JPH0335790A

JPH0335790A - イソプレノイド側鎖を持つフラボノイドグリコサイドの製造法

Info

Publication number: JPH0335790A
Application number: JP16994689A
Authority: JP
Inventors: Mizuo Mizuno; 水野　瑞夫; Munekazu Iinuma; 宗和飯沼; Toshiyuki Tanaka; 田中　稔幸; Hirofumi Yamamoto; 浩文山本
Original assignee: P C C TECHNOL KK
Current assignee: P C C TECHNOL KK
Priority date: 1989-07-03
Filing date: 1989-07-03
Publication date: 1991-02-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はイソプレノイド側鎖を持つフラボノイドグリコ
サイドの製造法に関する。イソフラボノイドグリコサイ
ドは、魚類、昆虫、動物、菌類などに毒性や生理活性を
有するので、農薬などとして期待される。

〔従来の技術〕

従来、イソプレノイド側鎖を持つフラボノイドグリコサ
イドの製造法としては、栽培あるいは採取した植物から
抽出分離する方法が用いられている。このため、年度、
季節、産地、株の差などによる生産性の変異が大きかっ
た。細胞培養による生産の安定化についても試みられて
いる、ロチノイドをはじめいずれの報告も生産性は低い
。中でも、イソプレノイド側鎖を有するアンヒドロイカ
リチン（ａｎｈｙｄｒｏｉｃａｒｉｔｉｎ）あるいはデ
スーＯ−メチルアンヒドロイカリイン（ｄｅｓ−０−ｎ
＋ｅｔｈｙｌ　ａｎｈｙｄｒ。

１ｃａｒｉｉｎ）を基本骨格とするフラボノイドグリコ
サイドの含有量が多いメギ科植物の場合には、カルス化
や細胞および組織の培養が困難なものが多く、組織培養
による生産は報告されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

したがって、組織培養によるイソプレノイド側鎖を有す
るアンヒドロイカリチンあるいはデスーＯ−メチルアン
ヒドロイカリインを基本骨格とするフラボノイドグリコ
サイドを工業的に安定生産することが重要な課題である
。このような事情にかんがみ、本発明者らは、イカリソ
ウ属およびその近縁植物のカルス化と細胞組織の培養法
について検討を進めた結果、つぎのような事実を見いだ
した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明者らは組織培養するに当り、メギ科（
Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）植物の中でイカリソウ属
（ｈＩ担比□属）およびその近縁の植物の組織培養によ
るイソプレノイド側鎖を有するアンヒドロイカリチンあ
るいはデスーＯ−メチルアンヒドロイカリインを基本骨
格とするフラボノイドグリコサイドの生産を試みた結果
、イカリソウ属の近縁であるバンクベリア属（Ｖａｎｃ
ｏｕｖｅｒｉａ）の植物の細胞のみ培養が容易であり、
しかもカルス中に特異的にイソプレノイド側鎖を有する
アンヒドロイカリチンあるいはデスーＯ−メチルアンヒ
ドロイカリインを基本骨格とするフラボノイドグリコサ
イドを著量生産することを見いだし、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明によれば、蒐集した日本産
、中国産、欧州産のイカリソウ属（エビメジウム属：ホ
ザキイカリソウ、トキワイカリソウ、バイカイカリソウ
など）、イカリソウ属に近縁な米国産のバンクベリア属
植物の培養を試みた中で、米国産のバンクベリア属植物
のみがカルス化でき、しかもカルスからイソプレノイド
側鎖を有するアンヒドロイカリチンあるいはデス−０−
メチルアンヒドロイカリインを基本骨格とするフラボノ
イドグリコサイド、たとえは、エビメジンＡ、エピメジ
ンＢ、エピメジンＣ、イカリイン、イカリソサイドＦ、
イカリソサイドＡ、サジタイトサイトＢ、イカリシド■
、ヘキサンドラサイドＡ、ヘキサンドラサイドＢを効率
良く生産することができた。

上記フラボノイドグリコサイドのうちヘキサンドラサイ
ドＡおよびヘキサンドラサイドＢは新規なフラボノイド
グリコサイドであり、その理化学的性質は次の通りであ
る。

（本頁以下余白）ミ　粘　寺　款　真本発明で使用される培地は、植物の細胞を培養増殖する
ことができるものであればいかなる培地でも利用するこ
とができる。すなわち、培地としては、１０〜１００　
ｇ　／　ｉの糖、０．１〜１０■／ｌの植物ホルモン類
および窒素源、無機物、ビタミン類などをほどよく含有
するものであれば天然または合成培地のいずれでも用い
られる。

糖としては、シュークロース、グルコース、ラクトース
、マルトースなどが用いられる。

植物ホルモン類としては、オーキシン類（α−ナフタレ
ン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、インドール
酢酸、インドール酪酸なと）、サイトカイニン類（カイ
ネチン、ベンジルアデニン、ゼアチン、４ＰＵなど）、
ジベレリン類（主としてＧＡ３．ＧＡ４．ＧＡ７など）
、アブサイシン酸、エチレンなどが用いられる。本発明
では、オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸あるいは２
．４−ジクロロフェノキシ酢酸０．５〜１０■／ｌサイ
トカイニンとしてカイネチンあるいはベンジルアデニン
０．２〜１０■／ｌを組み合わせて添加することが好ま
しい。

窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸
アンモニウム、硝酸カルシウム、硫酸アンモニウム、ア
ミノ酸類（グリシン、グルタミン酸、リジン、アスパラ
ギン酸など）、イーストエキス、肉エキス、ペプトンな
どが用いられる。

無機物としては、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化
マンガン、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化アルミニ
ウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫
酸ニッケル、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸チタン、硫酸
亜鉛、硫酸銅、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素
カリウム、ヨウ化カリウム、ホウ酸、モリブデン酸ナト
リウムなどが用いられる。

その他必要に応じて培地にビタミンＢｌ、イノシトール
、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸、塩酸チアミン、ビオ
チンなどを加えてもよい。

具体的な培地としてはムラシゲ・スクーグ氏培地、リン
スマイヤー・スクーグ氏培地、ホワイト氏培地、クノッ
プ氏培地などが用いられる。

培養は温度■０〜３５°Ｃ１照度０〜２０，０００ルク
ス、ｐＨ３，５〜８．５で行い、培養時間は１０〜ｉｏ
ｏ日間で完了することが多い。

培養に際しては先ず植物の葉、茎、根などの組織を小片
（５×５〜５０Ｘ５０ｍｍ）に切断し、表面を例えば次
亜塩素酸ソーダ、エチルアルコールなどで殺菌処理した
後、無菌水で良く洗う。このように表面殺菌した小片を
滅菌固体培地に培地２〜ｌ〇−当り小片１個の割合で置
床後、１０〜３５°Ｃで２０〜５０日間静置培養すると
組織の表面がカルス化すると共にカルスが生育し、カル
スの塊が得られる。

かくして得られるカルスを滅菌した同一の培地に約３０
〜５０日毎に繰り返し移植してカルスを増殖する。この
場合、当初はカルスの量が少ないので試験管で培養法す
れば良いが、カルスが増殖して量が多くなったらフラス
コ、ビーカー、シャーレ、ジャムビンなどの容器を適宜
用いればよい。

液体培地での培養は、例えば３０Ｍ！容エルレンマイヤ
ーフラスコでは３０〜２００ｍｊ！程度の液体培地と培
地１００Ｉｄ当りカルスを新鮮重量として１から２０ｇ
を移植し、１０〜３５℃、毎分６０〜２５０回転の振と
う培養を行う。このようなフラスコによる液体培養によ
り移植した細胞組織がさらに生育して移植した量の２か
ら２０倍に生育したら、生育した細胞組織の約１７２〜
１／２０を、フラスコを用いた上記の方法と同様に液体
培地に移植して同一条件で培養する操作を繰り返して細
胞組織を増殖する。このようにして増殖した細胞組織が
移植した液体培地内で移植した量の２〜２０倍に生育さ
せて代謝物質を生産する材料を得る。このほか、代謝物
質を生産させる植物細胞組織材料を得る方法としては、
既知の方法がいずれも利用することができる。このよう
にして代謝物質を得る材料が増殖したら、細胞組織を培
養容器から取り出し、イソプレノイド側鎖を有するフラ
ボノイドグリコサイドを回収する０回収方法としては、
既知の抽出分離方法の他、細胞内から培地に透過させる
処理を施して連続的あるいは繰り返し回収する方法（特
願昭６３−６９７４５号）を使用することもできる。

以下に実施例を示す。

〔実施例〕

実施例１バンクベリア（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒｉａ　ｈｅｘａｎｄ
ｒａ　Ｍｏｒｒ、　＆Ｄｃｎｅ）の茎を約５Ｃ１１の長
さに切り、７０％エチルアルコールで２分間、次いで次
亜塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩素量０．５％）で１
００分間殺菌した後に５〜１０ｆｆｌＩ１１の切片に切
った。該切片を、第１表に示したリンスマイヤー・スク
ーグ培地にカイネチンを培地１１当り３■、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸を培地１１当り５■、および寒天
を培地１１当り８ｇの濃度で添加した培地１０　ｍｌを
含有する直径２４ａｍ、長さ１２５ａｕａの試験管に移
植し、２５°Ｃ１２５００ルクス連続照明下６０日間培
養してカルスを形成させた。

培養６０日後、生育したカルスを無菌的に取り出し、ピ
ンセットとメスを用いて再度、同−組成の新しく作成し
た培地１０ｍ１を含有する直径２４ｍｍ、長さ１２５ｎ
ｎの試験管に移植して、２５°Ｃで３０日間培養し、生
育したカルスを得た。このカルスをピンセットとメスを
用いて無菌的に分割し、前記と同様の培養方法で継代増
殖を繰り返してカルスを増殖させた。このようにして増
殖したカルスを無菌的に取り出し、ピンセットとメスを
用いてカルスを無菌的に採取し、前記第１表の組成の培
地３０１ｄを含有する直径５ｃｍ、高さ１０ｃ１１のジ
ャム瓶に移植して２５℃、３０００ルクスの連続照明下
で４０日間培養し、カルスをさらに増殖した。培養４０
日０にジャム瓶からカルスを取り出し、抽出分離を行っ
た。

抽出分離は、まずジャム瓶から取り出したカルスを新鮮
重量として３６８ｇを真空乾燥機で室温で乾燥し、乾燥
重量として２２．５ｇを得た。この乾燥カルスに８０％
メチルアルコールを２１加え、常温で１昼夜抽出を行っ
た後、ロータリーエバポレータで濃縮した。

このようにして得た粗抽出液をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（溶出溶媒はクロロホルム：メチルアルコ
ール：水−６５：　３５　：　１０）で分離した結果、
イカリイン１１．７２■、エビメジア８０．８３■、エ
ビメジアＣ３，フ５■が得られた。なお、粗抽出液を高
速液体クロマトグラフィーで分析した結果、イカリイン
、エピメジンＡ１エピメジンＢ。

エピメジアＣ１イカリオサイドＦ１イカリオサイドＡ２
サジタイトサイドＢ、イカリシド■、ヘキサンドラサイ
ドＡ１ヘキサンドラサイドＢが含有されていることが明
らかになった（第１図）。

実施例２実施例１において、前記第１表の組成の培地３゜−を含
有する直径５　ｃｍ、高さ１０ｃｍのジャム瓶に移植し
て２５°Ｃ１３０００ルクスの連続照明下で４０日間培
養し、カルスをさらに増殖した後、その一部を材料とし
、培養４０日０にジャム瓶からカルスを取り出し、第２
表のムラシゲ・スクーグ液体培地ｉｏ。

−を含む３００ａｌ！容のフラスコにフラスコ当り新鮮
重量として約２ｇを移植し、２５℃、３０００ルクス連
続照明下、毎分１３０回転で７０日日間上う培養した。

その結果、培養した２００本のフラスコの内１本のみの
細胞が生存し増殖したので、これを同−組成の培地ｔｏ
ｏｌｌｌを含む３００ＩＩ１１容のフラスコにフラスコ
当り約３０ｍを移植してさらに３０日日間上う培養した
。この操作を２回繰り返して細胞を増殖した。

このようにして増殖した細胞をフラスコから取り出し、
新鮮重量として５０ｇにメチルアルコール２００戚を加
えて、常温で一昼夜抽出を行った後、ロータリーエバポ
レーターで濃縮して得た粗抽出液をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（溶出溶媒はクロロホルム：メチルア
ルコール：水＝６５：　３５　：　１０）で分離した結
果、イカリイン１．２ｍｇが得られた。

第１表　リンスマイヤー・スクーグ培地硝酸アンモニウ
ム硝酸カリウム塩化カルシウム・２水塩硫酸マグネシウム・７水塩リン酸第−カリウムＮａ、−ＥＤＴＡ・２水塩硫酸第一鉄・７水塩ホ　　ウ　　酸硫酸マンガン・４水塩硫酸亜鉛・７水塩１．６５０　　　　ｍｇ１　、９００　　　　■ ４４０　　　　ｍｇ３７０　　　　ｌａｇ１７０　　　　■ ３７．３　■ ２７．８　　■ ６．２　　■ ２２．３　■ ８．６　　■ ヨウ化カリウムモリブデン酸ソーダ・２水塩硫酸第一銅塩化コバルトビタミンＢ１イノシトールシュークロース２．４−ジクロロフェノキシ酢酸カイネチン０．８３１１１ｇ０．２５　■ ０．０２５■ ０．０２５■ ０．４０　■ １００　　　　■ ３０、Ｏｍｇ５．０　　ｍｇ３．０　　■ 前記の成分を脱イオン水に溶かして１１とし、０．１規
定のカセイソーダ水溶液でｐＨを６．０に調節し、培養
容器に分注した後１２１’Ｃで２０分間殺菌する。

第２表ムラシゲ・スクーグ培地硝酸アンモニウム硝酸カリウム塩化カルシウム・２水塩１　、６５０１　、９００４０ ■ ■ ■ （ＡＭマグネシウム・７水塩リン酸第−カリウムＮａ１已ＤＴＡ・２水塩硫酸第一鉄・７水塩ホ　　ウ　　酸硫酸マンガン・４水塩硫酸亜鉛・７水塩ヨウ化カリウムモリブデン酸ソーダ・２水塩硫酸第一銅塩化コバルトビタミンＢ１イノシトール塩酸ピリドキシンニコチン酸グリシンシュークロース２．４−ジクロロフェノキシ酢酸３７０　　　■ １７０　　　■ ３７．３　１ｇ２７．８　　■ ６．２　■ ２２．３　■ ８．６　　■ ０．８３　■ ０．２５　■ ０．０２５ｍｇ０．０２５■ ０．４０　Ｍ１００　　　　ｇ０．５０　■ ０．５０　　ｍｇ２．００　　ｍｇ３０．０　１ｇ５．０　　ｗｇ前記の成分を脱イオン水に溶かしてｌｌとし、０．１規定のカセイソーダ水溶液でｐＨを６．０に調節
し、培養容器に分注した後１２１°Ｃで２０分間殺菌す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バンクベリア細胞粗抽出区分の高速液体クロ
マトグラフィーによる溶出パターンを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、バンクベリア（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒｉａ）属植物の
細胞を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド側鎖を
持つフラボノイドグリコサイドを蓄積させ、これを該培
養物より回収することを特徴とするイソプレノイド側鎖
を持つフラボノイドグリコサイドの製造法。２、フラボノイドグリコサイドがアンヒドロイカリチン
またはデス−Ｏ−メチルアンヒドロイカリインを基本骨
格とするフラボノイドグリコサイドである請求項１記載
の製造法。３、培養物が培養によって得られたカルスであることを
特徴とする請求項１又は２記載の製造法。４、下記式で表わされる新規フラボノイドグリコサイド
であるヘキサンドラサイドＡ又はヘキサンドラサイドＢ
。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ヘキサンドラサイドＡの場合はＲが−ｇａｌ（
ガラクトース残基）であり、ヘキサンドラサイドＢの場
合はＲが−ｇａｌ−Ａｃ（ガラクトース−アセチル残基
）である。また、ｇｌｃはグルコース残基を示し、ｒｈ
ａはラムノース残基を示し、Ｍｅはメチル基を示す。）