JPH0466591A - 新規抗酸化性配糖体、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物由来の有用物質に関するものであり、更
に詳細には、ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　
Ｌ、）の植物体より人工的に誘導した細胞（カルス）の
大量培養法によって、配糖体化合物を工業的に大量に製
造する技術に関するものである。

本発明に係る配糖体は、従来未知の新規化合物でありし
かも強力な抗酸化活性を有するので、本発明は食品産業
のほか、医薬品産業及び化粧品産業等に広く応用される
ものである。

（従来の技術） 我々人間を初め地球−Ｌの多くの生物にとって、酸素は
不可欠である。しかし、最近、生体内における過剰量の
酸素はラジカルや過酸化脂質を生成し、その結果各種組
織が障害を受けることが問題となっている。この障害は
動脈硬化、肝疾患、網膜症、炎症などの病因となること
が明らかになっており、さらに老化や発癌との関連も示
されている。

脂質が過酸化される例として、生体の重要な構成成分で
あると共に、必須脂肪酸として不可欠な食品成分でもあ
る多価不飽和脂肪酸（Ｐｔ、１ＦＡ）は、第１図に示す
ような自動酸化と呼ばれるラジカル連鎖反応を引き起こ
し、過酸化脂質やマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を初め
とする酸化分解物を生成することが知ら才している（大
量・並木「現代の食品化学」工具出版ｐ、１８６）。

一方、このような脂質の酸化的劣化を防止するために、
食品系では冷凍保蔵や包装、脱酸素剤の使用などの物理
的手段と共に、抗酸化剤の添加という化学的手段が一般
的である。特にＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）
やＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）を初めとする合
成抗酸化剤が長く使用されてきたが、最近に至って安全
性の面から食品への使用が再検討されつつある。

そこで、その需要が急増してきたのは天然ビタミンＥで
あるが、価格や効果の点から更に有効で安全な天然抗酸
化性物質の開発が要望されているのが現状である。さら
に、天然抗酸化性物質の積極的な摂取により生体内のラ
ジカル生成や脂質過酸化反応を抑制し、その結果、老化
や発癌を初めとするさまざまな疾患を防止し得ると考え
られている（大量「食品の健全性と食品成分の生理機能
」缶詰技術研究会ｐ２）。

こうした天然由来の抗酸化性物質を食品や医薬品、化粧
品などに適宜使用するためには、従来とは性質の異なっ
た天然抗酸化性物質を見い出し、それぞれの特徴を発揮
する条件で活用することが重要である。

天然系物質の内、例えば植物由来の香辛料等には、抗酸
化活性をもった種々の化合物が含まれており（第２図）
、香辛料は食品保存作用を持つものとしても食品に添加
されてきた。しかしながら香辛料には、強い香や色を示
すものが多く、こうした性質はこれらを食品、医薬品、
化粧品などに応用する場合に使用範囲を大幅に限定して
しまう。

実用例の代表としては、化学合成法によるビタミンＣお
よび天然物から抽出精製されているビタミンＥが挙げら
れている。この内、ビタミンＣは水溶性の物質であるた
め、油や生体内の脂質には溶けない。一方、ビタミンＥ
は脂溶性であるため。

血液などの水溶液には溶けず生体内の脂質に蓄積される
特徴が認められている。こうした極端な水溶性や脂溶性
の性質は、生体に応用する食品、医薬品、化粧品などの
場合、必ずしも有利な性質とは考えられておらず、生体
内の脂質と水溶液のいずれにおいても適宜、抗酸化活性
を発揮するためには、水溶性と脂溶性の両方の性質をも
つ天然化合物が有利である。

本発明は、このような天然植物の内特にごまに着目し、
黒ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　１ｎｄｉｃｕｙｎ　Ｌ、）の
植物成体より誘導して得られた増殖性細胞を培養し、そ
の培養物から構造式（請）で示される配糖体化合物を得
、これらの化合物に強力な抗酸化活性を認めたものであ
るが、構造式（Ａ）で示される化合物は、ごま種子から
単離された代表的なリグナン系化合物（第３図）とは全
く異なっており、新規化合物である。

さらに、ごま培養細胞より生成される本発明に係る新規
抗酸化性配糖体は、カフェ酸をアグリコンとし、六単糖
をほぼ中心に配糖化した構造をとっていることにより水
溶性と脂溶性の中間的な極性を示すものである。こうし
た性質は、さまざまな生理作用が期待される抗酸化性物
質の食品、医薬品、化粧品などへの応用に非常に有利で
あり、他の抗酸化性物質には全く見当らない。

また、本発明は、植物体自体から抽出するものではなく
、抗酸化性配糖体を生産する培養細胞を用いるものであ
って、ごま細胞を大量培養することにより、天然の抗酸
化性配糖体を工業的に大量生産することに成功したもの
であって、この点においても新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 化学工業の発展を背景として、合成抗酸化剤。

例えばブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）やブチル
ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などが−船釣に使用され
てきた。ところが、こうした合成抗酸化剤の使用が増え
るにつれて、食品公害が増加して安全性の面から大きな
問題が生じ、消費者の合成抗酸化剤に対する拒否反応が
強くなり、その使用量も低下しているのが現状である。

したがって安全性の高い、天然由来の抗酸化性物質は、
生体内における抗酸化的な生体の防御機構を支援する物
質として、食品、特に健康食品や栄養食品のほか、医薬
品や化粧品の技術分野において非常に期待されている。

しかしながら、食品公害上問題のある合成抗酸化剤に代
って、その使用が期待されている天然の抗酸化剤は、化
学合成法によるビタミンＣおよび天然物から抽出精製さ
れているビタミンＥが実用化されているにすぎない。

また天然の抗酸化剤は、その起源が天候等自然条件に左
右される植物や動物等であって安定供給が困難であり、
また、その含有量も非常に微量であるため、抽出にも非
常な困難が伴い且つ抽出中に成分が変化するといった点
から工業的に大量に抽出、製造することは困難であった
。

さらに香辛料等を起源とする抗酸化性物質の中には強い
香や色を持つものが多く、こうした性質は食品、医薬品
、化粧品などの使用を制限するものとなっている。

（問題点を解決するための手段） 本発明はこれらの欠点を一挙に解決するためになされた
ものであって、各方面から鋭意研究の結果、ごま（Ｓｅ
ｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ、）の植物成体から誘
導した増殖性細胞（カルス）を合成培地を用いて培養し
、得られた培養細胞から、下記する構造式（Ａ）を有す
る新規抗酸化性配糖体を大量に且つ計画的に工業生産す
ることに成功し、本発明の完成に至ったものである。

（但し、式中Ｒは、 を表わす。） ごま培養細胞から生成される本発明に係る新規抗酸化性
配糖体は、カフェ酸をアグリコンとじ六単糖をほぼ中心
に配糖化した構造をとっており。

水溶性と脂溶性の中間的な極性を有する化合物であり、
極端な極性を有するビタミンＣやビタミンＥとは異り、
その応用範囲を広げるには非常に有利な物性を有してい
る。したがって、老化防止、発癌抑制などのさまざまな
生理作用が期待される抗酸化性物質の応用として、食品
、医薬品、化粧品などへも有効に利用される。

また本発明は、このような生産効率が非常に低い天然物
からの有効成分の抽出という技術に鑑み、目的物質を効
率的、且つ計画的、安定的に大量生産する方法を確立す
るためになされたものであって、生産効率が低く、自然
条件の影響を直接受ける植物体からの抽出法を改善する
ために各方面から研究、検討した結果、細胞を人工培養
する方法が最適であるとの結論に達した。

そこで、植物細胞の人工培養について徹底的に研究を行
い、このように有用な成分を含むごまの増殖性細胞を育
種するために、植物成体から人工的に増殖性細胞塊（カ
ルス）を誘導し、これより安定にかつ迅速に増殖する細
胞を選択する研究を行ってきた。その結果、ごまの種子
から無菌的に発芽させたごま芽ばえを素材として、ごま
細胞のカルスを誘導し、安定に継代培養が可能な高温度
培養細胞を取得することに成功しただけでなく、増殖し
た細胞内に有用成分が含有されておりしかもそれを有利
に抽出できることをはじめて見出し、これらの新知見を
基礎にして更に研究の結果、本発明が完成されたのであ
る。

すなわち、本発明は、ごま培養細胞を、特に植物細胞培
養では他に報告例のない高温度（３３〜３６℃）細胞培
養法という全く新規な方法を確立することに成功したも
のであって、それにより新規なごま抗酸化性配糖体を大
量に且つ計画的に生産する工業的方法を提供することが
できるのである。

本発明者らは、こうした工業的な植物細胞培養に適した
ごま培養細胞を育種する研究を鋭意おこなった結果、従
来、植物細胞培養の可能な温度とは考えられていなかっ
たごとき高温度において、増殖性の高い細胞を取得する
ことに成功し、得られた培養細胞中には新規な抗酸化性
配糖体が生成されていることを見い出し本発明を完成し
たのである。

本発明の高温度で旺盛に増殖する培養細胞の育種及び培
養細胞より生成される新規抗酸化性配糖体の抽出・精製
について以下に述べる。

先ず、ごまとしては、芽、根、又は種子を用いる。そし
て、無菌条件下で芽ばえを調製し、芽。

茎、葉及び／又は根の切片を固体及び／又は液体の培地
で培養してカルス細胞を誘導する。得られた増殖性カル
スは、継代培養することにより大きなカルスに成長させ
る。次いでこれを固体及び／又は液体培養で、静置及び
／又は攪拌培養してカルス細胞を増殖せしめるのである
。

培地としては、各種培地を使用することができ、炭素源
としては、グルコース、フラクトース等の単糖類、マル
トース、シュークロース等の二糖類のほか、オリゴ糖や
澱粉等の多糖類も使用することができる。窒素源として
は、硝安、硝酸カリウムといった硝酸態窒素、硫安、酒
石酸アンモニウム等のアンモニア態窒素のほか、カザミ
ノ酸、アミノ酸、ペプトン、コーンステイープリカー、
酵母菌体、イーストエキストラクト、麦芽エキストラク
ト等が使用できる。

そのほか、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、サイアミン
、葉酸、ビオチン等のビタミン類：イノシトール、アデ
ニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、サイク
リックＡＭＰ等の核酸関連物質；鉄、マンガン、亜鉛、
ホウ素、ヨウ素、カリウム、コバルト、マグネシウム、
モリブデン、リン、銅等のミネラルも使用する。

基本培地の１例を示すと、次の表１のとおりである。

表１ 硝酸アンモニウム 硝酸カリウム 塩化カルシウム 硫酸マグネシウム リン酸第１カリウム ホウ酸 硫酸マンガン 硫酸亜鉛 １．６５０ｍｇ １　、９００ ６．２ ２２．３ ８．６ ヨーソカリウム　　　　　　　　　　　　　０．８３モ
リブデン酸ナトリウム　　　　　　　　０．２５塩化コ
バルト　　　　　　　　　　　　　０．０２５硫酸銅　
　　　　　　　　　　　　　　　０．０２５エチレンジ
アミン４酢酸ナトリウム　　３７．３硫酸第１鉄　　　
　　　　　　　　　　２７．８ミオイノシトール　　　
　　　　　　　１００グリシン　　　　　　　　　　　
　　　　２塩酸ピリドキシン　　　　　　　　　　　０
．５ニコチン酸　　　　　　　　　　　　　０．５塩酸
チアミン　　　　　　　　　　　　　０．１蔗糖　　　
　　　　３０ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　、００
０ｍＱｐ）１５．７ 基本培地にはオーキシン、サイトカイニンを添加するの
が好ましく、オーキシンとしては、インドール酢酸、イ
ンドール酪酸、ナフタレン酢酸、２．４ジクロロフエノ
キシ酢酸などが適宜利用される。また、サイトカイニン
としては、ベンジルアデニン、カイネチンなどが使用で
きる。これらの植物ホルモンやサイトカイニンは単独で
も使用できるが、組合せて用いることが効果的である。

増殖性のカルスの培養には、表１に示した組成の培地で
もよいが、さらに増殖性を改善するためには、ココナツ
ミルク、カゼイン加水分解物、ジャガイモ抽出液、コー
ンステイープリカー、イーストエキストラクト、麦芽抽
出液などの天然有機栄養源を添加することが有効である
。培養温度は２８〜３７℃で培養操作できるが、好まし
くは３３〜３６℃である。培養液のｐＨは弱酸性（ｐＨ
５，６〜６．０）が増殖に有利である。

このようにして得られたごまのカルス細胞から高温度で
安定に増殖できる細胞を育成するには、ジェランガムま
たは寒天による固体平板培地に細胞の小塊を移植し、こ
れを後記の増殖条件で１〜２週間培養を行なう。このと
きの培養温度は３３〜３６℃に維持することが好ましい
。

さらに、多数の高密度培養細胞の培養系統の中より、増
殖性の高い培養系統を選択し、その細胞集団から、更に
細胞の小塊を多数取り出し、これらを新しい培地に移植
することによって、更に多数の培養系統を作る。こうし
た細胞の培養系統の継代培養を５〜１０回、３３〜３６
℃の高温度で、くり返すことによって、高温度で安定に
増殖できる、ごま培養細胞を育成する。

培養して得た増殖性細胞から抗酸化性物質を抽出するに
は、セルラーゼやリゾチームを用いる生物学的処理、化
学的処理、機械的ないし超音波などの処理、又はこれを
組合わせたりして細胞を破壊し、メタノール、エタノー
ル、アセトン、クロロホルムその他の有機溶媒、水など
の単独ないしは、これらの有機溶媒と水との混合液で抽
出して回収できる。

抗酸化性物質の活性の分析は、リノール酸を反応基質と
する空気による自動酸化量をロダン鉄性によって測定す
る方法を用いる。この方法は、脂質の過酸化を調べるの
に用いられる常法である。

（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｙ）第４５巻、７３５頁
（１９８１年））次に本発明により育種され、高温度培
養ができる、ごま培養細胞の取得について実験工程を追
って詳細に説明する。

１、無菌的に生育したごま芽ばえの調製ごま種子を、よ
く水洗したのち、７５％エタノール水溶液に数秒間浸漬
する。これを別に用意した殺菌水で洗浄し、ついで０．
１％ベンザルコニウムクロライド（市販殺菌剤）液に２
〜５分間浸漬して種子に付着している微生物を殺菌する
。この種子を再び殺菌水でよく洗浄したのち、１％次亜
塩素酸ナトリウム（和光純薬製）　（０，１％の界面活
性剤ツイーン２０を含む）の殺菌剤液によって、３０分
間処理して、ごま種子を完全に殺菌する。

いっぽう、殺菌した、ふた付きの広口容器（プラスチッ
ク製市販品）を用意する。これに表１に示した組成の基
本培地（ただし蔗糖は添加せず、固化剤として寒天の場
合０．８〜１．５％、ジュランガムの場合０．２〜０．
３％を添加した）を別途オートクレーブ殺菌したものを
、広口容器に注いで同化させ播種用の固型培地とする。

また、殺菌水と殺菌したガーゼを、広口容器に無菌的に
入れて、播種用の床としてもよい。このような播種用の
培地又は床に、殺菌処理をしたごま種子を無菌操作によ
って播種する。２８〜３０℃の恒温室で蛍光灯の光のも
とで保温すると、殺菌処理したごま種子は死滅すること
なしに、発芽し、１０日間程度で長さ３〜５ｃｍのごま
芽ばえが調製できる。このごま芽ばえは、完全に無菌状
態であり、増殖性細胞の育種に利用される。

２、　ごま由来の増殖性細胞塊の誘導培養表１に示した
組成の基本培地に、オーキシンとして、ナフタレン酢酸
（１０−＠〜１０−’Ｍ）、あるいは、２，４シ’）　
ＯＯ７ｘ　／　キシ酸ｍ　　（１０−ｓ〜１０−５Ｍ）
。

サイトカイニンとして、ベンジルアデニン（１０−’〜
１０−’Ｍ）、あるいはカイネチン（１０−’〜１０−
’Ｍ）を組合せて添加した、各種組成の培地を調合する
。

これに、固化剤としてジェランガム０．２％または寒天
０．８％を加えて、ｐ！（を５．７に調整したのち、微
生物培養に常用されるペトリディッシュに分注して固化
する。これに、先に述べたように無菌的に調製したごま
の芽ばえの断片を移植し、温度２８〜３０℃の恒温室又
は恒温箱の中で、暗所で培養を行なうと、培養２〜３週
間後には、ごま茅ばえの切断片の切り口より、細胞が増
殖し、塊となってカルスを形成する、この増殖性のカル
スを、同一組成の培地に継代培養することによって、大
きなカルスを育てることができる。

カルスの人工的な誘導に用いる基本培地は表１に示した
培地組成（ムラシゲ−スクーグの培地）を用いたが、植
物の細胞培養に通常用いられている培地ならいづれも使
用できる。こうした培地の基本組成は、当業界において
よく知られている。

（植物細胞培養マニュアル、講談社（１９８４））３、
　カルス細胞の増殖培養細胞の育成ごまの芽ばえより誘
導した増殖性細胞塊（カルス）は、表１に示した組成の
培地、ナフタレン酸！！Ｉｔ（］〜５Ｘ］Ｏ−”Ｍ）、
ベンジルアデニン（１〜５　Ｘ　１０””Ｍ）などのオ
ーキシンやサイトカイニンを添加したものに、更に固化
剤としてジュランガム０．２％又は寒天Ｏ９８％を加え
て滅菌、固化した培地を用いて、安定に増殖する細胞を
育成する。

ごま細胞は暗所でもよく増殖するが、明所の方が、更に
増殖に活発である。したがって３，０００〜３０．００
０ルクス、好ましくは８，０００〜１５，０００ルクス
の明所においてよく増殖することが観察される。

温度は、３０〜３７℃でも増殖するが、好ましくは、３
３〜３６℃で培養することができる。

ごまのカルスから高温度で安定に増殖できる細胞を育成
するには、ジュランガム又は寒天による固体平板培地に
細胞の小塊を移植し、これを前記の増殖条件で１〜２週
間培養を行なう。

このときの培養温度はカルス細胞の誘導培養に用いた温
度よりも高温度にする。すなわち培養温度を３３〜３６
℃に維持して、旺盛に増殖する細胞を濃縮することがで
きる。

このようにして得た多数の培養系統の中より、増殖性の
旺盛な培養系統を選択し、その細胞集団から、更に細胞
の小塊を多数取り出し、これらを新しい培地に移植する
ことによって、再び多数の培養系統を調製する。こうし
た細胞の培養系統の継代培養を５〜１０回くり返すこと
によって、３３〜３６℃の高温度で安定に増殖できる。

ごま細胞を育成する。

４、増殖性細胞の培養 安定に継代培養が可能なごま細胞の増殖培養には、表１
に示した組成の培地が用いられるが、植物細胞の培養に
通常よく用いられている組成の培地も利用できる。この
ような基本培地に、オーキシンとして、ナフタレン酢酸
（１〜５Ｘ１０−’Ｍ）、サイｌ−カイニジとして、ベ
ンジルアデニン（１−５Ｘ１０□！′Ｍ）を加えたもの
を調合する。液体培養の場合にはそのまま増殖培養に使
用できるが、固体培地での培養の時には、ニオしにジュ
ランガム０．２％又は寒天０．８％を加えて、滅菌、固
化させて使用する。細胞の増殖には光を照射するのが有
利である。通常３　、０００〜３０，０００ルクス、好
ましくは８，０００〜１５，０００ルクスの照射であれ
ばよい。温度は２８〜３７℃で増殖するが好ましくは３
３〜３６℃でよく増殖培養ができる。液体培養は５通常
の微生物の培養に用いられる振どう培養法や通気攪拌培
養法が適用できるが、微生物の培養に比較して、ゆるや
かな条件で操作するのが好ましい。微生物の培養に比較
して、酸素の必要量は著しく少なくてよいから、わずか
に空気を通気しつつ、細胞が培養液の底に沈でんしない
程度の攪拌を行うことが増殖に好ましい。

増殖培養を更に効果的に行なうためには、培養液のｐＨ
を５．６〜５，８に維持するのがよい。

通常の増殖培養では、］−〜２週間で培養が終了するか
ら、培養液から細胞を遠心分離法などの常法で回収する
ことが可能である。また固体培養の場合には、増殖した
細胞塊は容易に回収できる。

かくして、工業的な規模で、生産が可能なごま細胞の育
成を行い、これを多量に増殖培養することが出来るので
ある。

このような操作によって取得された高温度培養が出来る
ごま培養細胞の増殖量と培養温度との関係を第４図に示
す。植物細胞を通常培養する時に用いられている２５〜
２８℃の温度における増殖量に比べて、３５〜３６℃で
は、約２倍以上の増殖量を示しており増殖速度も早くな
ることから工業的な植物細胞の培養において、有効に使
用できるものである。

５、抗酸化性物質の抽出及び分析 上記によって得た増殖性のカルス細胞を、ブレンダー等
で細かく破砕したのち、石英砂と共に磨砕する。これを
メタノールなどの溶媒で抽出し、無水硫酸ナトリウムに
よって脱水し、３０〜３５℃で蒸発乾固する。再びメタ
ノールに溶解させて、抗酸化性物質を含んだ分画を得る
。

次に抗酸化活性の分析法について述べる。リノール酸を
反応基質とする方法であり、油脂の酸化の程度を測定す
るためによく用いられているロダン鉄性を利用するもの
である。即ち油脂の自動酸化により生成する過酸化物に
よって二価鉄イオンが三価鉄イオンに酸化され、これが
チオシアン酸アンモニウムと反応し赤色のロダン鉄を生
成させ、その吸光度を測定すること−から、油脂の過酸
化物の量を求める方法である。（アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　第４５巻、７３５頁（１９８
１年）） また、ロダン鉄性に比較してより生体系に近い分析法と
して兎赤血球膜脂質の過酸化反応を利用した。いわゆる
赤血球ゴースト法も併せて使用した。

兎の赤血球から、その膜のみを調製し、これを赤血球ゴ
ーストと呼ぶ。

この赤血球ゴーストに、酸化の開始剤として、ｔ−ブチ
ルハイドロキシパーオキサイドを加えて、赤血球膜のリ
ン脂質の過酸化反応を促進させたのち、生成するマロン
ジアルデヒドあるいは、これに類似した物質を、チオバ
ルビッール酸で発色させその吸光度を測定する。（バイ
オケミストリー７８巻、６８５８頁（１９８１年）） 反応系に添加されるサンプル中の抗酸化活性の程度によ
って、チオバルビッール酸による発色度が変化するから
、抗酸化性物質を含まない対照区と比較することによっ
て、サンプル中に含まれている抗酸化活性を測定するこ
とができる。

６、新規抗酸化性配糖体の抽出、分離及び構造解析 液体培養法によって増殖した細胞は、重力分離法や遠心
分離法によって容易に回収することができる。得られた
細胞を最終濃度が８０％になるようにエチルアルコール
を添加し、機械攪拌ホモジナイザーによって抽出する。

遠心分離して抽出液を回収した残りの細胞について再び
８０％エチルアルコールで抽出する。得られた抽出液を
減圧下で濃縮して乾固すればアメ状、黄褐色の抗酸化性
物質の粗抽出物が得られる。

これを、たとえばアンバーライトＸＡＤ−ＩＩを用いる
吸着クロマトグラフ法によって、樹脂に吸着させ、水と
メタノールの混合溶媒によって溶出し、抗酸化活性のあ
る両分を取得する。メタノール６０％水溶液により溶出
する分画を集め、これを減圧濃縮することにより、ごま
培養細胞中に含まれている抗酸化性物質の代表的な成分
を得る。

天然物化学の分野で、通常用いられている高速液体クロ
マトグラフ法により、含有成分の分離分析を行うことに
より、目的成分の精製程度を検定する。ごま培養細胞の
アルコール抽出物の吸着クロマトグラフ法により６０％
メタノール水溶液で溶出した画分の高速液体クロマトグ
ラフのチャート図を第５図に示す。

多数のピークの中より、強い抗酸化活性をもつピークと
して、ピーク１及びピーク２の二つのピークを更に精製
する。この時、天然物の精製法として通常用いられてい
る、高速液体クロマトグラフ法を、くり返し使用して、
順次目的物質を純化する。第６図に、高速液体クロマト
グラフ法により精製した物質１、物質２のそれぞれの物
質の単一性を示す。

単一な成分として単離された抗酸化性物質１．２それぞ
れについて機器分析を行い、その化学構造を以下のよう
に決定した。

先ず物質１．２それぞれの紫外線吸収スペクトラムを第
７図に示す。得られた紫外線吸収スペクトラムはいずれ
もカフェ酸系化合物の特徴とよく符号していた。

次に物質］、２を高速電子衝突質量分析法（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）により解析し、それぞれ第８図に示すようなマスス
ペクトラムを得た。これより、分子イオンピーク（トｌ
）−はいずれも６６７であり、物質１．２の分子量はい
ずれも６６８と判明した。またプロトン核磁気共鳴法（
ＮＭＲ）により、物質１．２のそれぞれの二置換ｔ−オ
レフィン、２つの芳香族環の存在と置換様式が解明され
た（第９図）。

物質１．２は、いずれも糖の呈色反応により糖分子が結
合した配糖体であることが判っていたが、それぞれの構
造を決定するために炭素１３核磁気共鳴法により構造の
解析を行った。それぞれのスペクトラムを第１０図に示
す。

こうした天然物の構造解析法を駆使して物質１、物質２
のそれぞれの構造は、次のとおりであると決定された。

７、新規抗酸化性配糖体の抗酸化活性 ごま培養細胞から８０％エタノールで抽出して得た粗抽
出物、これをアンバーライトＸＡＤ−ＩＩによる吸着ク
ロマトグラフ法により６０％メタノール水溶液で溶出し
て得た中間精製物、さらに、中間精製物を高速液体クロ
マトグラフ法により単一ピークまで精製した、物質〕、
２それぞれについて、前述の兎赤血球ゴースト法により
、抗酸化活性を測定した結果を第１１図に示した。横軸
は分析における反応系１こ添加したサンプルの濃度をと
り、縦軸に、チオバルビッール酸による発色度を、抗酸
化性物質を無添加の対照区を１００％として相対比率で
示した。市販されている合成抗酸化剤ブチルヒドロキシ
アニソール（Ｂｌ（Ａ）を抗酸化剤の対照区に用いて比
較したものである。

このように、ごま培養細胞から抽出して得た抗酸化性配
糖体はいずれも、Ｂ）ＩＡにほぼ相当する抗酸化活性を
もっていることがわかった。

抗酸化剤として工業的に物質１及び２を応用する時には
目的に応じて精製品や粗製品を使用することが便利であ
る。

このことは第１１図に示したように、純品にまで精製し
た標品と、吸着クロマトグラフ法によって得られた中間
精製品の抗酸化活性には大きな差はなく、厳密に考える
と中間精製品に含まれている、物質〕−１２以外の成分
にも抗酸化活性が認められたり、また、共存物質による
抗酸化活性の促進作用（相乗作用）が考えられる。こう
したことは、粗製品でも使用できることを充分に示唆す
るものである。

また、配糖体の構造をもっていることは、水溶性と脂溶
性の双方の特性を示すことが特徴として考えられ、水溶
性のビタミンＣ５脂溶性のビタミンＥやブチルヒドロキ
シアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（
ＢＨＴ）などに比較して、抗酸化剤としての使用範囲が
拡大され、また生体内での作用においても、有利性が大
いに期待される。

以下に実施例及び試験例をもって本発明を説明するが、
これらは例示であって、本発明を制限するものではない
。

なお、本発明に係る各細胞は、通常のごま植物を用い、
前記した手法及び後記する実施例の手法にしたがってご
ま成体細胞をそれぞれ処理すれば容易に取得することが
でき、充分に再現性があることが確認された。原料の入
手にも何の困難性もなくその処理にも格別の困難は無い
ので、本発明に係る細胞は、何人も容易に入手すること
ができるのである。

実施例１ （１）ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ、）
の種子を用意し、これを７５％エタノール液に数秒間浸
漬したのち、殺菌した蒸留水で２回水洗した。これを０
．１％ベンザルコニウムクロライド液（せ糟化学産業■
製）に２分間浸漬した。殺菌した蒸留水で３回よく洗浄
したのち、１％次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬）０．
１％ツイーン２０（和光純薬）を含む殺菌剤液に３０分
間浸漬し、殺菌水で水洗して殺菌ごま種子を調製した。

植物培養用のプラスチック製容器（フロー・ラボラトリ
−社製）に殺菌水と殺菌したガーゼを入れ、その上に、
予め殺菌したごま種子を播種した。

３０℃の恒温室で２０ワツトの蛍光灯の光のもとて２週
間放置したところ、長さ５〜７ｃｍのごま芽ばえが得ら
れた。

（２）表１に示した組成の培地２Ｑを調製し、これを等
分し、それぞれの１００ｍｆｉに、ジュランガム（三栄
化学工業製）０．２％と、表２に示した実験条件のサイ
トカイニン、オーキシンを添加して、増殖性細胞塊（カ
ルス）の誘導培地とした。これらを常法にしたがい１２
０℃、１０分間のオートクレーブ殺菌処理をした。

これらの培地を、温かいうちに、直径１０ｃ■のプラス
チック製ペトリディッシュにそれぞれ３枚宛３０ｍＱづ
つ分注し、室温で固化させた。

これに（１）で調製した、ごま芽ばえを無菌操作によっ
て、茎、葉を５〜７ｍｍの切片に切断して、ペトリディ
ッシュの固型培地上に移植した。水分の蒸発を防止する
ためパラフィルム（アメリカン・カン社製）で封をし、
２８〜３０℃の恒温室に暗所で３週間放置してごま芽ば
え切片からのカルスの誘導を行ない、表２の結果を得た
。

０．１ ０．０１ ５Ｘ１０−’Ｍ ０．１ １ＸＩＯ−’Ｍ ５Ｘ１０−’Ｍ ０．１ ０．０１ ５　Ｘ　１０−５Ｍ ０．１ ＋：カルス誘導の量を示す。十印が多いほど良好である
。

−二カルス誘導なし。

（３）表１の組成の基本培地に、ジュランガム０．２％
、ナフタレン酢酸５　Ｘ　１０−’Ｍ、ベンジルアデニ
ンＩ　Ｘ　１０””Ｍを添加した培地６００鵬Ｑを（１
）と同様にして殺菌調製した。これをプラスチック製ペ
トリディッシュ２０枚に、それぞれ３０■Ｑ宛分注して
固化させた。（１）で誘導培養して得た増殖性カルスを
、ペトリディッシュ当り４ケ宛移植した。３３〜３６℃
。

１２．０００ルクスの光の植物細胞培養装置の中で、２
週間培養を行った。増殖性の良好な細胞集塊を選抜し、
これを種細胞として、３３〜３６℃で継代培養を４回く
り返した。かくして、高温度で安定に増殖する培養細胞
を育成した。この細胞をＮ５ＢｓＳ−）ＩＴ（ナフタレ
ン酢酸５ｘｉｏ−’ｓ、ベンジルアデニン１×１０−’
Ｍで継代培養したごま培養細胞）と命名した。

（４）表１の組成の基本培地にジュランガム０．２％、
ナフタレン酢酸５　Ｘ　１０−’Ｍ、ベンジルアデニン
１　ｘ　１０−’Ｍを添加した培地１ρを（１）と同様
にして殺菌調製した。これを直径４ｃＩ１．深さ１３ｃ
■め植物細胞培養用のガラス製容器に４０社宛分注して
固化させた。（３）で継代培養して育成してごまの増殖
性細胞Ｎ、　Ｂ＆５−ＨＴ細胞の５〜７Ｉｌｌｆｆｉ角
を移植して３５〜３６℃、　１２，０００ルクスの光の
植物Ｉ胞培養装置の中で１０日間培養を行った。その結
果、培養容器中に増殖した細胞の生重量は平均１４．５
ｇであった。

この細胞のうち６０ｇを乳ばちに取り、６ｇの石英砂を
加えて５分間磨砕したのち８０％エタノール水溶液２０
０ｍｆｌを加えてよく攪拌し抗酸化性物質を抽出した。

これを遠心分離（’２，５００回転／分、１０分間）し
て上澄液を集め、細胞残渣には再び２００１ｍｆｆの８
０％エタノール水溶液を加えて抽出した。３回のエタノ
ール水溶液による抽出液を集め４０℃でロータリエバポ
レーターにて蒸発乾固し、黄褐色の抽出物４．８ｇを取
得した。

実施例２ 表１に示した組成の培地３Ｑを、通気攪拌装置を備えた
５Ω容量の植物細胞培養槽に入れ、オートクレーブによ
って、１２０℃、２０分間加圧殺菌した。別に３００＋
＋＋Ｑ三角フラスコに表１に示した組成の培地６０１１
Ｑを入れ、同様に殺菌したものに、ごま培養細胞のシー
ドを添加し、３５℃、蛍光灯の光照射下で、振どう数６
０往復／分の条件で振どう培養した。７日間培養したフ
ラスコ５本分の培養細胞を無菌操作によって回収し、植
物細胞培養槽に接種した。植物細胞培養槽の培養条件は
、攪拌数３０回転／分、ｐＨ５，７±０．１、通気量１
．５Ｑ／分、光照射８　、０００ルクス、温度３５℃で
１０日間培養した。培養終了液を遠心分離して、細胞を
回収したところ、乾燥重量として４４ｇが取得された。

培養して得られたごま細胞を生重量として５００ｇを用
いて抗酸化性物質の抽出精製を行った。すなわち１．９
ｐのエタノールを加えて、ホモジナイザーにより攪拌し
つつ２０分間抽出したのち、濾過器によって細胞と抽出
液を分離した。細胞残渣に２Ｑの８０％エタノール水を
加え、同様に抽出操作を２０分間行ったのち濾過器によ
って細胞残渣を分離し、更に２Ｑの８０％エタノールで
抽出した。

抽出液を合せて、４０℃で減圧濃縮を行い褐色の粗抽出
物１３．３ｇが取得された。

吸着クロマトグラフ法に用いるアンバーライトＸＡＤ−
ＴＩ樹脂を直径５ｃｍ、長さ４０ｃｍのガラス製カラム
に充填して、水を流して平衡化した。これに抽出物５ｇ
をカラムの上部に樹脂に吸着させた状態で重層し、水か
ら順次メタノール濃度を増加させる段階溶出法によって
、目的物質の溶出を行った。

６０％メタノールで溶出される分画を集め、　４０℃で
減圧濃縮したところ、黄褐色の中間精製物の１６５＠ｇ
が得られた。これを高速液体クロマトグラフ法を繰返し
て、単一ピークになるまで精製を行った結果、精製物と
して物質１．２がそれぞれ６ｍｇ。

１３１ｇ得られた。

これらの組成分、中間精製物、および精製物の抗酸化活
性を兎赤血球ゴースト法により測定したところ第１１図
に示すように、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）
とほぼ同程度の強い抗酸化活性が認められた。

試験例１ 本発明によって調製した抗酸化性配糖体のすぐれた抗酸
化効果を次のようにして確認した。

実施例によって得た抽出物１００ｍｇ　ｆｉｔ　１００
ｍＱの８０％エタノール水溶液に溶かしく１ｍｇ／ｍ１
２濃度）抗酸化性物質の分析サンプルとした。これの１
＋ｎＱをサンプルとしてリノール酸の自動酸化の抑制の
程度をロダン鉄性によって測定した。その結果、第１２
図からも明らかなように、ごま増殖細胞から抽出した両
分（１ｍｇ）には、α−トコフェロール（０，２ｍｇ）
あるいは、ブチルヒドロキシアニソール（Ｂ）ＩＡ、　
０．２ｉｏｇ）に相当する高い活性の抗酸化性物質が含
まれていることが確認さｔた。

（発明の効果） 本発明は、高温度増殖性ごま細胞を培養容器の中で多量
に調製し、それによって、ごま細胞中に含まれている新
規抗酸化性配糖体を工業的に大量生産することを可能と
したものである。したがって本発明の方法によれば、栽
培によらず工業的な手段によって安全な食品、医薬品、
化粧品として使用される天然物由来の新規抗酸化性配糖
体を計画的に月つ大量に供給することができるという著
効が奏されるのである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、多価不飽和脂肪酸（ＰＩＪＦＡ）の自動酸化
機構を図示したものであり、第２図は、フェノール性抗
酸化物質の構造を図示したものであり、第３図は、ごま
から単離された抗酸化性物質の構造を図示したものであ
る。 第４図は、高温度培養細胞の増殖量と培養温度との関係
を示すグラフである。 第５図は、吸着クロマトグラフ法で溶出した中間精製品
の液体クロマトグラフ法による含有成分の組成を示す図
面である。 第６図は、液体クロマトグラフ法により精製した物質１
（上段）及び物質２（下段）のクロマトグラムである。 第７図は、物質１（上段）及び物質２（下段）の紫外線
吸収スペクトラムである。 第８図は、物質１（上段）及び物質２（下段）の高速電
子衝突マススペクトルによる解析図である。 第９図は、物質１（上段）及び物質２（下段）のプロト
ン核磁気共鳴法によるスペクトラムである。 第１０図は、物質１（上段）及び物質２（下段）の炭素
１３核磁気共鳴法によるスペクトラムである。 第１１図は、兎赤血球ゴースト法によるごま培養細胞か
らの粗抽出物、中間精製物、精製物（物質１及び２）の
抗酸化活性を示したものである。 ム：粗抽出物 ・：中間精製物 ◆：精製物（物質１） ■：精製物（物質２） ０ニブチル・ヒドロキシ・アニソール（ＢＨＡ）第１２
図は、リノール酸を反応基質とした自動酸化の経過をロ
ダン鉄性により分析した。リノール酸の酸化曲線である
。 −・−：対照区 一〇−：α−トコフェロール区 一Δ−ニブチルヒドロキシアニソール区−０−：ごま細
胞よりの粗抽出物 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第 図 培養温度（Ｏｏ 第 図 溶出時ＩＷｌｌ　（ｍｉｎｉ 第 図 波長（ｎｍｌ 第 図 １１ｍ 第 図 反応 日 ■ 手続補正書 平成 ２年ＩＱ月１５日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の構造式（Ａ）を有する配糖体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し式中Ｒは、 ▲数式、化学式、表等があります▼または ▲数式、化学式、表等があります▼ を表わす。）
2. （２）ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）
   の植物成体から誘導した増殖性細胞を培地に培養し、そ
   の培養物から、構造式（Ａ）を有する配糖体を製造する
   方法。
3. （３）ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）
   の植物成体から誘導した高温度培養細胞を培地に培養し
   、その培養物から構造式（Ａ）を有する配糖体を製造す
   る方法。
4. （４）構造式（Ａ）で示される配糖体を有効成分とする
   抗酸化剤。