CN108812327B - 一种绵毛金腰的水培繁殖的培养液及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种绵毛金腰的水培繁殖的培养液及水培方法。本发明以绵毛金腰幼嫩茎段作为外植体，使用不同的培养液进行培养，根据外植体是否能生成不定根和腋芽以及所需时间长短作为依据，选择出适合绵毛金腰的水培繁殖的培养液并进行室外移栽。本发明的培养方法移栽成活率高，极大的促进绵毛金腰的繁殖，有效缩短生根时间，可以为绵毛金腰的规模化种植和大田管理提供原材料来源，适用大规模产业化生产。

Description

一种绵毛金腰的水培繁殖的培养液及培养方法

技术领域

本发明属于植物水培繁殖技术领域，具体涉及一种绵毛金腰的水培繁殖的培养液和培养方法。

背景技术

金腰(Chrysosplenium)是一种隶属于虎耳草科(Saxifragaceae)的植物，全球约65种，亚、欧、非、美四洲均有分布，但主产东亚温带。一般依据叶片对生或互生分为互叶亚属(Subg.Gamosplenium)和金腰亚属(Subg.Chrysosplenium or Subg.Dialysplenium)：互叶亚属全球约33种，中国产23种6变种；金腰亚属全球约32种，中国产11种和2变种；东亚有金腰属植物约51种，中国有36种8变种，南北均产，且其中21种为中国特有种。金腰是一种具有匍匐枝或鳞茎的多年生常绿小草本，它多生于潮湿的环境中。金腰的花果期一般在早春，其植株矮小，这也是它很容易被分类学专家们忽略的一个原因。另外，虎耳草科内其他种属的植物大多有5个一组的花瓣或萼片，而金腰属植物非但没有花瓣，萼片也只是4个一组，这是金腰属植物与虎耳草科其它属植物最大的区别，也正因此该属在虎耳草科的系统演化上具有特殊地位。

金腰种类繁多，据窦全丽的《国内金腰属药用植物研究进展》记录，金腰属民间药用植物主要有大叶金腰、贡山金腰、裸茎金腰、长梗金腰、中华金腰等13种。此外，郭娜的《福建省金腰属(虎耳草科)一新分布种》介绍了绵毛金腰(Chrysosplenium lanuginosumHook.f.et Thoms)，是一种主要分布于阴湿处，顶部叶浓密，叶互生，茎被褐色柔毛包裹的植物。绵毛金腰的药用价值颇高，研究表明可以从绵毛金腰中分离到黄酮醇类化合物以及一些其他的挥发性化学成分，在此基础上研究发现绵毛金腰具有抗病毒活性、细胞毒素作用、抑菌作用等。

植物快繁技术又可称为“快繁”和“微繁”，前者来源于其繁殖速度很快，后者来源于其使用的材料较细小。快繁是指在人为控制光照、温度、湿度、氧气等环境条件和营养条件下，利用植物部分组织器官作为外植体繁殖出植株的方法。水培是一种应用广泛的植物繁殖方法，是将植物的根、茎、叶、芽等切离植株，在一定条件下将浸泡于水中，待其长出不定根、不定芽后，可移栽，使其长成新的完整植株，水培是一种比较特别的营养繁殖方法，它除了可以用于促进生根，还能用于诱导不定芽、增殖芽苗、培养原球茎等，同时又克服了传统扦插受季节影响、遗传不稳定、扦插后管理环节繁琐等缺点，具有取材容易、操作简便、繁殖快、成本低的特点。

研究表明金腰属植物含有高度甲氧基化和羟基化的黄酮醇类化合物，应用价值颇高。现有技术中有利用愈伤组织培养方法进行金腰的繁殖与培养，但是，愈伤组织培养是一种在无菌条件下进行的，将外植体如离体器官、细胞、原生质体等放置于人工配制的培养基上培养，同时给予适合于外植体生长的环境与营养条件，诱导其产生愈伤组织或者潜伏芽等，再进一步培养成整个植株。愈伤组织培养方法对无菌环境要求很高，对于培养条件、操作人员、设备的要求较高，且培养周期较长，不适合用于大规模的产业化生产。

目前我国的金腰资源紧缺，且国内外关于金腰的水培快繁技术方面的研究，特别是绵毛金腰的水培快繁技术，可以说尚属空白。因此，获得一种培养液成分简单，配制容易且适用于水培快繁的绵毛金腰培养液，并以此培养液为基础开发出再生率高，操作简便，繁殖速度快，适用于大规模产业化生产的绵毛金腰的水培快繁技术，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明目的之一是一种金腰属植物的水培繁殖培养液，特别是绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液，其可以使金腰属植物利用水培方式进行繁殖，实现金腰属植物快速繁殖的目的，该培养液可以快速促进金腰属植物外植体的生成腋芽和不定根，并促进腋芽和不定根的生长。

为实现上述目的，本发明的金腰属植物的水培繁殖培养液由植物激素与水组成，所述植物激素的浓度为0.5-0.05mg/L。优选的，所述金腰属植物为绵毛金腰，所述外植体为茎段，所述植物激素选自6-BA，NAA或IAA，所述植物激素的浓度为0.5或0.05mg/L。进一步优选的，所述培养液由NAA与水组成，所述NAA的浓度为0.05mg/L，或者，所述培养液由IAA与水组成，所述IAA的浓度为0.5或0.05mg/L，所述茎段为含有叶片的茎段。

在上述培养液中，IAA为吲哚乙酸，其是一种有机物。纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末，其通常作为植物生长激素，调节植物的生长，促进植物生根生芽。

NAA为萘乙酸，其纯品为无色针状晶体,工业品为黄褐色针状晶体，易溶于热水、乙醇、乙酸、丙酮和苯，是一种广谱植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根和生芽，增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。

6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，英文通用名：6-Benzylaminopurine，分子式：C₁₂H₁₁N₅。6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点,因而被广泛采用,并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。

本发明的第二个目的是提供一种金腰属植物的水培繁殖培养液，特别是绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液的制备方法，具体步骤如下：(1)激素量取体积的计算方法：根据培养液体积(250mL)和激素的浓度计算，则2.0mg/L的激素需取相应的1mg/mL的激素母液500μL；0.5mg/L的激素需取相应的1mg/mL激素母液125μL；0.05mg/L的激素需取相应的1mg/mL激素母液12.5μL。(2)配制方法：用量筒量取250mL的自来水，转移到250mL的蓝盖瓶中；移液器量取相应体积与浓度的激素母液，转移至蓝盖瓶内；加盖，混匀，拧紧，贴标，室温保存待用。

本发明的第三个目的是提供一种金腰属植物的水培繁殖，特别是绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液的方法，其采用本发明所述的水培繁殖培养液，实现了快速促进金腰属植物外植体的生成腋芽和不定根、操作简单，适用于大规模生产的效果。所述方法的具体步骤为：

(1).配制权利要求前述水培繁殖培养液；优选的，所述培养液由NAA与水组成，所述NAA的浓度为0.05mg/L，或者，所述培养液由IAA与水组成，所述IAA的浓度为0.5或0.05mg/L。进一步优选的，所述水为自来水；

(2).外植体的选取，选择生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株，后取植株幼嫩、大小适宜的含有叶片的茎段部分作为外植体；

(3).外植体的处理，采摘：左手托住植物，右手用刀片斜切，即得到所需茎段；清洗：取回来的茎段用手托住，然后轻轻抖动，慢慢拍打，使不定根上附带的泥土脱落；然后将茎段置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓，直至肉眼观察不到茎段及其叶片上有泥沙颗粒为止；切割：绵毛金腰的每个外植体约2-3cm，切割点靠近节点处，斜切，保留叶片；修剪后再次清洗外植体，将修剪时留下的残渣清理掉。

(4).外植体的培养，将处理完的外植体置于步骤(1)配制完成的培养液之中，进行培养；培养条件：温度：12-15℃，光照时间12h，光照强度500-1000lx，湿度；每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿；

(5).外植体的移栽：外植体长出不定根和腋芽后，将其移栽到用多菌灵灭过菌的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中；室外培养，水分保证充足。

本发明的第四个目的是提供一种金腰属植物的水培繁殖培养液的用途，特别是绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液的用途。所述用途为：用于金腰属植物外植体的水培繁殖；用于促进金腰属植物外植体的腋芽生成和生长；用于促进金腰属植物外植体的不定根生成和生长。优选的，所述金腰属植物为绵毛金腰，所述外植体为茎段，所述茎段为含有叶片的茎段。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明是一种针对金腰，特别是绵毛金腰的水培快繁方法。利用绵毛金腰的茎段作为外植体，水培形成不定根和腋芽，移栽成活率高，极大的促进金腰的繁殖，有效缩短生根时间，可以为金腰的规模化种植和大田管理提供原材料来源，适用大规模产业化生产。

2.以自来水为培养液的主要成分，添加不同类型、不同浓度的培养液和激素，探索能生成不定根和腋芽的最佳培养液。研究表明不添加培养液添加低浓度IAA的培养液更利于金腰水培。

3.将外植体移栽到用多菌灵灭菌过的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中。蛭石具有很好的松散性和保水性，可以保证充足的水分。

4.移栽后的外植体在培养一段时间后生长为一颗完整植株，取该植株的茎段作为外植体再次进行水培培养，能生成不定根，移栽后能存活，提高了绵毛金腰培养的扩繁能力和扩繁系数。

5.绵毛金腰含有高度甲氧基化和羟基化的黄酮醇类化合物，应用价值颇高。本发明可以为深入研究和开发金腰的药用价值打下基础。

附图说明

图1是B类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

图2是A类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

图3是C类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

图4是D类培养液中绵毛金腰外植体生长情况；

图5是B类培养液第50天腋芽和不定根的生长情况；

图6是B-4和B-5培养中绵毛金腰外植体切口处不定根的生长情况，培养时间为30天；

图7是B-5培养液培养的外植体移栽室外的生长情况。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

实施例1绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液

为了探索不同培养液成对于绵毛金腰外植体的水培繁殖效果的影响，我们以三个变化因子为研究对象设计了实验，一是添加的培养基的种类，二是添加的激素的种类，三是添加的激素的质量浓度，实验中使用的培养液一共有四类，每类有五种，其中A、C、D三类分别添加MS(MS培养基每1000mL称取4.43g MS粉末)、1/2MS(1/2MS培养基每1000mL称取2.47g1/2MS粉末)、B5(B5培养基每1000mL称取30.21g B5粉末)三种培养基以及不同质量浓度的激素，而B类培养液只添加激素，四类培养液均使用自来水做溶剂。

培养液的配制方法(以B类培养液为例)如下：(1)激素量取体积的计算方法：根据培养液体积(250mL)和激素的浓度计算，则2.0mg/L的激素需取相应的1mg/mL的激素母液500μL；0.5mg/L的激素需取相应的1mg/mL激素母液125μL；0.05mg/L的激素需取相应的1mg/mL激素母液12.5μL。(2)配制方法：用量筒量取250mL的自来水，转移到250mL的蓝盖瓶中；移液器量取相应体积与浓度的激素母液，转移至蓝盖瓶内；加盖，混匀，拧紧，贴标，室温保存待用。A、C、D三类培养液的配制方法可以采用本领域常规的方法进行调整。

所述A、B、C、D四类培养液的具体成分如表1所示。

表1绵毛金腰外植体的水培繁殖培养液配方

实施例2：绵毛金腰外植体的水培繁殖的方法

为了提高培养结果的严谨性，在培养过程中，实施例1中配制20种培养液，每种培养液设置6个重复，其中2个外植体放置于培养皿内培养，每个培养皿由一种培养液培养，以便于观察单个外植体的培养效果；其余4个外植体放置于一百格冷冻盒内培养，以便于观察整体培养效果以及对比不同培养液的培养效果。

绵毛金腰外植体的水培繁殖的具体方法如下：

1、外植体的选取

外植体的选取有几点注意事项：一是要有针对性、有目的的选取；二是要对植物的整体生长状态进行观察，将目标定在生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株上；三是要取植株幼嫩、大小适宜的部分作为实验材料，且附带叶片。简而言之，外植体选用带叶片的幼嫩茎段为宜。

2、外植体的处理

(1)外植体的采摘：绵毛金腰属匍匐生长型植物，与泥土浅接触的茎上的不定根浓密，埋在泥土以下稍深的匍匐茎较粗，因此应选取与泥土浅接触及以上的植物茎段作为备选外植体。采摘时间选择在早晨，早上9点为宜。采摘时两手轻轻将与泥土接触的茎托起，注意不定根要保持完好无损。然后左手托住植物，右手用刀片斜切，即得到所需茎段。

(2)外植体的清洗：在水培过程中，土壤会影响植物的生长，土壤附带的微生物也会侵染植物，造成病虫害，因此在培养前应尽可能地将植物清洗干净。然后将茎段置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓叶片、茎等部位，直至肉眼观察不到有泥沙颗粒为止。

(3)外植体的切割：外植体太大会容易被污染，外植体太小则不容易成活。外植体的切割以“保留1-3张叶片”为原则。每个外植体约2-3cm，切割点靠近节点处，斜切。

(4)外植体的修剪：切割后的外植体平放于吸水纸上，待外植体附带的水分稍微吸干后，用刀片修剪外植体叶片，将焦边、虫眼等坏的部分切除，修剪后再次清洗外植体，将修剪时留下的残渣清理掉，以免带来污染问题。

3.外植体培养方法

(1)培养前处理：首先将纱布剪成长5-10cm，宽1-2cm的条形，待用。然后，将冷冻盒以及培养皿做好标记，标记内容包括培养液种类、培养日期、培养外植体个数。

(2)外植体的培养：将外植体轻放进贴有相应标签培养容器内：一般将含直立茎的外植体用纱布包裹茎部以及叶柄后，放置于冷冻盒或培养皿内培养；最后，添加标签对应的实施例1中配制的培养液。

(3)培养条件：温度：12-15℃，光照时间12h，光照强度500-1000lx，湿度；每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿。

实施例3：不同培养液对整体培养效果的影响

在外植体的培养过程中，每天观察其生长状态，并拍照记录。通过图1-4所显示的结果可知，在A、C、D三类培养液中外植体生长状况不良，培养至第5天左右就出现叶片变蔫或焦边现象，随时间增长而面积扩大，直至外植体的叶柄变软。其中，A类培养液中的外植体的叶片在蔫后会出现叶片变红的现象。C、D两类培养液中的外植体同A，叶片从边缘开始变蔫且面积随时间增长而扩大，不同的是外植体叶片未出现变红现象且变蔫速度稍慢于A类培养液中的外植体，且A、C、D三类培养液6组重复实验结果相同。而B类培养液中的外植体一直生长良好，保持鲜嫩，且6组重复实验结果相同。对照实验中，外植体虽然能保持绿色，但并未生长。

通过对不同培养液的观察结果可知，B类培养液，即只添加激素，以自来水做溶剂(具体配方参见实施例1)，适用于绵毛金腰的外植体水培繁殖。

实施例4：不同B类培养液对绵毛金腰外植体的腋芽生成和生长的影响

为了探究哪种B类培养液更加适用于绵毛金腰外植体的腋芽生成和生长，进一步对B类培养液进行观察发现，如图5所示，B-3和B-5的外植体在培养过程中长出新的腋芽，且6组重复实验结果类似，其中B-3培养液培养的外植体腋芽在培养至第20天长度约0.3-0.5cm，第50天腋芽长度达1.0-1.5cm；B-5培养液培养的外植体在第20腋芽变化不大，第50天长度约0.6-1.0cm。而B-1、B-2、B-4三种培养液培养的外植体腋芽未生长。通过上述结果可知，B-3和B-5培养液，适用于绵毛金腰外植体腋芽的生成和生长。

实施例5：不同B类培养液对绵毛金腰外植体的不定根生成和生长的影响

为了探究哪种B类培养液更加适用于绵毛金腰外植体的不定根生成和生长，进一步对B类培养液进行观察发现，如图6所示，B-4、B-5两种培养液培养的外植体在培养至约30天在切口处生成新的不定根，并且6个实验重复长出不定根，生根率100％。通过上述结果可知，B-4和B-5培养液，适用于绵毛金腰外植体不定根的生成和生长。结合实施例4的结果可知，B-5培养液不仅能够促进绵毛金腰外植体的腋芽生成和生长，还能够促进不定根的生成和生长。综合各个因素认为，B-5(0.05mg/L IAA+自来水)培养液最适合于绵毛金腰外植体水培快繁。

实施例6B-5培养液中培养的外植体移栽室外的生长情况

绵毛金腰外植体在B-5培养液中，培养50天后，移栽室外，移栽方法如下：

1.基质的处理

移栽前1-2天准备好基质、孔穴盘，寻找合适的移栽圃地。以黑土和蛭石体积比1:1混合作为移栽基质，将黑土与蛭石充分混匀，大块黑土搅碎，基质颗粒均匀即可。提前一天用稀释1000倍的多菌灵水溶液(称取1g多菌灵粉末于1000ml自来水中配制而成)将基质和孔穴盘进行消毒，然后放置于太阳光下照晒，待用。

2.外植体的移栽

先将基质填充到孔穴内，填充体积大约为孔穴的4/5；自来水清洗一遍外植体，后将外植体轻放于孔穴内，使叶片向上；添加基质直至盖过匍匐茎，注意要使新长出的芽(由腋芽长大而成)暴露于基质表面；将基质压实使得植物不松动，然后浇透水；移栽后的植物放置于室外培养，为避免光线过强，应在圃地上方搭盖遮阳网。

3.移栽后管理

移栽后的植物依然容易缺水造成叶片焦边，因此每天早晚各进行一次喷水。另外，移栽后要实时注意观察，防止病虫害的发生，并要及时除杂，保证生长环境的卫生。

4.移栽后生长情况

从图7所示的结果可知，移栽2个月后长出新的芽，到第3个月，外植体已然长成一个新植株，6组重复实验获得的外植体，移栽室外均能成活，移栽成活率100％。

实施例7：以实施例6移栽成活绵毛金腰外的再次进行水培繁殖

以实施例6移栽成活绵毛金腰做外植体的取材材料，采用实施例2的外植体培养方法，在B-5培养液中培养50天后，移栽室外，移栽方法同实施例6，移栽成活，3个月后，外植体长成一个新植株。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种金腰属植物的水培繁殖培养液在促进金腰属植物外植体的腋芽生长中的用途，所述金腰属植物的水培繁殖培养液由IAA与水组成，所述IAA的浓度为0.5或0.05 mg/L，所述金腰属植物为绵毛金腰。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外植体为茎段。

3.一种绵毛金腰的水培繁殖的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

（1）.配制金腰属植物的水培繁殖培养液，所述培养液由IAA与水组成，所述IAA的浓度为0.5或0.05 mg/L；

（2）.外植体的选取，选择生长比较健壮、无病虫害、生长阶段适宜的植株，后取植株幼嫩、大小适宜的含有叶片的茎段部分作为外植体；

（3）.外植体的处理，采摘：左手托住植物，右手用刀片斜切，即得到所需茎段；清洗：取回来的茎段用手托住，然后轻轻抖动，慢慢拍打，使附带的泥土脱落；然后将茎段置于自来水流下，连续冲洗，并用手轻轻柔搓，直至肉眼观察不到茎段及其叶片上有泥沙颗粒为止；切割：绵毛金腰的每个外植体2-3cm，切割点靠近节点处，斜切，保留叶片；修剪后再次清洗茎段，将修剪时留下的残渣清理掉；

（4）.外植体的培养，将处理完的茎段置于步骤（1）配制完成的培养液之中，进行培养；培养条件：温度12-15℃，光照时间12 h，光照强度500-1000 lx，湿度：每三天更换一次培养液，每天两次喷水保湿；

（5）.外植体的移栽：茎段长出不定根和腋芽后，将其移栽到用多菌灵灭过菌的黑土+蛭石按照1:1的比例做基质的孔穴盘中；室外培养，水分保证充足。

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