメチオニンを添加し
ない培地を用いた以外は該実施例と同様に行った結果を
表１に示した。

（重量以下余白） 実施例４，５．６ 実施例１と同様にして得られた不定根１０ｍｇを、ジフ
ェニルアラニン濃度がそれぞれ１μ門、１０Ｍ台１００
　μ門となる様に添加し、又インドール酪酸を１０−５
Ｍとなる様に添加したニッチ・エッチの液体培地２０ｍ
１を含む１０〇−容の三角フラスコに移植した。３週間
培養後、実施例１と同様に処理し、アルカロイド量を分
析した。この場合のアルカロイド生産量を表２に示した
。

比較例２ 実施例４においてジフェニルアラニンを添加しなかった
以外は該実施例と同様に行った結果を表２に示した。

（装置以下余白） 実施例７，８，９．１０ 実施例１と同様にして得られた不定根１０ｍｇを、トリ
ーフェニルアラニン濃度がそれぞれ０．５μ門。

１．０ＭＭ、　５．０μ門、　１０．０μＨとなる様に
添加し、又インドール酪酸を１０−５Ｍとなる様に添加
したニッチ・ニッチの液体培地２０ｍ１を含む１０に容
の三角フラスコに移植した。３週間培養後、実施例１と
同様に処理し、アルカロイド量を分析した。この場合の
アルカロイド生産量を表３に示した。

比較例３ 実施例７においてトリーフェニルアラニンを添加しなか
った以外は該実施例と同様に行なった結果を表３に示し
た。

（装置以下余白） 〔発明の効果〕 本発明の組織培養によるトロパン系アルカロイドの生産
方法を採用すれば、従来法に比べてトロパン系アルカロ
イド、中でも特にスコポラミンおよび／又はヒヨスチア
ミンを大量に効率よく生産することができる。

出願人　生体機能利用化学品新製造技術研究組合代理人
　弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トロパン系アルカロイドを産生する植物の組織又
   は細胞を、構成アミノ酸としてフェニルアラニンを含む
   オリゴペプタイドを含有する培地を用いて組織培養を行
   い、トロパン系アルカロイドを生産することを特徴とす
   るトロパン系アルカロイドの生産方法。