JPS6339595A - アルカロイドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１蛮業上の利用分野〕 本発明は、ナス科１直物が生合成する生理活性物質及び
薬用成分でもあるアルカロイド、特にｌ・ロバンアルカ
ロイドを、ナス科植物の毛状根を培養して効率的に製造
する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

植物の細胞・組織培養法による植物の二次代謝物の工業
的生産法として、植物に毛根病菌アグロバクテリウム・
リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉンｏ
ｇｅｎｅｓ　）を接種し、生えてきた毛状根を培養する
方法が知られている。この方法は、次の原理に基づくも
のである。すなわち、アグロバクテリウム・リゾジェネ
スを植物の茎・葉・根などに接種すると、感染部位から
毛状根と呼ばれる根が発生する。この根は、リゾジェＺ
、ス中に存在する巨大プラスミド（Ｒｉプラスミド）の
遺伝子の一部がＮｉ物の遺伝子に組み込まれることによ
り発生し、通常の根に比べて生育が非常に速く又二次代
謝物の生産量が同等以上であることが知られている。

従って、この方法は、上記性質を利用して、根に有用物
質を含む１ｌα物にアグロバクテリウム・リゾジェネス
を接種し、発生した毛状（艮を切り出してタンクなどの
装置で培養し、増テ直させた毛状根を破壊して有用物質
を取り出す方法である。

しかしながら、この毛根病菌を用いる方法によれば、細
胞を破壊して細胞中に蓄積された目的物質を取り出して
いるため、細胞成分と目的物質との分離が煩雑であり、
コストアップになるという欠点があり、又増殖する植物
器官を連続的に取り出すことが困難であるために、バッ
チ方式による生産しか行うことができないという欠点が
ある。

そこで本発明者らは、上記問題点のない製造方法として
、特定の植物に上記毛根病菌を接種し、生えてきた毛状
根を培養し、該毛状根が培地中に分泌するアルカロイド
を抽出する方法を開発し、特願昭６１−４７０４６号ど
して特許出願した。

しかしながら、毛状根を通常の培地で培養すると、毛状
根の生育速度及び毛状根のアルカロイド含有率が未だ十
分ではないという問題が生じた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、毛状根の生育に適した培地処方を開
発し、毛状根の生育速度を速めるとともに、アルカロイ
ドの生産効率の高い方法を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、特定の元累を特定量含有する液体培地を用い
ると上記問題点を有効に解決できるとの知見に基づいて
なされたのである。

すなわち、本発明は、ナス科植物細胞をアグロバクテリ
ウム・リソゲネスが保持するＲ１プラスミドにより形質
朕云換し、生じた毛状根を、１．５〜５．０ミリモルの
リン酸イオン、１０〜８０μモルの鉄イオン、０．３〜
０８μモルの銅イオン、０．４〜１μモルのコバルトイ
オン、及Ｌ”０．２〜２０μモルのンベレリン、０．０
７〜３７０１］μＭのザリチル酸イオン、０．０７〜３
８００μＭのリンゴ酸イ；「ン、００８〜４３００μＭ
のコハク酸イオン、０．０５〜５００μＭのインドール
酪酸イオン及び０．０４〜３３０μＭのアブンジン酸イ
オンからなる群から選ばれる少なくとも１種を液体培地
１β当りに含有する液体培地で培養して、該毛状根が産
生ずるアルカロイドを取り出すことを特徴とするアルカ
ロイドの製造方法を提供する。

本発明で処理の対象とされるのは、ナス科植物であり、
本発明では処理対象をこのように限定したことが特に重
要である。すなわち、ナス科植物の毛状根によればアル
カロイドが培地中に分泌されるからである。本発明では
任意のナス科植物が用いられるが、アトローパ属植物、
ダツラ属植物、ヒヨスチアムス、属植物、スコポリア属
植物の群から選ばれるものを用いるのが好ましい。これ
らのうちでも、特にダツラ属の埴吻が好ましく、具体的
）ま、ケチョウセンアザガオ（Ｄａｔｕｒａ　１ｎｎｏ
ｘｉａ　！、１）、トゲナンヨウシニチョウセンアサガ
オ（Ｄ、　ｉｎｅｒｍｉｓ、Ｊ）、アメリカチョウセ７
アザガオ（Ｄ、　ｍｅｔｅｌｏｉｄｅｓＤｃ）、ソロバ
ナヨウ／ユチョウセンアサガオ＜Ｄ、　ｓＬｒａｍｏｎ
ｉｕｍい、ヨウンユチョウセンアサガ万（０，１ａｔｕ
ｌａ　Ｌ）、チョウセンアサガオ（Ｄ、ａｌｂａ　Ｎ）
、コダ千チョウセンアサガオ（Ｄ、ａｒｂＯｒｅａ　Ｌ
）　　、キダチチョウセンアサガオ（Ｄ、　５ｕａｖｅ
ｏｌｅｎｓ　Ｉｆ）が例示され、とりわけケチョウセン
アサガオが好ましい。

これらの植物に毛状根を作らせるために利用できるアグ
ロバクテリウム・リゾジェネス閑としては、 アグロバクテリウム・リゾジェネス　２５８１ｇアグロ
バクテリウム・リゾジェネス　１５８３４アグロバクテ
リウム・リゾジェネス　８１９６アグロバクテリウム・
リゾジェネス　　Ａ４などがあげられる。また大腸菌な
どの他の閑にＲ１プづスミドまたはその一部のＴ−ＤＮ
Ａを遺伝子導入した菌も１吏用できる。

本発明により植物をアグロバクテリウム・リゾジェネス
菌で処理すると、リゾジェネス菌中のＲ１プラスミドの
一部（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞の核ＤＮＡの中に導入（
形質転換）される。

前記ナス科植物の茎・根・葉などにＲ１プラスミドＴ　
−Ｄ　Ｎ　Ａを導入し形質転換させた毛状根を得る方法
としては、例えば、次の方法があげられる。

１、　　ｔａ物何個体の直接接種法 ２、葉片を用いたリーフディスクｉｌ　（Ｌ、Ｃｏｍａ
ｉ　ｅｔ。

ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　　３１７．７．４１（１９３
５）＞３、植物体のプロトプラストを利用した共存培養
法（ｚ、：、＋、ｉすｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅｌ］　Ｒｅｐ、、　１ｎｐｒｅｓｓ　　（１９８
６）　） ４、　植物体のプロトプラストとアグロバクテリウム・
リゾジェネスのスフ二ロプラスト？Ａ（Ｒ。

１ｌａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　ｆ
ｌｅｐ、、　３．６０５、　アグロバクテリウム・リゾ
ジェネス菌のＲ１プラスミドまたはその一部のＴ−ＤＮ
Ａをマイクロインジェクションなどの方法で直接細胞内
に注入する方法 Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌処理
が必要で、その方法としては下記のものがある。

○　高温処理（４０℃） Ｏ抗生物質処理 ○　毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方
法により得られた毛状根の培養方法としては下記のもの
が有効である。

本発明では、上記の毛状根を、リン酸イオン濃′度１，
５〜６．５ミリモル、好ましくは１．７〜４．５ミリモ
ル、鉄イオン濃度１．０〜９０μモル、好ましくは５〜
８５μモル、銅イオン濃度０．１５〜１，０μモル、好
ｉ　Ｌ　＜　ハ０．２〜０．９μモル、コバルトイオン
濃度０．３〜１．５μモル、好ましくは０．３５〜１．
２μモル、ジペレリン濃度２．９Ｘ１０−３〜２８．８
μモル、好ましくは０．０３〜２０μモル、サリチル酸
イオン０．０７〜３７００μＭ、好ましくは０．７〜１
５００μＭ、リンゴ酸イオン０．０７〜３８００ＩｔＭ
、好ましくはＯ１７〜１５００μＭ１ｌ７〜１５００μ
、０８〜４３００μＭ１好ましくは０．８〜１７００μ
Ｍ１インドール酪酸イオン０．０５〜５００μＭ１好ま
しくは０．０５〜２５０μＭ及びアブシジン酸イオン０
．０４〜３８０μＭ１好ましくは０．０４〜１９０μＭ
から選ばれる１種のイオン又は２種以上のイオンを含む
液体培地中で培養することを特徴子る。

ここでリン酸イオン源としては、リン酸、リン酸ｌナト
リウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリウム、リン
酸３ナトリウムなどが、鉄イオン源としては、硫酸第１
鉄、硫酸第２鉄などが、銅イオン源としては、硫酸銅な
どが、またコバルトイオン源としては塩化コバルトが例
示される。また、サリチル酸、リンゴ酸、コハク酸、イ
ンドール酪酸及びアブシジン酸の各イオン源としては、
水中で解離してこれらのイオンを生成するものであれば
いずれでもよく、酸自体または、そのアルカリ金属塩等
があげられる。

本発明では、例えば、従来植物の組織培養に用いられて
いる培地、つまり、無機成分および炭素源を必須成分と
し、これに植物ホルモン類、ビタミン類およびアミノ酸
類から選ばれる少なくとも１種類以上の成分を添加し必
要に応じてその他の成分も添加されている培地において
、上記特定の元素の量を特定量として用いることができ
る。

上記培地中の無機成分としては、リン、鉄鋼、コバルト
以外に窒素、カリウム、カルシウム、マグネンウム、イ
オウ、マンガン、亜鉛、ホウ斗、モリブデン、有窓、ナ
）　ＩＪウム、ヨウ詣等があり、具体的には硝酸カリウ
ム、硝酸ナトリウム、硝酸力ルンウム、塩化カリウム、
塩化力ルンウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、モリブデン酸ナトリ
ウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウムなどが例示さ
れる。

また炭素源には、ンヨ塘等の炭化水素、その誘導体、脂
肪酸等の有機酸、エタノール等の１扱アル６−ルなど力
く例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩΔＡ）、ナフ
クレン酢酸（ＮΔＡ）、ｐ−クロロフェノキシイソ酪酸
、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）など
のオーキンン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼア
チン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ、）
　　ピリドキンン（ビタミンＢ６　）、パントテン酸、
アルコルビン酸くビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸などが例示される。

アミノ酸類には、グリノン、アラニン、クルクミン、ン
ステインなどが例示される。

液体培地中の本発明で規定する成分以外の成分の濃度は
、広い範囲で変えることができる。通常は、無機成分を
約０．１μＭ〜約１００＋ｎ１４程度、炭素源を約１ｇ
／β〜１２０ｇ／β程度、さらに植物ホルモン類を約０
．０１μＭ〜約１０μＭ程度、ビタミン類およびアミノ
酸類を、それぞれ約０．１ｍｇ／β〜約１００ｍｇ／β
程度とすることができる。

本発明では、液体培地中の毛状根の初期濃度を広い範囲
で変えることができる。通常は液体培地５０ｍｆに対し
て、毛状根を約１０ｍｇ〜約１ｇ（新鮮重量）程度添加
することが望ましい。

本発明の毛状根の培養において、光は必ずしも必要では
なく、かえって暗所での培養がスコポラミンなどのアル
カロイドの生合成に望ましく、培養温度は約り０℃〜約
３５℃、特に約り３℃〜約２８℃が好適である。つまり
、約１０℃未満では毛状根の増殖速度が小さく、約３５
℃を１嘘えても同様に毛状根の増殖速度が小さくなるか
らである。

本発明では上記のようにして培養した毛状根からアルカ
ロイドを種々の方法で取り出すことができるが、該毛状
根が液体培地中に分泌するアルカロイドを抽出すること
により行うのがよい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ナス科植物細胞からアルカロイドを効
率的に製造することができるので、本発明の方法は工業
的なアルカロイドの製造方法として極めて好適である。

次に実施例により本発明を説明する。

〔実施例〕

実施例１ ケチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ　１ｎｎｏｘｉａ
　Ｍ）　　の種子を次亜塩素酸す）　ＩＪウム溶液など
の殺菌剤で滅菌したのち、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳと
略す）の固型培地上に播種し、発芽した無菌植物の茎・
葉部などにＲ１プラスミドを保持する、アグロバクテリ
ウム・リゾジェネス（１５８３４）菌を接種した。

２〜５週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、カルベニシリンＬｇ／βを含むＭＳ固型培地上に移植
し、１〜２週間で同じ組成の新しい培地に移植した。２
〜３回この操作を繰り返して、除菌された毛状根を得た
。

１００ｍｆのエーレンマイヤーフラスコに表−１の組成
の液体培地５０ｍ２を入れ、１２０℃、１５分間滅滅菌
た。この液体培地に上記の毛状根１、　ＯＯｍｇを添加
して２５℃で３０日間、振とう培湊（旋回回転数１００
回／分、振幅３０ｍｍ）した。

培養後のケチョウセンアサガオの毛状根をろ過により採
取し、秤量したのち凍結乾燥した。乾燥後も秤量を行っ
てから、乳鉢ですりつぶし粉末にした。次に粉末をクロ
ロホルム：メタノール：アンモニア＝１５：５：］の混
合液で抽出し、ろ過し７て抽出液を得た。これを硫酸酸
性（ｐＨ２）でクロロホルム抽出を行い水層を分取し、
次にアンモニアアルカリ性（ｐｆｌｌ、ｏ）にしてから
クロロホルム抽出を行った。そしてクロロホルムを硫酸
ナトリウムで脱水処理したのち、蒸発乾Ｉさせアルカロ
イド画分を得た。

また培地は、重畳を測定したのち、硫酸酸性（ｐＨ２ン
にしてから、上記と同様の方法で抽出した。

アルカロイド画分中のスコポラミンの定量は、ガスクロ
マトグラフィーで行った。カラムはＯ■−１７（２ｍｘ
３ｍｍ）、カラム温度は２３５℃、キャリアガスは窒°
素で流速は５０ｍｊ！／分検出器にはＦＩＤを用いた。

両方のスコポラミン量を加えて、フラスコ当たりの総ス
コポラミン生成量を求めた。

培地中のリン酸イオン濃度と得られた結果をまとめて表
−２に示す。

表−１ 表−２から明らかなように、従来から用いられているＭ
Ｓ液体培地（但し、炭素源としてショ糖を３０ｇ／Ｉ！
含む）で培養を行った比較例では、総スコポラミンの生
成量が極めて少ないが、本発明によれば多量のスコポラ
ミンを製造できることがわかる。

実施例２ 実施例１において、リン酸の濃度を１．２５　ミ’Ｊモ
ルとし、鉄イオンの濃度を変化させた以外は実施例１と
同様に培養及び抽出を行った。

結果をまとめて表−３に示す。

表−３から明らかなように、従来から用いられているＭ
Ｓ液体培地で培養を行った比較例では、捻スコポラミン
の生成量か極めて少ないが、本発明によれば多量のスコ
ポラミンを製造できることがわかる。

実施例３ 実施例１において、リン酸の濃度を１．２５　ミ’Ｊモ
ルとし、銅イオンの濃度を変化させた以外は実施例１と
同様にして培養及び抽出を行った。

結果をまとめて表−４に示す。

表−４から明らかなように、従来から用いられているＭ
Ｓ液体培地で培養を行った比較例では、総スコポラミン
の生成量が極めて少ないが、本発明によれば多量のスコ
ポラミンを製造できることがわかる。

実施例４ 実施例１において、リン酸の濃度を１．２５　ミＩＪモ
ルとし、コバルトイオンの濃度を変化させた以外は実施
例１と同様にして培養及び抽出を行った。

結果をまとめて表−５に示す。

表−５から明らかなように、従来から用いられているＭ
Ｓ液体培地で培養を行った比咬例ては、総スコポラミン
の生成量が極めて少ないが、本発明によれば多量のスコ
ポラミンを製造できることがわかる。

実施例５ 実施例１において、リン酸の濃度を１．２５　ミｉＪモ
ルとし、これにジペレリンを添加した以外は実施例１と
同様に培養及び抽出を行った。

結果をまとめて表−６に示す。

表−６より、ジペレリンを含む培地を用いたＮα１〜３
は、ＭＳ液体培地を用いた場合に比べて、スコポラミン
を大最に製造できることがわかる。

実施例６ 実施例１において、リン酸の濃度を１．２５　ミリモル
とし、表−７に示す成分を添加した以外は実施例１と同
様に培養を行い、アトロピンを抽出した。尚、アトロピ
ンの定量は、スコポラミンと同様の方法で行った。

結果をまとめて表−７に示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ナス科植物細胞をアグロバクテリウム・リゾゲネ
   スが保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた
   毛状根を、１．５〜６．５ミリモルのリン酸イオン、１
   ．０〜９０μモルの鉄イオン、０．１５〜１．０μモル
   の銅イオン、０．３〜１．５μモルのコバルトイオン、
   ２．９×１０＾−＾３〜２８．８μモルのジペレリン、
   ０．０７〜３７００μＭのサリチル酸イオン、０．０７
   〜３８００μＭのリンゴ酸イオン、０．０８〜４３００
   μＭのコハク酸イオン、０．０５〜５００μＭのインド
   ール酪酸イオン及び０．０４〜３８０μＭのアブシジン
   酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも１種を液体
   培地１ｌ当りに含有する液体培地で培養して、該毛状根
   が産生するアルカロイドを取り出すことを特徴とするア
   ルカロイドの製造方法。
2. （２）ナス科植物が、アトローパ属植物、ダツラ属植物
   、ヒヨスチアムス属植物、スコポリア属植物の群から選
   ばれる特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。