JPS63207389A

JPS63207389A - 培養細胞によるリグナン化合物の製造法

Info

Publication number: JPS63207389A
Application number: JP62040096A
Authority: JP
Inventors: Morio Mimura; 三村　精男; Yoshimasa Takahara; 高原　義昌; Akira Ichikawa; 明市川; Toshihiko Osawa; 俊彦大澤
Original assignee: Kobe Steel Ltd
Current assignee: Kobe Steel Ltd
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1987-02-25
Publication date: 1988-08-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、植物の細胞を培地に培養することによって産
業的に有用な物質を工業生産する方法に関するものであ
り、詳しくは、ごま（Ｓｅｓａｍｕｒａｉｎｄｉｃｕｍ
　Ｌ、、）の植物体より人工的に誘導した細胞塊（カル
ス）の培養により（＋）セサミン、（÷）セサモリン等
のリグナン化合物を工業的に大量に製造する方法に関す
るものである。

（従来の技術）植物は、生体の形成に必須な蛋白質、核酸、多糖体、リ
グニン化合物などの一次代謝産物のほかに、アルカロイ
ド、フラボノイド、ステロイド、フェノール化合物１色
索類、酵素類などの二次代謝産物を生成している。これ
らの代謝産物の中には、医薬品１食品、化粧品などに利
用されているものが数多く含まれている。

これらの代謝産物の１つであるリグナン化合物は、レジ
ノールまたは樹脂アルコールとも称され、植物に含まれ
るリグニンの生合成あるいは分解過程における代謝生産
物と考えられる物質であって、２００種以上もの種類が
あることが知られており、植物体中に広く分布している
ものである（「化学大辞典９」共立出版、　Ｐ５８８）
。

そして、リグナン化合物は、たとえば、抗腫瘍性、細胞
分裂阻害作用、核酸への作用、抗ウィルス作用、酵素活
性阻害作用、抗炎症作用、抗酸化作用などの有用な生理
活性を数多く有していることが知られており（ファイト
ケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ）第２３
巻、１，２０７頁（１９８４年）。

アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４９巻、３０１頁
（１９１１１５年））、医薬、化粧品、栄養食品等各種
の用途に広く利用できるものである。

しかしながら、これらリグナン化合物の製造は、植物体
から抽出する方法が専ら行われており、例えばごま種子
から抽出する方法が知られているにすぎない（Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　４９．　ｐ３０１（１９８５））。

本発明は、このように植物体から抽出するのではなく、
カルスを人工培養し、培養細胞からリグナン化合物の内
、特にセサミン及びセサモリンを工業的に大量に得る方
法に関するものであるが。

このようなことは従来全く知られておらず新規である。

（発明が解決しようとする問題点）このように農業的手段によって植物体を栽培生産し、こ
れより有用な成分を抽出することは、一部の食品などの
特定の分野では有利ではあろうが。

こうした植物由来の有用物質の供給は栽培による農業的
手段のため、生産効率も限界があり、多量生産には広い
農地を必要とし、栽培も天候の影響を受けやすいため、
工業原料としての安定的な供給には多くの困難がともな
っており、特定の有用成分を一定量、計画的に生産する
ことは困難があるなどの問題点があり、新しい技術の開
発が望まれていたのである。

セサミン、セサモリン等のリグナン化合物についても同
様である。つまり、これらのリグナン化合物は、ゴマ種
子、ゴマ油から抽出されるものであり、ゴマ植物体を供
給源としているからである。

そして更に、ゴマは、最近、栽培面積が減少しており、
工業原料としての安定供給の面で大きな問題となってき
ている。

（問題点を解決するための手段）本発明は、これらの欠点を一挙に解決するためになされ
たものである。

つまり、このように天然の条件を直接受ける植物体を原
料とし、また生産効率も非常に低い天然物からの抽出法
を改善するために、各方面から研究、検討した結果、人
工培養による方法が最適であるとの結論に達した。

そこで１人工培養について徹底的に、研究を行い、植物
体から人工的に誘導した増殖性細胞塊（カルス）に着目
し、これを培養することによって有用な物質を生産する
技術の研究を行ってきた。

その過程で、多くの種類の植物体から誘導したカルス細
胞に含まれる生産物について調査した結果、ごま（Ｓｅ
ｓａｍｕｍ　１ｎｄｉｃｕｎ＋　Ｌ、）の植物体から誘
導培養して得た細胞中に著量の（＋）セサミン、（＋）
セサモリンなどのリグナン化合物が蓄積されることを見
い出すことに成功し、本発明を完成したのである。

本発明を実施するには、先ず、次のようにしてゴマ由来
の増殖性細胞を作成する必要がある。

ゴマとしては、芽、根、又は種子を用いる。そして、無
菌条件下で芽ばえを調製し、芽、茎、葉及び／又は根の
切片を固体及び／又は液体の培地で培養してカルス細胞
を誘導する。得られた増殖性カルスは、継代培養するこ
とにより大きなカルスに成長させる。次いでこれを固体
及び／又は液体培地で、静置及び／又は攪拌培養してカ
ルス細胞を増殖せしめるのである。

培地としては、各種培地を使用することができ、炭素源
としては、グルコース、フラクトース等の単ｔｊＮ類、
マルトース、シュークロース等の二糖類のほか、オリゴ
糖や澱粉等の多糖類も使用することができる。窒素源と
しては、硝安、硝酸カリウムといった硝酸態窒素、硫安
、酒石酸アンモニウム等のアンモニウム態窒素のほか、
カザミノ酸、アミノ酸、ペプトン、コーンステイープリ
カー、酵母菌体、イーストエキストラクト、麦芽エキス
トラクト等が使用できる。

そのほか、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、サイアミン
、葉酸、ビオチン等のビタミン類；イノシトール、アデ
ニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、サイク
リックＡＭＰ等の核酸関連物質；鉄、マンガン、亜鉛、
ホウ素、ヨウ素、カリウム、コバルト、マグネシウム、
モリブデン、リン、銅等のミネラルも使用する。

基本培地の１例を示すと、次の表１のとおりである。

表１硝酸アンモニウム　　　　　　　　　　１，６５０ｍｇ
硝酸カリウム　　　　　　　　　　　　１　、９００塩
化カルシウム　　　　　　　　　　　　４４０硫酸マグ
ネシウム　　　　　　　　　　　３７０リン酸第１カリ
ウム　　　　　　　　　　　１７０ホウ酸　　　　　　
　　　　　　　　　６．２硫酸マンガン　　　　　　　
　　　　　　　２２．３硫酸亜鉛　　　　　　　　　　
　　　　　　８．６ヨーソカリウム　　　　　　　　　
　　　　　０．８３モリブデン酸ナトリウム　　　　　
　　　　０．２５塩化コバルト　　　　　　　　　　　
　　　０．０２５硫酸鋼　　　　　　　　　　　　　　
　　０．０２５エチレンジアミン４酢酸ナトリウム　　
　３７．３硫酸第１鉄　　　　　　　　　　　　　　２
７．８ミオイノシトール　　　　　　　　　　　１００
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　２塩酸ピリ
ドキシン　　　　　　　　　　　　０．５ニコチン酸　
　　　　　　　　　　　　　　０．５塩酸チアミン　　
　　　　　　　　　　　　０．１蔗糖　　　　　　　　
３０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．００
０ｍｆｌｐＨ５，７基本培地にはオーキシン、サイトカイニンを添加するの
が好ましく、オーキシンとしては、インドール酢酸、イ
ンドール酪酸、ナフタレン酢酸。

２．４ジクロロフエノキシ酢酸などが適宜利用される。

また、サイトカイニンとしては、ベンジルアデニン、カ
イネチンなどが使用できる。　これらの植物ホルモンや
サイトカイニンは単独でも使用できるが１組合せて用い
ることが効果的である。

増殖性のカルスの培養には、表１に示した組成の培地で
もよいが、さらに増殖性を改善するためには、ココナツ
ミルク、カゼイン加水分解物、ジャガイモ抽出液、コー
ンステイープリカー、酵母抽出液、麦芽抽出液などの天
然有機栄養源計添加することが有効である。培養温度は
２０〜３７℃で培養操作できるが、好ましくは２５〜３
５℃である。培養液のＰＨは弱酸性（ｐＨ５，６〜６．
０）が増殖に有利である。

培養して得たカルス細胞から、リグナン化合物を抽出す
るには、セルラーゼやリゾチーム等を用いる酵素処理、
機械的ないしは超音波などの処理、又はこれを組合わせ
たりして細胞を破壊し、次いでメタノール、エタノール
、アセトンなどの溶媒で抽出して回収できる。抽出液か
らのリグナン化合物の精製は、通常の天然有機化学の研
究で常時用いられる手段、例えば、シリカゲルクロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭吸
着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーな
どの組合せにより行うことができる。

次に本発明の方法を工程を追って詳細に説明する。

１、無菌的に生育したごま芽ばえの調製。

ごま種子を先ず７５％エタノール水溶液に数秒間浸漬し
た後、殺菌水で洗浄し、ついで０．１％ベンザルコニウ
ムクロライド（市販殺菌剤）液に２〜５分間浸漬して、
種子に付着している微生物を殺菌する。この種子を再び
殺菌水でよく洗浄Ｃたのち、１％次亜塩素酸ナトリウム
液（０，１％の界面活性剤ツイーン２０を含む）の殺菌
剤液によって３０分間処理し、ごま種子を完全に殺菌す
る。

一方、殺菌した、ふた付の広口容器（プラスチック製市
販品）に表１に示した組成の基本培地（ただし蔗糖は添
加せず、ジェランガム０．２％添加した）の別途殺菌し
たものを注いで固化させて播種用固型培地を調製してお
く。

これに殺菌処理したごま種子を無菌操作によって播種す
る。２８〜３０℃の恒温室で蛍光灯の光のもとで１０日
間放置することによって、長さ３〜５ｃｎ＋のごま芽ば
えを調製する。

２、　ごま由来のカルス細胞の誘導表１に示した組成の基本培地に、オーキシンとして、ナ
フタレン酢酸（ｉｏ−”〜１０′″ＳＭ）あるいは２，
４ジクロロフエノキシ酢酸（１０−”〜１０−’Ｍ）、
サイトカイニンとして、ベンジルアデニン（１０−’〜
１Ｏ−４Ｋ）、あるいはカイネチン（１０−’〜１０−
’Ｍ）を組合せて添加し、ジェランガム０．２％を固化
剤として加え、殺菌した後。

ペトリディッシュに分注して固化した。これに、無菌的
に調製したごまの芽ばえの切断片を移植し、温度２８〜
３０℃の恒温室において暗所で培養を行う。培養２〜３
週間後に、ごま芽ばえの切断片の切り口より、細胞が増
殖し、塊となってカルスを形成する。この増殖性カルス
を、同じ組成の培地に継代することによって、大きなカ
ルスを育てることができる。

３、　カルス細胞の増殖培養ごまの芽ばえより誘導したカルス細胞は、表１に示した
組成の培地に、ナフタレン酢酸（１〜５×１０−ｓＭ）
、ベンジルアデニン（１〜５×１０−’Ｍ）ジェランガ
ム０．２％を含む培地に移植し、８　、０００〜１５，
０００ルクスの明所において２５〜３５℃好ましくは２
８〜３５℃で培養を行うことによってカルス細胞を更に
増殖させる。

４、　リグナン化合物の抽出と分析増殖性のカルス細胞を、ブレンダー等で細かく破砕した
のち１石英砂と共に磨砕する。

これをメタノール等で抽出し、無水硫酸ナトリウムによ
って脱水し、３０〜３５℃で蒸発乾固する。再びメタノ
ールに溶解させてリグナン化合物抽出液を得る。

セサミン、セサモリンなどのリグナン化合物の分析は、
高速液体クロマトグラフィーにより行う（日本食品工業
学会誌、第３２巻、４０７頁（（１８５９年））。なお
セサミン、セサモリンの化学的性質についてはメルク・
インデックス（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ　９版
１０９６頁（１９７６年））に記載されている。

以下に実施例をもって本発明を説明するが、これらは例
示であって１本発明を制限するものではない。

実施例１（１）前年度に採取した、ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎ
ｄｉｃｕｍＬ、）の種子約１００個を用意した。これを
７５％エタノール液に数秒間浸漬したのち、殺菌した蒸
留水で２回水洗した。これを別に用意した０、１％ベン
ザルコニウムクロライド液（せ糟化学産業製品）に２分
間浸漬し、殺菌した水で３回水洗したのち、１％次亜塩
素酸ナトリウム（和光純薬）０．１％ツイーン２０（和
光純薬）を含む殺菌剤液に３０分間浸漬し、更に、ごま
種子を殺菌水で３回洗浄した。

植物培養用のプラスチック製容器（フロー・ラボラトリ
−社ｍｌ）に表１の組成の基本培地（ただし蔗糖は添加
せず、ジェランガム（三栄化学工業製）を０．２％添加
した。）を１２０℃、１０分間オートクレーブで殺菌し
たものを、それぞれ８０＋ｍｎ宛分注し、室温で固化さ
せた。これに、前記の殺菌した、ごま種子５０個を、無
菌操作によって播種したのち２８〜３０℃の恒温室で２
０ワツトの蛍光灯の光のもとて１０日間放置したところ
、長さ３〜５ｃｍのごま芽ばえ３８本が得られた。

（２）表１に示した組成の培地２１２を調製し、これを
２０等分し、それぞれの１００ｍ１２に、ジェランガム
０．２％　と、表２に示した実験条件のナフタレン酢酸
、２，４ジクロロフエノキシ酢酸、ベンジルアデニン、
カイネチンを添加してカルス誘導培地とした。これらを
常法にしたがって１２０℃、１０分間のオートクレーブ
殺菌をした。

殺菌処理したこれらの培地を、温かいうちに。

直径１゛０口のプラスチック製ペトリ皿にそれぞれ３枚
宛３０ｍｎづつ分注し、室温で固化させた。

これに（１）で調製した、ごま芽ばえを無菌操作によっ
て、基１葉を５〜７ｍｍの切片に切断して、ペトリデイ
ッシュの固型培地上に移植した。水分の蒸発を防止する
ためパラフィルム（アメリカン・カン社製）で封をし、
２８〜３０℃の恒温室にて暗所で３週間放置してごま芽
ばえ切片からのカルスの誘導を行った。表２に結果を示
した。

１　　　　　　　　　　　　＋＋Ｏ，Ｓ　　　　　　　　　　　　＋＋０．１＋１　　　　　　　　　　　　　＋０．５＋０．１　　　　　　　　　　　　＋１　　　　　　　　　　　　＋＋＋Ｏ，Ｓ＋十０．１＋１　　　　　　　　　　　　　＋０．５＋０．１　　　　　　　　　　　　＋＋＋：カルス誘導の量を示す。十印が多いほど良好である
。

−：カルス誘導なし。

（３）表１の組成の基本培地に、ジュランガム０．２％
ナフタレン酢酸５Ｘ１０−’Ｍ、ベンジルアデニンｌＸ
ｌ０−’Ｍを添加した培地６００ｍｆｉを、（１）と同
様にして殺菌調製した。これをプラスチック製ペトリデ
ィッシュ２０枚に、それぞれ３０ｍｍ宛分注して固化し
た。（１）で誘導培養して増殖性カルスを、ペトリデイ
ッシュ当り４個宛移植した。２８〜３０℃、１２．００
０ルクスの光の植物細胞培養装置の中で、３週間培養を
行った。増殖性の良好な細胞集塊を選抜し、これらを種
細胞として、継代培養を４回繰返した。かくして、安定
に増殖する培養細胞を育成した。この細胞をＮ５ＢｓＳ
４　（ナフタレン酢酸５ＸＩＰ’Ｍ、ベンジルアデニン
ｌＸｌ０−糊で継代培養したごま培養細胞）と命名した
。

（４）表１の組成の基本培地に、ジェランガム０．２％
ナフタレン酢酸５×１０″″ｓＭ、ベンジルアデニンｌ
Ｘｌ０””Ｍを添加した培地１Ｑを（１）と同様にして
殺菌調製した。これを直径４０層深さ１３ｃ＋ｍの植物
細胞培養用のガラス製容器に４０ｍｆｌ宛分注して固化
させた。（３）で継代培養して得たＮ５Ｂ、Ｓ−１細胞
の５〜７＋ａｍ角を移植して２８〜３０℃、１２，００
０ルクスの光を植物細胞培養装置の中で３週間培養を行
った。

それぞれの培養容器中の増殖細胞の生重量は平均５．２
ｇであった。

この細胞のうち６０ｇを乳ばちに取り、６ｇの石英砂を
加えて５分間磨砕したのち、メタノール２００ＩＩｌΩ
を加えて、よく攪拌してリグナン化合物を抽出した。こ
れを遠心分Ｊｌ（２，５００回転／毎分、１０分間）し
て上澄液を集め、細胞残渣には再び２００ｍＡのメタノ
ールを加えて再抽出した。３回のメタノール抽出液を集
めたのち、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。淡黄
色の抽出液を３５℃にてロータリーエバポレーターを用
いて蒸発乾固して、黄褐色の抽出物１．７ｇを取得した
。

抽出物５０ｍｇを取りｌ０ａＱのメタノールに溶解して
５　ｍｇ／ｄの溶液を調製した。その２０マイクロリツ
トルを高速液体クロマトグラフィー装置（カラム：Ｄｅ
ｖｅｌｏｓｉｌ　００Ｓ１０、溶媒：メタノール対水（
７対３）、流速３　、０ｍ１２／毎分、検出：２８０ナ
ノメーター吸収）により分離分析を行ったところ、抽出
物中に（＋）セサミン２５．５＋ａに、（＋）セサモリ
ン５２．７ｍｇが含まれていた。なおセサミン、セサモ
リンは、ごま種子から抽出精製されたものを標準品とし
て用いた。

（発明の効果）本発明は、リグナン化合物を含む、増殖性のごま細胞を
、培養容器の中で多量に調製するという全く新しい方法
を用いたリグナン化合物の製造法を提供するものである
。したがって本発明の方法によれば、栽培によらず工業
的に、（＋）セサミン。

（＋）セサモリンなどのリグナン化合物を、計画的に供
給することが可能となる。リグナン化合物には、種々な
生理活性作用、薬理作用が認められており、本発明はこ
うした産業分野への原料を供給する重要な役割を果すも
のである。

Claims

【特許請求の範囲】１、ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）か
ら誘導した増殖性細胞を培養し、培養物からリグナン化
合物を採取することを特徴とするリグナン化合物の製造
方法。２、リグナン化合物が（＋）セサミンであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。３、リグナン化合物が（＋）セサモリンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。