JPH0774227B2

JPH0774227B2 - 新規抗酸化性配糖体、その製法及び用途

Info

Publication number: JPH0774227B2
Application number: JP3115714A
Authority: JP
Inventors: 精男三村; 恵一竹林; 義昌高原; 俊彦大澤
Original assignee: Kobe Steel Ltd
Current assignee: Kobe Steel Ltd
Priority date: 1991-02-27
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPH04273888A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物由来の有用物質に
関するものであり、更に詳細には、ごま（Ｓｅｓａｍｕ
ｍｉｎｄｉｃｕｍＬ．）の植物体より人工的に誘導
した細胞（カルス）の大量培養法によって、配糖体化合
物を工業的に大量に製造する技術に関するものである。

【０００２】本発明に係る配糖体は、従来未知の天然物
起源の新規化合物でありしかも強力な抗酸化活性を有す
るので、本発明は食品産業のほか、医薬品産業及び化粧
品産業等に広く応用されるものである。

【０００３】また、本発明に係る配糖体は、その化学構
造が明らかとなっているので、これを化学修飾したり変
形したりすることにより新規誘導体の開発が可能とな
り、新規な抗酸化性物質の出現も大いに期待することが
できる。そのうえ、化学合成による該配糖体の製造法の
開発も期待することが可能となるので、該配糖体を更に
工業的に大量に生産することも可能となり、これらの面
での本発明の利用性も顕著なものがある。

【０００４】

【従来の技術】我々人間を初め地球上の多くの生物にと
って、酸素は不可欠である。しかし、最近、生体内にお
ける過剰量の酸素はラジカルや過酸化脂質を生成し、そ
の結果各種組織が障害を受けることが問題となってい
る。この障害は動脈硬化、肝疾患、網膜症、炎症などの
病因となることが明らかになっており、さらに老化や発
癌との関連も示されている。

【０００５】脂質が過酸化される例として、生体の重要
な構成成分であると共に、必須脂肪酸として不可欠な食
品成分である多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、図１で
示される第１図に示すような自動酸化と呼ばれるラジカ
ル連鎖反応を引き起こし、過酸化脂質やマロンジアルデ
ヒド（ＭＤＡ）が初めとする酸化分解物を生成すること
が知られている（大澤・並木「現代の食品化学」三共出
版ｐ．１８６）。

【０００６】一方、このような脂質の酸化的劣化を防止
するために、食品系では冷凍保蔵や包装、脱酸素剤の使
用などの物理的手段と共に、抗酸化剤の添加という化学
的手段と共に、抗酸化剤の添加という化学的手段が一般
的である。特にＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）
やＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）を初めとする合
成抗酸化剤が長く使用されてきたが、最近に至って安全
性の面から食品への使用が再検討されつつある。

【０００７】そこで、その需要が急増してきたのは天然
ビタミンＥであるが、価格や効果の点から更に有効で安
全な天然抗酸化性物質の開発が要望されているのが現状
である。さらに、天然抗酸化性物質の積極的な摂取によ
り生体内のラジカル生成や脂質過酸化反応を抑制し、そ
の結果、老化や発癌を初めとするさまざまな疾患を防止
し得ると考えられている（大澤「食品の健全性と食品成
分の生理機構」缶詰技術研究会ｐ２）。

【０００８】こうした天然由来の抗酸化性物質や食品や
医薬品、化粧品などに適宜使用するためには、従来とは
性質の異なった天然抗酸化性物質を見出し、それぞれの
特徴を発揮する条件で活用することが重要である。

【０００９】天然系物質の内、例えば植物由来の香辛料
等には、抗酸化活性をもった種々の化合物が含まれてお
り（図２）、香辛料は食品保存作用を持つものとしても
食品に添加されてきた。しかしながら香辛料には、強い
香や色を示すものが多く、こうした性質はこれらを食
品、医薬品、化粧品などに応用する場合に使用範囲を大
幅に限定してしまう。

【００１０】実用例の代表としては、化学合成法による
ビタミンＣおよび天然物から抽出精製されているビタミ
ンＥが挙げられている。この内、ビタミンＣは水溶性の
物質であるため、油や生体内の脂質には溶けない。一
方、ビタミンＥは脂溶性であるため、血液などの水溶液
には溶けず生体内の脂質に蓄積される特徴が認められて
いる。こうした極端な水溶性や脂溶性の性質は、生体に
応用する食品、医薬品、化粧品などの場合、必ずしも有
利な性質とは考えられておらず、生体内の脂質と水溶液
のいずれにおいても適宜、抗酸化活性を発揮するために
は、水溶性と脂溶性の両方の性質をもつ天然化合物が有
利である。

【００１１】本発明は、このような天然植物の内、特に
ごまに着目し、黒ごま（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕ
ｍＬ．）の植物成体より誘導して得られた増殖性細胞
を培養し、その培養物から構造式（Ｉ）で示される配糖
体化合物を得、これらの化合物に強力な抗酸化活性を認
めたものであるが、構造式（Ｉ）で示される化合物は、
図３で示されるごまの種子から単離された代表的なリグ
ナン系化合物とは全く異なっており、新規化合物であ
る。

【００１２】さらに、ごま培養細胞より生成される本発
明に係る新規抗酸化配糖体は、カフェ酸をアグリコンと
し、六単糖をほぼ中心に配糖化した構造をとっているこ
とにより水溶性と脂溶性の中間的な極性を示すものであ
る。こうした性質は、さまざまな生理作用が期待される
抗酸化性物質の食品、医薬品、化粧品などへの応用に非
常に有利であり、他の抗酸化性物質には全く見当らな
い。

【００１３】また、本発明は、植物体自体から抽出する
ものではなく、抗酸化性配糖体を生産する培養細胞を用
いるものであって、ごま細胞を大量培養することにより
天然の抗酸化性配糖体を工業的に大量生産することに成
功したものであって、この点においても新規である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】化学工業の発展を背景
として、合成抗酸化剤、例えばブチルヒドロキシアニソ
ール（ＢＨＡ）やブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）
などが一般的に使用されてきた。ところが、こうした合
成抗酸化剤の使用が増えるにつれて、食品公害が増加し
て安全性の面から大きな問題が生じ、消費者の合成抗酸
化剤に対する拒否反応が強くなり、その使用量も低下し
ているのが現状である。

【００１５】したがって安全性の高い、天然由来の抗酸
化性物質は、生体内における抗酸化的な生体の防御機構
を支援する物質として、食品、特に機能性食品、健康食
品や栄養食品のほか、医薬品や化粧品の技術分野におい
て非常に期待されている。

【００１６】しかしながら、食品公害上問題のある合成
抗酸化剤に代って、その使用が期待されている天然の抗
酸化剤は、化学合成法によるビタミンＣおよび天然物か
ら抽出精製されているビタミンＥが実用化されているに
すぎない。

【００１７】また天然の抗酸化剤は、その起源が天候等
自然条件に左右される植物や動物等であって安定供給が
困難であり、また、その含有量も非常に微量であるた
め、抽出にも非常な困難が伴い且つ抽出中に成分が変化
するといった点から工業的に大量に抽出、製造すること
は困難であった。

【００１８】さらに香辛料等を起源とする抗酸化性物質
の中には強い香や色を持つものが多く、こうした性質は
食品、医薬品、化粧品などの使用を制限するものとなっ
ている。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明はこれらの欠点を
一挙に解決するためになされたものであって、各方面か
ら鋭意研究の結果、ごま（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃ
ｕｍＬ．）の植物成体から誘導した増殖性細胞（カル
ス）を合成培地を用いて培養し、得られた培養細胞か
ら、下記する化２で示される構造式（Ｉ）を有する新規
抗酸化性配糖体を大量に且つ計画的に工業生産すること
に成功し、本発明の完成に至ったものである。

【００２０】

【化２】

【００２１】ごま培養細胞から生成される本発明に係る
新規抗酸化性配糖体は、カフェ酸をアグリコンとし六単
糖をほぼ中心に配糖化した構造をとっており、水溶性と
脂溶性の中間的な極性を有する化合物であり、極端な極
性を有するビタミンＣやビタミンＥとは異り、その応用
範囲を広げるには非常に有利な物性を有している。した
がって、老化防止、発癌抑制などのさまざまな生理作用
が期待される抗酸化性物質の応用として、食品、医薬
品、化粧品などへも有効に利用される。

【００２２】また本発明は、このような生産効率が非常
に低い天然物からの有効成分の抽出という技術に鑑み、
目的物質を効率的、且つ計画的、安定的に大量生産する
方法を確立するためになされたものであって、生産効率
が低く、自然条件の影響を直接受ける植物体からの抽出
法を改善するために各方面から研究、検討した結果、バ
イオテクノロジーに着目し、細胞を人工培養する方法が
最適であるとの結論に達した。

【００２３】そこで、植物細胞の人工培養について徹底
的に研究を行い、このように有用な成分を含むごまの増
殖性細胞を育種するために、植物成体から人工的に増殖
性細胞塊（カルス）を誘導し、これより安定的にかつ迅
速に増殖する細胞を選択する研究を行ってきた。その結
果、ごまの種子から無菌的に発芽させたごま芽ばえを素
材として、ごま細胞のカルスを誘導し、安定に継代培養
が可能な高温度培養細胞を取得することに成功しただけ
でなく、増殖した細胞内に有用成分が含有されておりし
かもそれを有利に抽出できることをはじめて見出し、こ
れらの新知見を基礎にして更に研究の結果、有用成分の
精製及び構造決定にも成功し、ここに本発明が完成され
たのである。

【００２４】すなわち、本発明は、ごま培養細胞を、特
に植物細胞培養では他に報告例のない高温度（３３〜３
６℃）細胞培養法という全く新規な方法を確立すること
に成功したものであって、それにより新規なごま抗酸化
性配糖体を大量に且つ計画的に生産する工業的方法を提
供することができるのである。

【００２５】本発明者らは、こうした工業的な植物細胞
培養に適したごま培養細胞を育種する研究を鋭意おこな
った結果、従来、植物細胞培養の可能な温度とは考えら
れていなかったごとき高温度において、増殖性の高い細
胞を取得することに成功し、得られた培養細胞中には新
規な抗酸化性配糖体が生成されていることを見い出し本
発明を完成したのである。

【００２６】本発明の高温度で旺盛に増殖する培養細胞
の育種及び培養細胞より生成される新規抗酸化性配糖体
の抽出、精製及び構造決定について以下に述べる。

【００２７】先ず、ごまとしては、芽、根、又は種子を
用いる。そして、無菌条件下で芽ばえを調製し、芽、
茎、葉及び／又は根の切片を固体及び／又は液体の培地
で培養してカルス細胞を誘導する。得られた増殖性カル
スは、継代培養することにより大きなカルスを成長させ
る。次いでこれを固体及び／又は液体培養で、静置及び
／又は撹拌培養してカルス細胞を増殖せしめるのであ
る。

【００２８】培地としては、各種培地を使用することが
でき、炭素源としては、グルコース、フラクトース等の
単糖類、マルトース、シュークロース等の二糖類のほ
か、オリゴ糖や澱粉等の多糖類も使用することができ
る。窒素源としては、硝安、硝酸カリウムといった硝酸
態窒素、硫安、酒石酸アンモニウム等のアンモニア態窒
素のほか、カザミノ酸、アミノ酸、ペプトン、コーンス
ティープリカー、酵母菌体、イーストエキストラクト、
麦芽エキストラクト等が使用できる。

【００２９】そのほか、ニコチン酸、ニコチン酸アミ
ド、サイアミン、葉酸、ビオチン等のビタミン類；イノ
シトール、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミ
ジル酸、サイクリックＡＭＰ等の核酸関連物質；鉄、マ
ンガン、亜鉛、ホウ素、ヨウ素、カリウム、コバルト、
マグネシウム、モリブテン、リン、銅等のミネラルも使
用する。

【００３０】基本培地の１例を示すと、次の表１に示さ
れる第１表のとおりである。

【００３１】

【表１】

【００３２】基本培地にはオーキシン、サイトカイニン
を添加するのが好ましく、オーキシンとしては、インド
ール酢酸、インドール酪酸、フンタレン酢酸、２，４ジ
クロロフェノキシ酢酸などが適宜利用される。また、サ
イトカイニンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン
などが使用できる。これらの植物ホルモンやサイトカイ
ニンは単独でも使用できるが、組合せて用いることが効
果的である。増殖性のカルスの培養には、先の第１表に
示した組成の培地でもよいが、さらに増殖性を改善する
ためには、ココナツミルク、カゼイン加水分解物、ジャ
ガイモ抽出液、コーンスティープリカー、イーストエキ
ストラクト、麦芽抽出液などの天然有機栄養源を添加す
ることが有効である。培養温度は２８〜３７℃で培養操
作できるが、好ましくは３３〜３６℃である。培養液の
ｐＨは弱酸性（ｐＨ５．６〜６．０）が増殖に有利であ
る。

【００３３】このようにして得られたごまのカルス細胞
から高温度で安定に増殖できる細胞を育成するには、ジ
ェランガムまたは寒天による固体平板培地に細胞の小塊
を移植し、これを後記の増殖条件で１〜２週間培養を行
なう。このときの培養温度は３３〜３６℃に維持するこ
とが好ましい。

【００３４】さらに、多数の高密度培養細胞の培養系統
の中より、増殖性の高い培養系統を選択し、その細胞集
団から、更に細胞の小塊を多数取り出し、これらを新し
い培地に移植することによって、更に多数の培養系統を
作る。こうした細胞の培養系統の継代培養を５〜１０
回、３３〜３６℃の高温度で、くり返すことによって、
高温度で安定に増殖できる、ごま培養細胞を育成する。

【００３５】培養して得た増殖性細胞から抗酸化性物質
を抽出するには、セルラーゼやリゾチームを用いる生物
学的処理、化学的処理、機械的ないし超音波などの処
理、又はこれを組合わせたりして細胞を破壊し、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルムその他の有
機溶媒、水などの単独ないしは、これらの有機溶媒と水
との混合液で抽出して回収できる。

【００３６】抗酸化性物質の活性の分析は、リノール酸
を反応基質とする空気による自動酸化量をロダン鉄法に
よって測定する方法を用いる。この方法は、脂質の過酸
化を調べるのに用いられる常法である。（アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４５巻、７３５頁（１９８１
年））

【００３７】次に本発明により育種され、高温度培養が
できる、ごま培養細胞の取得について実験工程を追って
詳細に説明する。

【００３８】

【１．無菌的に生育したごま芽ばえの調製】ごま種子
を、よく水洗したのち、７５％エタノール水溶液に数秒
間浸漬する。これを別に用意した殺菌水で洗浄し、つい
で０．１％ベンザルコニウムクロライド（市販殺菌剤）
液に２〜５分間浸漬して種子に付着している微生物を殺
菌する。この種子を再び殺菌水でよく洗浄したのち、１
％次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬製）（０．１％の界
面活性剤ツイーン２０を含む）の殺菌剤液によって、３
０分間処理して、ごま種子を完全に殺菌する。

【００３９】いっぽう、殺菌した、ふた付きの広口容器
（プラスチック製市販品）を用意する。これに前記第１
表に示した組成の基本培地（ただし蔗糖は添加せず、固
化剤として寒天の場合０．８〜１．５％、ジュランガム
の場合０．２〜０．３％を添加した）を別途オートクレ
ーブ殺菌したものを、広口容器に注いで固化させ播種用
の固型培地とする。また、殺菌水と殺菌したガーゼを、
広口容器に無菌的に入れて、播種用の床としてもよい。
このような播種用の培地又は床に、殺菌処理をしたごま
種子を無菌操作によって播種する。２８〜３０℃の恒温
室で蛍光灯の光のもとで保温すると、殺菌処理したごま
種子は死滅することなしに、発芽し、１０日間程度で長
さ３〜５ｃｍのごま芽ばえが調製できる。このごま芽ば
えは、完全に無菌状態であり、増殖性細胞の育種に利用
される。

【００４０】

【２．ごま由来の増殖性細胞塊の誘導培養】前記第１表
に示した組成の基本培地に、オーキシンとして、ナフタ
レン酢酸（１０^−８〜１０^−５Ｍ）、あるいは、２，４
ジクロロフェノキシ酢酸（１０^−８〜１０^−５Ｍ）、サ
イトカイニンとして、ベンジルアデニン（１０^−６〜１
０^−４Ｍ）、あるいはカイネチン（１０^−６〜１０^−４
Ｍ）を組合せて添加した、各種組成の培地を調合する。
これに、固化剤としてジェランガム０．２％または寒天
０．８％を加えて、ｐＨを５．７に調整したのち、微生
物培養に常用されるペトリディッシュに分注して固化す
る。これに、先に述べたように無菌的に調製したごまの
芽ばえの断片を移植し、温度２８〜３０℃の恒温室又は
恒温箱の中で、暗所で培養を行なうと、培養２〜３週間
後には、ごま芽ばえの切断片の切り口より、細胞が増殖
し、塊となってカルスを形成する。この増殖性のカルス
を、同一組成の培地に継代培養することによって、大き
なカルスを育てることができる。

【００４１】カルスの人工的な誘導に用いる基本培地は
第１表に示した培地組成（ムラシゲースクーグの培地）
を用いたが、植物の細胞培養に通常用いられている培地
ならいずれも使用できる。こうした培地の基本組成は、
当業界においてよく知られている（植物細胞培養マニュ
アル、講談社（１９８４））

【００４２】

【３．カルス細胞の増殖培養細胞の育成】ごまの芽ばえ
より誘導した増殖性細胞塊（カルス）は、第１表に示し
た組成の培地、ナフタレン酢酸（１〜５×１０
^−５Ｍ）、ベンジルアデニン（１〜５×１０^−５Ｍ）、
などのオーキシンやサイトカイニンを添加したものに、
更に固化剤としてジュランガム０．２％又は寒天０．８
％を加えて滅菌、固化した培地を用いて、安定に増殖す
る細胞を育成する。

【００４３】ごま細胞は暗所でもよく増殖するが、明所
の方が、更に増殖に活発である。したがって３，０００
〜３０，０００ルクス、好ましくは８，０００〜１５，
０００ルクスの明所においてよく増殖することが観察さ
れる。温度は、３０〜３７℃でも増殖するが、好ましく
は、３３〜３６℃で培養することができる。

【００４４】ごまのカルスから高温度で安定に増殖でき
る細胞を育成するには、ジュランガム又は寒天による固
体平板培地に細胞の小塊を移植し、これを前記の増殖条
件で１〜２週間培養を行なう。

【００４５】このときの培養温度はカルス細胞の誘導培
養に用いた温度よりも高温度にする。すなわち培養温度
を３３〜３６℃に維持して、旺盛に増殖する細胞を濃縮
することができる。

【００４６】このようにして得た多数の培養系統の中よ
り、増殖性の旺盛な培養系統を選択し、その細胞集団か
ら、更に細胞の小塊を多数取り出し、これらを新しい培
地に移植することによって、再び多数の培養系統を調製
する。こうした細胞の培養系統の継代培養を５〜１０回
くり返すことによって、３３〜３６℃の高温度で安定に
増殖できる。ごま細胞を育成する。

【００４７】

【４．増殖性細胞の培養】安定に継代培養が可能なごま
細胞の増殖培養には、第１表に示した組成の培地が用い
られるが、植物細胞の培養に通常よく用いられている組
成の培地も利用できる。このような基本培地に、オーキ
シンとして、ナフタレン酢酸（１〜５×１０^−５Ｍ）、
サイトカイニンとして、ベンジルアデニン（１〜５×１
０^−５Ｍ）を加えたものを調合する。液体培養の場合に
はそのまま増殖培養に使用できるが、固体培地での培養
の時には、これにジュランガム０．２％又は寒天０．８
％を加えて、滅菌、固化させて使用する。細胞の増殖に
は光を照射するのが有利である。通常３，０００〜３
０，０００ルクス、好ましくは８，０００〜１５，００
０ルクスの照射であればよい。温度は２８〜３７℃で増
殖するが好ましくは３３〜３６℃でよく増殖培養ができ
る。液体培養は、通常の微生物の培養に用いられる振と
う培養法や通気撹拌培養法が適用できるが、微生物の培
養に比較して、ゆるやかな条件で操作するのが好まし
い。微生物の培養に比較して、酸素の必要量は著しく少
なくてよいから、わずかに空気を通気しつつ、細胞が培
養液の底に沈でんしない程度の撹拌を行うことが増殖に
好ましい。

【００４８】増殖培養を更に効果的に行なうためには、
培養液のｐＨを５．６〜５．８に維持するのがよい。

【００４９】通常の増殖培養では、１〜２週間で培養が
終了するから、培養液から細胞を遠心分離法などの常法
で回収することが可能である。また固体培養の場合に
は、増殖した細胞塊は容易に回収できる。

【００５０】かくして、工業的な規模で、生産が可能な
ごま細胞の育成を行い、これを多量に増殖培養すること
が出来るのである。

【００５１】このような操作によって取得された高温度
培養が出来るごま培養細胞の増殖量と培養温度との関係
を図４に示す。植物細胞を通常培養する時に用いられて
いる２５〜２８℃の温度における増殖量に比べて、３５
〜３６℃では、約２倍以上の増殖量を示しており増殖速
度も早くなることから工業的な植物細胞の培養におい
て、有効に使用できるものである。

【００５２】

【５．抗酸化性物質の抽出及び分析】上記によって得た
増殖性のカルス細胞を、ブレンダー等で細かく破砕した
のち、石英砂と共に磨砕する。これをメタノールなどの
溶媒で抽出し、無水硫酸ナトリウムによって脱水し、３
０〜３５℃で蒸発乾固する。再びメタノールに溶解させ
て、抗酸化性物質を含んだ分画を得る。

【００５３】次に抗酸化活性の分析法について述べる。
リノール酸を反応基質とする方法であり、油脂の酸化の
程度を測定するためによく用いられているロダン鉄法を
利用するものである。即ち油脂の自動酸化により生成す
る過酸化物によって二価鉄イオンが三価鉄イオンに酸化
され、これがチオシアン酸アンモニウムと反応し赤色の
ロダン鉄を生成させ、その吸光度を測定することから、
油脂の過酸化物の量を求める方法である。（アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー）
（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４５巻、７３５頁（１
９８１年））

【００５４】また、ロダン鉄法に比較してより生体系に
近い分析法として兎赤血球膜脂質の過酸化反応を利用し
た、いわゆる赤血球ゴースト法も併せて使用した。

【００５５】兎の赤血球から、その膜のみを調製し、こ
れを赤血球ゴーストと呼ぶ。

【００５６】この赤血球ゴーストに、酸化の開始剤とし
て、ｔ−ブチルハイドロキシパーオキサイドを加えて、
赤血球膜のリン脂質の過酸化反応を促進させたのち、生
成するマロンジアルデヒドあるいは、これに類似した物
質を、チオバルビツール酸で発色させ、その吸光度を測
定するのである。（バイオケミストリー、７８巻、６８
５８頁（１９８１年））

【００５７】反応系に添加されるサンプル中の抗酸化活
性の程度によって、チオバルビツール酸による発色度が
変化するから、抗酸化性物質を含まない対照区と比較す
ることによって、サンプル中に含まれている抗酸化活性
を測定することができる。

【００５８】

【６．新規抗酸化性配糖体の抽出、分離及び構造解析】
液体培養法によって増殖した細胞は、重力分離法や遠心
分離法によって容易に回収することができる。得られた
細胞を最終濃度が８０％になるようにエチルアルコール
を添加し、機械撹拌ホモジナイザーによって抽出する。
遠心分離して抽出液を回収した残りの細胞について再び
８０％エチルアルコールで抽出する。得られた抽出液を
減圧下で濃縮して乾固すればアメ状、黄褐色の抗酸化性
物質の粗抽出物が得られる。

【００５９】これを、たとえばアンバーライトＸＡＤ−
ＩＩを用いる吸着クロマトグラフ法によって、樹脂に吸
着させ、水とメタノールの混合溶媒によって溶出し、抗
酸化活性のある画分を取得する。メタノール６０％水溶
液により溶出する分画を集め、これを減圧濃縮すること
により、ごま培養細胞中に含まれている抗酸化性物質の
代表的な成分を得る。

【００６０】天然物化学の技術分野で、通常用いられて
いる高速クロマトグラフ法により、含有成分の分離分析
を行うことによって、目的成分の精製程度を検定する。
ごま培養細胞のアルコール抽出物の吸着クロマトグラフ
法により６０％メタノール水溶液で溶出したフラクショ
ンの高速液体クロマトグラフのチャート図を図５に示
す。

【００６１】多数のピークの中より、強い抗酸化活性を
もつピークを更に精製する。この時、天然物の精製法と
して通常用いられている、高速液体クロマトグラフ法
を、くり返し使用して、順次目的物質を純化する。図６
に、高速液体クロマトグラフ法により精製した抗酸化性
物質の単一性を示す。

【００６２】単一な成分として単離された抗酸化性物質
について機器分析を行い、その化学構造を以下のように
決定した。

【００６３】先ず、単離された抗酸化性物質の紫外線吸
収スペクトラムを、図７に示す。得られた紫外線吸収ス
ペクトラムは、いずれも、カフェ酸系化合物の特徴とよ
く符号していた。

【００６４】次に高速電子衝突質量分析法（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）により解析し、図８に示すようなマススペクトラム
を得た。これより、分子イオンピーク（Ｍ−１）⁻は６
６７であり、抗酸化性物質の分子量は６６８と判明し
た。またプロトン核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により、二置
換ｔ−オレフィン、２つの芳香族環の存在と置換様式が
解明された（図９）。

【００６５】精製した抗酸化性物質は、糖の呈色反応に
より糖分子が結合した配糖体であることが判っていた
が、その構造を決定するために炭素１３核磁気共鳴法に
より構造の解析を行った。そのスペクトラムを図１０に
示す。

【００６６】こうした天然物の構造解析法を駆使して、
ごま培養細胞由来の抗酸化性物質の構造を下記の化３で
示される構造式（Ｉ）と決定した。

【００６７】

【化３】

【００６８】

【７．新規抗酸化性配糖体の抗酸化活性】ごま培養細胞
から８０％エタノールで抽出して得た粗抽出物、これを
アンバーライトＸＡＤ−ＩＩによる吸着クロマトグラフ
法により６０％メタノール水溶液で溶出して得た中間精
製物、さらに、中間精製物を高速液体クロマトグラフ法
により単一ピークまで精製した抗酸化性配糖体は、前述
の兎赤血球ゴースト法により、抗酸化活性を測定した結
果を図１１にそれぞれ示した。横軸は分析における反応
系に添加したサンプルの濃度をとり、縦軸に、チオバル
ビツール酸による発色度を、抗酸化性物質を無添加の対
照区を１００％として相対比率で示した。市販されてい
る合成抗酸化剤ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）
を抗酸化剤の対照区に用いて比較したものである。

【００６９】このように、ごの培養細胞から抽出して得
た抗酸化性配糖体は、ＢＨＡにほぼ相当する抗酸化活性
をもっていることがわかった。

【００７０】抗酸化剤として工業的に抗酸化性配糖体を
応用する時には、目的に応じて精製品や粗製品を使用す
ることが便利である。

【００７１】このことは図１１に示したように、純品に
まで精製した標品と、吸着クロマトグラフ法によって得
られた中間精製品の抗酸化活性に大きな差はなく、厳密
に考えると中間精製品に含まれている、単離した抗酸化
性配糖体以外の成分にも抗酸化活性が認められたり、ま
た、共存物質による抗酸化活性の促進作用（相乗作用）
が考えられる。こうしたことは、粗製品でも使用できる
ことを充分に示唆するものである。

【００７２】したがって本発明に係る抗酸化剤は、構造
式（Ｉ）で示される化合物を有効成分として含有するも
のがすべて包含されるものであり、ごま培養細胞から抽
出して得られる精製品はもとより、それまでに至る各段
階によって得られる半精製品、粗製品をすべて包含する
ものである。

【００７３】本発明に係る化合物は、配糖体であるが、
配糖体の構造をもっていることは、水溶性と脂溶性の双
方の特性を示すことが特徴として考えられ、したがって
本発明化合物は、水溶性のビタミンＣ、脂溶性のビタミ
ンＥやブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル
ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などに比較して、抗酸化
剤としての使用範囲が拡大され、また生体内での作用に
おいても、有利性が大いに期待される。

【００７４】以下に実施例及び試験例をもって本発明を
説明するが、これらは例示であって、本発明を制限する
ものではない。

【００７５】なお、本発明に使用する各細胞は、通常の
ごま植物を用い、前記した手法及び後記する実施例の手
法にしたがってごま成体細胞をそれぞれ処理すれば容易
に取得することができ、充分に再現性があることが確認
された。原料の入手にも何の困難性もなくその処理にも
格別の困難は無いので、本発明に使用する細胞は、何人
も容易に入手することができるのである。

【００７６】

【実施例１】（１）ごま（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃ
ｕｍＬ．）の種子を用意し、これを７５％エタノール
液に数秒間浸漬したのち、殺菌した蒸留水で２回水洗し
た。これを０．１％ベンザルコニウムクロライド塩（甘
槽化学産業（株）製）に２分間浸漬した。殺菌した蒸留
水で３回よく洗浄したのち、１％次亜塩素酸ナトリウム
（和光純薬）、０．１％ツイーン２０（和光純薬）を含
む殺菌剤液に３０分間浸漬し、殺菌水で水洗して殺菌ご
ま種子を調製した。

【００７７】植物培養用のプラスチック製容器（フロー
・ラボラトリー社製）に殺菌水と殺菌したガーゼを入
れ、その上に、予め殺菌したごま種子を播種した。３０
℃の恒温室で２０ワットの蛍光灯の光のもとで２週間放
置したところ、長さ５〜７ｃｍのごま芽ばえが得られ
た。

【００７８】（２）第１表に示した組成の培地２１を調
製し、これを等分し、それぞれの１００ｍｌに、ジュラ
ンガム（三栄化学工業製）０．２％と、表２に示した実
験条件のサイトカイニン、オーキシンを添加して、増殖
性細胞塊（カルス）の誘導培地とした。これらを常法に
したがい１２０℃、１０分間のオートクレーブ殺菌処理
をした。

【００７９】これらの培地を、温かいうちに、直径１０
ｃｍのプラスチック製ペトリディッシュにそれぞれ３枚
宛３０ｍｌづつ分注し、室温で固化させた。

【００８０】これに（１）で調製した、ごま芽ばえを無
菌操作によって、茎、葉を５〜７ｍｍの切片に切断し
て、ペトリディッシュの固型培地上に移植した。水分の
蒸発を防止するためパラフィルム（アメリカン・カン社
製）で封をし、２８〜３０℃の恒温室に暗所で３週間放
置してごま芽ばえ切片からのカルスの誘導を行ない、表
２で示される第２表の結果を得た。

【００８１】

【表２】

【００８２】（３）第１表の組成の基本培地に、ジュラ
ンガム０．２％、ナフタレン酢酸５×１０^−５Ｍ、ベン
ジルアデニン１×１０^−５Ｍを添加した培地６００ｍｌ
を、（１）と同様にして殺菌調製した。これをプラスチ
ック製ペトリディッシュ２０枚にそれぞれ３０ｍｌ宛分
注して固化させた。（１）で誘導培養して得た増殖性カ
ルスを、ペトリデッィシュ当り４ケ宛移植した。３３〜
３６℃、１２，０００ルクスの光の植物細胞培養装置の
中で、２週間培養を行った。増殖性の良好な細胞集塊を
選抜し、これを種細胞として、３３〜３６℃で継代培養
を４回くり返した。かくして、高温度で安定に増殖する
培養細胞を育成した。この細胞をＮ_５Ｂ_５Ｓ−ＨＴ（ナ
フタレン酢酸５×１０^−５Ｍ、ベンジルアデニン１×１
０^−５Ｍで継代培養したごま培養細胞）と命名した。

【００８３】（４）第１表の組成の基本培地にジュラン
ガム０．２％、ナフタレン酢酸５×１０^−５Ｍ、ベンジ
ルアデニン１×１０^−５Ｍを添加した培地１１を、
（１）と同様にして殺菌調製した。これを直径４ｃｍ、
深さ１３ｃｍの植物細胞培養用のガラス製容器に４０ｍ
ｌ宛分注して固化させた。（３）で継代培養して育成し
てごまの増殖性細胞Ｎ_５Ｂ_５Ｓ−ＨＴ細胞の５〜７ｍｍ
角を移植して３５〜３６℃、１２，０００ルクスの光の
植物細胞培養装置の中で１０日間培養を行った。その結
果、培養容器中に増殖した細胞の生重量は平均１４．５
ｇであった。

【００８４】この細胞のうち６０ｇを乳ばちに取り、６
ｇの石英砂を加えて５分間磨砕したのち８０％エタノー
ル水溶液２００ｍｌを加えてよく撹拌し抗酸化性物質を
抽出した。これを遠心分離（２，５００回転／分、１０
分間）して上澄液を集め、細胞残渣には再び２００ｍｌ
の８０％エタノール水溶液を加えて抽出した。３回のエ
タノール水溶液による抽出液を集め４０℃でロータリエ
バポレーターにて蒸発乾固し、黄褐色の抽出物４．８ｇ
を取得した。

【００８５】

【実施例２】第１表に示した組成の培地３１を、通気攪
拌装置を備えた５１容量の植物細胞培養槽に入れ、オー
トクレーブによって、１２０℃、２分間加圧殺菌した。
別の３００ｍｌ三角フラスコに第１表に示した組成の培
地６０ｍｌを入れ、同様に殺菌したものに、ごま培養細
胞のシードを添加し、３５℃、蛍光灯の光照射下で、振
とう数６０往復／分の条件で振とう培養した。７日間培
養したフラスコ５本分の培養細胞を無菌操作によって回
収し、植物細胞培養槽に接種した。植物細胞培養槽の培
養条件は、撹拌数３０回転／分、ｐＨ５．７±０．１、
通気量１．５１／分、光照射８，０００ルクス、温度３
５℃で１０日間培養した。培養終了液を遠心分離して、
細胞を回収したところ、乾燥重量として３９ｇが取得さ
れた。

【００８６】培養して得られたごま細胞を生重量として
５００ｇを用いて抗酸化性物質の抽出精製を行った。す
なわち１．９ｌのエタノールを加えて、ホモジナイザー
により撹拌しつつ２０分間抽出したのち、濾過器によっ
て細胞と抽出液を分離した。細胞残渣に２１の８０％エ
タノール水を加え、同様に抽出操作を２０分間行ったの
ち濾過器によって細胞残渣を分離し、更に２１の８０％
エタノールで抽出した。

【００８７】抽出液を合せて、４０℃で減圧濃縮を行い
褐色の粗抽出物１２．８ｇが取得された。

【００８８】吸着クロマトグラフ法を用いるアンバーラ
イトＸＡＤ−ＩＩ樹脂を直径５ｃｍ、長さ４０ｃｍのガ
ラス製カラムに充填して、水を流して平衡化した。これ
に抽出物５ｇをカラムの上部に樹脂に吸着させた状態で
重層し、水から順次メタノール濃度を増加させる段階溶
出法によって、目的物質の溶出を行った。６０％メタノ
ールで溶出される分画を集め、４０℃で減圧濃縮したと
ころ、黄褐色の中間精製物の１８４ｍｇが得られた。こ
れを高速液体クロマトグラフ法を繰返して、単一ピーク
になるまで精製を行った結果、精製物として抗酸化性配
糖体が１８ｍｇ得られ、その化学構造を構造式（Ｉ）で
示されるものであることを確認した。

【００８９】実施例で得られた、この粗成分、中間精製
物、および精製物について、それらの抗酸化活性を兎赤
血球ゴースト法により測定したところ、図１１に示すよ
うに、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）とほぼ同
程度の強い抗酸化活性が認められた。

【００９０】

【試験例１】本発明によって調製した抗酸化性配糖体の
すぐれた抗酸化効果を次のようにして確認した。

【００９１】実施例によって得た抽出物１００ｍｇを１
００ｍｌの８０％エタノール水溶液に溶かし（１ｍｇ／
１ｍｌ濃度）、抗酸化性物質の分析サンプルとした。こ
れの１ｍｌをサンプルとしてリノール酸の自動酸化の抑
制の程度をロダン鉄法によって測定した。その結果、図
１２からも明らかなように、ごま増殖細胞から抽出した
画分（１ｍｇ）には、α−トコフェロール（０．２ｍ
ｇ）あるいは、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ、
０．２ｍｇ）に相当する高い活性の抗酸化性物質が含ま
れていることが確認された。

【００９２】

【発明の効果】本発明は、高温度増殖性ごま細胞を培養
容器の中で多量に調製し、それによって、ごま細胞中に
含まれている新規抗酸化性配糖体を工業的に大量に生産
することを可能としたものである。したがって本発明の
方法によれば、栽培によらず工業的な手段によって、安
全な食品、医薬品、化粧品として使用される天然物由来
の新規抗酸化性配糖体を計画的に且つ大量に供給するこ
とができるという著効が奏されるのである。

【００９３】また本発明によって新規抗酸化性配糖体の
化学構造が解明されたので、これを化学的に修飾、変形
することにより更に新規化合物の創製、新規抗酸化性物
質の開発が可能となる。そして更に、化学合成法による
本化合物の製造法の確立も期待され、抽出法よりも更に
工業的に本化合物を大量生産することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の自動酸化機構
を図示したものである。

【図２】フェノール性抗酸化性物質の構造を図示したも
のである。

【図３】ごまから単離された抗酸化性物質の構造を図示
したものである。

【図４】高温度培養細胞の増殖量と培養温度との関係を
示すグラフである。

【図５】吸着クロマトグラフ法で溶出した中間精製品の
液体クロマトグラフ法による含有成分の組成を示す図面
である。

【図６】液体クロマトグラフ法により精製した抗酸化性
物質のクロマトグラムである。

【図７】精製した抗酸化性物質の紫外線吸収スペクトラ
ムである。

【図８】精製した抗酸化性物質の高速電子衝突マススペ
クトルによる解析図である。

【図９】精製した抗酸化性物質のプロトン核磁気共鳴法
によるスペクトラムである。

【図１０】精製した抗酸化性物質の炭素１３核磁気共鳴
法によるスペクトラムである。

【図１１】兎赤血球ゴースト法によるごま培養細胞から
の粗抽出物、中間精製物、精製物の抗酸化活性を示した
ものである。 ▲：粗抽出物 ●：中間精製物 ◆：精製物 ○：ブチル・ヒドロキシ・アニソール（ＢＨＡ）

【図１２】リノール酸を反応基質とした自動酸化の経過
をロダン鉄法により分析した、リノール酸の酸化曲線で
ある。 −●−：対照区 −○−：α−トコフェロール区 −−△−−：ブチルヒドロキシアニソール区 −◎−：ごま細胞よりの粗抽出物

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 7/00 Ｆ 47/26 ＫＣ１２Ｎ 5/04 (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の【化１】で示される構造式（Ｉ）を有する配糖体。【化１】
【請求項２】ごま（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ
Ｌ．）の植物成体から誘導した増殖性細胞を培地に培
養し、その培養物から、構造式（Ｉ）を有する配糖体を
製造する方法。
【請求項３】ごま（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ
Ｌ．）の植物成体から誘導した高温度培養細胞を培地
に培養し、その培養物から構造式（Ｉ）を有する配糖体
を製造する方法。
【請求項４】構造式（Ｉ）で示される配糖体を有効成
分とする抗酸化剤。