EA041652B1

EA041652B1 - Способ получения каллусной культуры клеток artemisia vulgaris l.

Info

Publication number: EA041652B1
Application number: EA202092144
Authority: EA
Inventors: Елена Евгеньевна Антонова; Елена Валериевна Кучарова; Жанна Михайловна Охлопкова
Priority date: 2019-10-09
Filing date: 2020-10-08
Publication date: 2022-11-18

Description

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для пищевой и фармацевтической промышленности как источник сырья для пищевой добавки и биологически активных веществ.

Полынь обыкновенная, чернобыльник, Artemisia vulgaris L. относится к семейству сложноцветных. Строение корневища крепкое, немного ветвистое. Стебли прямостоячие, красно-бурые, наверху разветвленные, до 1,0-1,5 м высотой. Листья сверху голые или слегка пушистые, темно-зеленые, снизу сероватые, паутинисто-войлочные, перисто-рассеченные на удлиненные зубчатые доли. Цветки очень мелкие, собраны в яйцевидные корзинки 2-4 мм шириной, составляющие широкое, несколько поникающее, метельчатое соцветие; обертка каждой корзинки покрыта густым войлочком; цветки красноватые, реже желтые. Цветет в июле-августе. Места произрастания пустыри, огороды, сорные места, возле жилья, реже луга и берега рек.

Используемые органы полыни обыкновенной: верхушки цветущих растений. Для заготовки сырья собирают лиственные цветоносные верхушки в период цветения. Установлено, что в траве содержится эфирное масло (до 0,61%), аскорбиновая кислота (175 мг%), каротин, немного дубильных веществ. В состав эфирного масла входят туйон, цинеол, борнеол. Известно, что в условиях произрастания в Якутии листья полыни обыкновенной содержат на сырой вес до 130 мг% аскорбиновой кислоты и 11 мг% каротина, при этом в траве содержится 0,04-0,05% эфирного масла (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии и перспективы их освоения. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2002. - 264 с). Масло характеризуется как жидкое, светло-желтое, со слабым запахом. Анализы образцов различного сбора на алкалоиды дали противоречивые показатели.

Растение широко применяется в народной медицине многих стран при различных заболеваниях женской половой сферы (аменорея, дисменорея), как обезболивающее и ускоряющее роды средство, а также в качестве успокаивающего, противосудорожного средства при эпилепсии, неврастении и других нервных заболеваниях. Помимо этого, отвар всего растения применяют при гастритах, как мочегонное; порошком из сухих веток засыпают раны. В китайской медицине листья применяют в качестве кровоостанавливающего, жаропонижающего, общеукрепляющего, а также антитоксического средства. Назначают при токсикозах, пиодермии, невралгиях. При бронхиальной астме назначают вдыхание дыма, получаемого от сжигания сухих стеблей и листьев. Наружно применяют ванны из отвара надземных частей растения при почечнокаменной болезни, при кожных заболеваниях. В якутской народной медицине отвар рекомендуют пить при головной боли, боли под лопаткой, при глистах, параличах и проказе. Известно, что трава входит в состав микстуры М.Н. Здренко (см. SU №115587, кл. А61К 35/78, опубл. 1958). Кроме того, растение употребляется в пищу: в дореволюционное время служило в иные периоды основным источником поддержания жизни.

Известны способы культивирования Artemisia annua L., например, по патенту CN №102487823 (кл. G01D 3/043, опубл 23.07.2008) молодые стебли растения дезинфицируют и поперечно режут на сегменты и культивируют в среде для укоренения. Далее пересаживают для укоренения в почву.

Ближайшим аналогом заявленного решения является разработка состава питательной среды для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы (см. RU №2393217, кл. C12N 5/04, опубл. 27.06.2010), при этом питательная среда содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, фитогормоны, витамины, сахарозу, а в качестве гормона - бензиламинопурин (6-БАП).

При этом используется гормональный состав питательной среды, содержащий в качестве гормона роста только фитогормон 6-бензиламинопурин, что недостаточно для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) для использования в качестве источника биомассы для пищевой добавки и для получения биологически активных веществ.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) включает стерилизацию семян интактных растений полыни раствором перекиси водорода (3% раствор) в течение 10 мин и этилового спирта (70% раствор) в течение 1 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH₄NO₃ - 33000, KNO3 - 38000, CaCl₂x2H₂O - 8800, MgSO₄x7H2O - 7400, KH2PO4 -3400, KI - 166, H3BO3 - 1240, MnSO₄x4H2O 4460, ZnSO₄x7H2O - 1720, Na2MoO₄x2H2O - 50, CuSO₄x5H2O - 5, CoCkx6H2O - 5, FeSO4x7H2O - 5560, NaЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, тиамин - 100, пиридоксин - 100, никотиновая кислота - 100, сахароза 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава, мг: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, CaCl₂x2H₂O - 8800, MgSO₄x7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, H₂BO₃ - 1240, MnSO₄x4H₂O - 4460, ZnSO₄x7H₂O -1720, Na₂MoO₄x2H₂O - 50, CuSO₄x5H₂O - 5, CoCl₂x6H₂O - 5, FeSO₄x7H₂O -5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, гидролизат казеина - 500, тиамин - 100, пиридоксин - 100, никотиновая кислота - 100, сахароза - 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, цитокинин (6-бензиламинопурин) - 1,

- 1 041652 нафтилуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют 1/4 живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 суток.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию новизна.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана на территории Амгинского района (с. Болугур) Республики Саха (Якутия) в фенофазах конец цветения, начало плодоношения.

При этом семена стерилизовали раствором 3% перекиси водорода в течение 10 мин, затем 70% спиртовым раствором в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в табл. 1.

Из полученного проростка получают листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, 6-бензиламинопурина, нафтилуксусной кислоты. Наиболее интенсивное каллусообразование получили при концентрации фитогормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в 1 мг/л, 6-бензиламинопурина - 1 мг/л, α-нафтилуксусной кислоты - 1 мг/л. После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конические колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в табл. 2.

Культивирование проводят в темноте при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 3 недели. При пересеве используют 1/4 живой каллусной культуры. Полученные каллусные культуры пересаживали каждые 21 день, таким образом, сохраняя полученную ткань. В процессе культивирования определяют морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Технический результат - получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Полученный каллус характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры плотные, оформленные, имеют светло-серую окраску. Для определения веса сырой биомассы каллусные культуры отделяют от среды культивирования на бумажные фильтры и взвешивают. При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 18-ые сутки культивирования, что позволяет использовать 3 недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в табл. 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) из листовых эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях.

Таблица 1. Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, мг/л

Компоненты:	Содержание
NH₄NO₃	33000
KNO₃	38000
СаС1₂х2Н₂О	8800
MgSO₄x7H₂O	7400
КН₂РО₄	3400
KI	166
Н₃ВО₃	1240
MnSO₄x4H₂O	4460
ZnSO₄x7H₂O	1720
Na₂MoO₄x2H₂O	50
CuSO₄x5H₂O	5
CoC1₂x6H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	5560
Na-ЭДТА	7460
Мезоинозит	100
Тиамин	100
Пиридоксин	100
Никотиновая кислота	100
Сахароза	2500
Вода	1000
Агар	7000

-

Claims

Таблица 2. Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры, мг/л

Компоненты: Содержание

NH₄NO₃ 33000

KNO₃ 38000

СаС1₂х2Н₂О 8800

MgSO₄x7H₂O 7400

КН₂РО₄ 3400

KI 166

Н₃ВО₃ 1240

MnSO₄x4H₂O 4460

ZnSO₄x7H₂O 1720

Na₂MoO₄x2H₂O 50

CuSO₄x5H₂O 5

СоС1₂х6Н₂О 5

FeSO₄x7H₂O 5560

Na-ЭДТА 7460

Мезоинозит 100

Г идролизат казеина 500

Тиамин 100

Пиридоксин 100

Никотиновая кислота 100

Сахароза 30000
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1

6- бензиламинопурин 1

Нафтилуксусная кислота 1

Вода 1000 мл

Агар 12000

Таблица
3 Ростовые параметры каллусных культур полыни обыкновенной

Показатели Значения, в г

Индексы роста по весу сырой биомассы 0,1678

Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1 0,0084

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения каллусной культуры клеток Artemisia vulgaris L., включающий стерилизацию семян интактных растений Artemisia vulgaris L. растворами перекиси водорода в течение 10 мин и этилового спирта в течение 1 мин, ополаскивание, отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава:

NH
4NO3 - 33000 мг;

KNO₃ - 38000 мг;

CaCl₂x2H₂O - 8800 мг;

MgSO₄x7H₂O - 7400 мг;

KH₂PO₄ - 3400 мг;

KI - 166 мг;

H₃BO₃ - 1240 мг;

MnSO₄x4H₂O - 4460 мг;

ZnSO₄x7H₂O - 1720 мг;

Na₂MoO₄x2H₂O - 50 мг;

CuSO4x
5H2O - 5 мг;

CoCl2x6H2O - 5 мг;

FeSO₄x7H₂O - 5560 мг;

Na-ЭДТА - 7460 мг;

мезоинозит - 100 мг;

тиамин - 100 мг;

пиридоксин - 100 мг;

никотиновая кислота - 100 мг;

сахароза - 2500 мг;

вода - 1000 мл;

агар - 7000 мг;

дальнейшее помещение эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава:

NH4NO3 - 33000 мг;

KNO3 - 38000 мг;

CaCl2x2H2O - 8800 мг;

MgSO4x7H2O - 7400 мг;

- 3 041652

KH₂PO₄ - 3400 мг;

KI - 166 мг;

Н₂ВО₃ - 1240 мг;

MnSO₄x4H₂O - 4460 мг;

ZnSO₄x7H₂O - 1720 мг;

Na₂MoO₄x2H₂O - 50 мг;

CuSO₄x5H₂O - 5 мг;

СоС1₂х6Н₂О - 5 мг;

FeSO₄x7H₂O - 5560 мг;

Na-ЭДТА - 7460 мг;

мезоинозит -100 мг;

гидролизат казеина - 500 мг;

тиамин - 100 мг;

пиридоксин - 100 мг;

никотиновая кислота - 100 мг;

сахароза - 30000 мг;

2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота -1 мг;
6-бензиламинопурин - 1 мг;

нафтилуксусная кислота -1 мг;

вода - 1000 мл;

агар - 12000 мг;

при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют 1/4 живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 сутки.

^8j) Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2