JPH02191292A - アクテオシドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はテンニンソウ（ＬｅｕｃｏｓｃｅｐＬｒｕｍ）
１ｍ植物の細胞培養によるアクテオシドの製造法に関す
るものである。

［従来の技術および課！ｌ！］ アクテオシドは、植物中に広範に含まれている化合物の
一種で、免疫抑制作用、アルドースリダクターゼ阻害作
用（特許願昭和６３年 １８４７４８号）、５−リポキシゲナーゼ阻害作用（特
許、願昭和６３年１８８３８６号）等の生理作用を有す
ることが知られ、免疫抑制剤、糖尿病等の合併症治療薬
、抗アレルギー剤等の医薬品としての利用が考えられて
いる。

アクテオシドの工業的生産は、その合成が極めて難しい
ことから１．植物等の天然物からの抽出に依存せざるを
得ない。しかしながら、野ヰ植物は資源的に限界があり
、また植物を栽培した場合、病害虫の発生や天候等の自
然条件の影響を受けやすいため、原料の安定供給が難し
く、かつ栽培に時間と労力がかかり原料の価格は高いも
のとなる等の問題点がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、効率的かつ安定したアクテオシド製造法
の開発を目的として、アクテオシドを含有する種々の植
物の細胞培養を試みた結果、テンニンソウ属植物から誘
導した培養細胞中に多量のアクテオシドが存在している
ことを見いだし、この知見（こ基づいて本発明を完成す
るに至った。

すなわち本発明は、テンニンソウ属植物から誘導した未
分化細胞を培養し、該培養培地（二〇、ｌ〜１００ｍの
オーキシン類および／またはサイトカイニン類を添加す
ることによってアクテオシドを分離採取することを特徴
とするアクテオシドの製造法である。

本発明においてアクテオシドの製造に用いる未分化細胞
は、シソ科テンニンソウ属に属するテンニンソウ（Ｌｅ
ｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｉ）、フジ
テンニンソウ（Ｌ、ｊａｐｏｎｉｃｕａ＋　ｆ、ｂａｒ
ｂｉｎｅｒｖｅ）、ミカエリソウ（Ｌ、５ｔｅｌｌｉｐ
ｉｌｕ＋＋＋）、Ｌ、ｃａｎｕｍ等の植物から通常の組
織培養法によって得ることができる。

すなわち、テンニンソウ属植物の葉、葉柄、茎、根部、
生殖器官、種子等の器官またはその一部を、通常用いら
れる一般的な滅菌法（例えば、エタノール水溶液、次亜
塩素酸ナトリウム水溶液、滅菌水等を用いる方法）によ
り滅菌し、適当な大きさに裁断した後、培地に置床し、
温度１５〜３０℃で、２〜８週間培養を行うことにより
カルスを得ることができる。該カルスを固体培地または
液体培地で継代培養することにより、大量の未分化細胞
を得ることができる。

以上の培養に用いる培地としては、各！既知の無機合成
培地を基本とし、これに糖類、悼物生長調整物質、ビタ
ミン類、アミノ酸類および天然物質等を添加した液体培
地またはこれらの一体培地に寒天、ジェランガム等を加
えて固化さｔｔだ固体培地を用いることができる。

代表的な合成培地としては、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）の
培地、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　
Ｓｋｏｏｇ）の培地（以下、ＭＳ培地と称する）、リン
スマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓａ＋ｅｉｅｒ　＆　Ｓ
ｋｏｏｇ）の培地、エッチ（Ｎｉｔｓｃｈ）の培地、Ｂ
５培地、その他これらの培地を基本として、その組成を
変更したもの等が挙げられる。

無機合成培地の無機成分の具体例としては、銅、窒素、
リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、
鉄、マンガン、亜鉛、ホウ基、モリブデン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素、コバルト等、さらに詳しくは、硝酸カ
リウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、塩化カリウム
、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム
、硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、二酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバ
ルト等が挙げられる。

糖類の具体例としては、シュークロース、イノシトール
、グルコース等の炭水化物またｊよその誘導体等が挙げ
られる。

植物生長調整物質の具体例としては、インドール酢酸（
ＩＡＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−ジ
クロロフェノキシＤＨ（２，４−Ｄ　）、インドール酪
酸（ＩＢＡ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン
、ジヒドロゼアチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、イソ
ペンテニルアデニン等のサイトカイニン類等が挙げられ
る。

またビタミン類の具体例としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＩ３．）、
パントテン酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ニコチ
ン酸等が挙げられ、アミン竺の具体例としては、グリシ
ン、アラニン、グルタミン、システィン等が挙げられる
。

天然物質の風体例としては、カゼイン加水分解物、ココ
ナツトミルク、酵母エキス等が挙げられ、上述した具体
例の他、適宜培養に必要な物質を加えても良い。

具体例１ フジテンニンソウの葉を流水でよく濯ぎ、７０％エタノ
ール中に３０秒間、次いで１％次亜塩素酸ナトリウム水
溶液で５分間滅菌した後、滅菌水で３回洗浄した。滅菌
した葉は、無菌的に約３　ＲＭの小片に切断し、ＭＳ固
体培地（２，４−Ｄ　　５　ｍ、シュークロース３％、
ジェランガム０．２％含有）に置床し、２５℃、暗黒下
で培養することによって、■か月後にカルスを得た。該
カルスを上記と同じ条件で４代植え継いだ後、ＭＳ液体
培地（２，４−Ｄ　　５　ＡＭ、シュークロース３％含
＊、＋＜、＝ｅ植し、３週間間隔で液体培養を繰り返す
ことにより、多量のフジテンニンソウの未分化細胞を得
た。

具体例２ テンニンソウの葉を具体例１と同様の滅菌方法で滅菌し
た後、３５１ｊ１角に切断し、ＭＳ固体培地（ＮＡＡｏ
、５浦、カイネチン０．５浦、シネ−クロース３％、ジ
ェランガム０．２％含有）に置床し、２５℃、暗黒下で
１か月培養してカルスを得た。

該カルスを上記と同様な条件の培地で継代培養し増殖さ
せ、多量の未分化細胞を得た。

次に本発明のテンニンソウ属植物から誘導した未分化細
胞を培養してアクテオシドを分離採取する方法について
説明する。

上記のようにして得たテンニンソウ属植物の未分化細胞
を、少なくとも一種以上のオーキシン類および／または
サイトカイニンを含む液体または固体培地に移植し、好
気的な条件の下で温度１５〜３５℃、好ましくは２５℃
付近でｌ〜８週間培養することにより、アクテオシドを
大量に含むテンニンソウ属植物の培養細胞を効率よく安
定して生産することができる。この際、必ずしも光の照
射を必要としないが、場合によっては光を照射しても構
わない。

培養に用いる培地としては、各種既知の無機合成培地を
基本とし、これに植物生長調整物質を加え、また糖類、
ビタミン類、アミノ＊類および天然物質等を添加した液
体培地またはこれらの液体培地に寒天、ジェランガム等
を加えて固化させた固体培地を用いることができる。

糖類、ビタミン類、アミノ酸類および天然物質等の具体
例は前述したものと同様で良い。

植物生長調整物質としては、Ｉ　ＡＡＳＮＡＡ。

Ｉ　Ｂ　Ａ　、　２．４−Ｄ等のオーキシン類を０．１
〜亀００副、好ましくは１〜２０浦の濃度で添加するの
が良い。また、カイネチン、ＢＡ、ゼアチン、イソペン
テニルアデニン等のサイトカイニン類を０．１〜１００
瑚、好ましくは１〜２０／Ｊｌの濃度で添加すると、ア
クテオシドの生成に良好である。

以上のようにして得られた培養細胞からアクテオシドを
分離採取するには、従来から行われているアクテオシド
の抽出、単離、精製方法と同様で良く、例えば以下に示
す如く行えば良い。

すなわち、培養細胞を培養液からろ別し、そのままある
いは乾燥して、水、アルコール類、水とアルコール類の
混合溶媒または水とアセトンの混合溶媒で抽出し、該抽
出液から溶媒を除去した残渣をそのまま、または必要に
応じて水に溶解し、水、メタノール、エタノール、酢酸
、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、アセトン
、ベンゼン、アセトニトリルから選ばれる少なくとも一
つを溶出溶媒としてダイヤイオンＨＰ−２０、ＭＣＩゲ
ルＣＩ−ＩＰ−２０Ｐ等のポーラスポリマーセファデッ
クスＬＨ−２０等のセファデックス、逆相系シリカゲル
、シリカゲル、ポリアミド、活性炭またはセルロース等
を担体に用いたカラムクロマトグラフィーに数回付し、
１１層クロマトグラフィーで目的成分を確認しながら分
画することにより得ることができる。

また必要に応じて、適宜溶出液から溶媒を除去した残渣
をそのまま、または水に溶解して石油エーテル、エーテ
ル、クロロポルムなどの有機溶媒で抽出し、得られた有
機溶媒に移行する脂溶性成分を除去しても良い。

［発明の効果］ 本発明によれば、病虫害や天候等の自然条件の影響を受
けることなく、均質かつ大量のアクテオシドの原料を効
率良く、安定して供給することが出来、アクテオシドの
工業生産が可能となる。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれにより同等制限されるしのではない。

実施例１ 具体例１で得られたフジテンニンソウの未分化細胞を、
２．４−Ｄを１ｍおよびＢＡを１／Ｊの濃度で添加した
Ｂ５液体培地に移植し、２５℃、暗黒下、！　２０ｒｐ
＋ｓで３週間振盪培養を行った。

以上のようにして得た培養細胞を、凍結乾燥し粉砕した
後、２ｇをとり、５０（ｌｄのメタノールで超音波抽出
を２時間行った。得られた抽出液から、溶媒を減圧上留
去し、メタノールエキスを得た。このメタノールエキス
を、水に溶解し、ＭＣＩｇｅｌ　ＣＨＰ−２０Ｐ（三菱
化成製）カラムクロマトグラフィーに付し、最初は水、
その後逐次メタノール濃度を増加して溶出し、３０〜４
０％のメタノール水溶液で溶出される両分を得た。該両
分をセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製）カラ
ムクロマトグラフィーに付し、４０％メタノール−水で
溶出し、溶媒を減圧上留去してアクテオシド８２．５５
Ｉ９を得た。

実施例２ 具体例！で得られたフジテンニンソウの未分化細胞を２
．４−Ｄを５−の濃度で添加したＢ５液体培地に移植し
、実施例１と同様に培養・抽出を行うことにより、乾燥
細胞２９から１１５．２１９のアクテオシドを得た。

実施例３ 具体例１で得られたフジテンニンソウの未分化細胞を２
．４−Ｄを５浦およびＢＡを１６１の濃度で添加した８
５Ｑ体培地に移植し、実施例１と同様に培養・抽出を行
うことにより、乾燥細胞２ｇから１４３．１１１９のア
クテオシドを得た。

実施例４ 具体例２で得られたテンニンソウの未分化細胞を、ＮＡ
Ａを０．５−、カイネチンを０．５浦の濃度で添加し、
ジェランガム（０，２％）で固化させたＢ５固体培地に
置床し、実施例１と同様に培養・抽出を行うことにより
、乾燥細胞２９からアクテオシド２５．８１１９を、得
た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）テンニンソウ属植物から誘導した未分化細胞を培
   養して、該培養細胞からアクテオシ ドを分離採取することを特徴とするアクテ オシドの製造法。
2. （２）培養培地に０．１〜１００μＭのオーキシン類お
   よび／またはサイトカイニン類を添加 することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。