JPH03262488A - ポドフィロトキシン類化合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はポドフィロトキシン類化合物の製造方法に関す
る。さらに詳しくは、ホトフィルム（ヒ劫動壇山１）属
に属する植物中に産生蓄積されるポドフィロトキシン類
化合物を植物組織培養法により効率的に取得する方法に
関する。

〔従来の技術〕

高等植物に産生蓄積される化合物には工業的に有用と認
められるものか多数ある。これらの化合物のうち主とし
てポドフィルム属に属する植物中に産生蓄積されるポド
フィロトキシン類化合物は有用な生理活性を示す化合物
として知られている３、例えばポドフィロトキシン類ｆ
ヒ金物の一種であるポドフィロトキシンは従来から地域
によってはその緩下作用あるいは抗菌様作用に着目され
、下剤あるいは外用薬として用いられてきていた。また
近年は抗腫瘍性物質としても注目されている。またポド
フィロトキシン類化合物を原料とする抗腫瘍性物質の開
発も種々試みられている。

しかしながらポドフィロトキシン類化合物の工業的な取
得製造にあっては、他の多くの工業的に有用な高等植物
由来の物質の取得製造と同様に植物固有の問題点が有る
。すなわち、該物質を製造するには、該物質を産生じ得
る自生植物を採取し、又は栽培する必要があるか、ホト
フィルム属植物自生地は極めて限られており、また該植
物を栽培するにも環培条件等の制約が伴い、さらに、目
的物質の含有量も種々の条件により変動し、またその含
有量は一般に低い。従って、ポドフィロトキシン類を製
造するための工業原料としてホトフィルム属植物の植物
体を大量に安定的に入手することは極めて困難である。

上記のような高等植物体が産生蓄積する有用物質の工業
的な取得製造に対して障害となる諸問題に対する解決法
として植物組織培養法による有用物質の生産方法が提案
されている。即ち同方法においては植物体から誘導され
る細胞又は組織、例えば、カルス、脱分化細胞、不定胚
、不定器官等、を培養し培養物あるいは培養環境中に蓄
積される目的とする有用物質を採取取得する方法である
。

この様な種々の存在状態はよく知られており、またこれ
らを誘導し、培養するための一般的方法も知られている
。しかしながら、これらの組織を誘導　培養する難易、
具体的な条件は個々の植物により異り、ある植物のため
の条件をそのまま他の植物に適用することはできない。

ましてや、特定の物質を植物の組織に産生せしめるため
の条件は極めて微妙であって、あるＮ物について、又は
ある物質の産生のために知られた条件を他の植物又は他
の目的物質の産生のために適用することはほとんど不可
能であり、個々の植物、具体的な目的物質等ごとに実験
的に定めなければならない特開昭６２−９６０８８には
、ポドフィルム属植物の外植片を固体培地上で培養する
ことによりカルスを形成せしめ、これをさらに固体培地
上で培養することによりカルス／不定根を大量に得、こ
の不定根から０．００３５％の収率でポドフィロトキシ
ンを得た旨記載されている。しかしなからこの方法にお
いては不定根を大量に得るのは必すしも容易ではなく、
ポドフィロトキシンの蓄積量も必すしも満足できるもの
ではない。

なお、ホトフィルム植物の不定胚誘導の例は全く知られ
ていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、ポドフィロトキシン類化合物を、多量
に且つ高収率で工業的に製造することができる方法を提
供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の課題はホトフィルム属植物を用いるポドフィロト
キシン類化合物の製造方法において、ホトフィルム属植
物の不定胚を培養することにより不定器官の誘導を行い
、次に該不定器官を培養することによりポドフィロトキ
シン類化合物を産生せしめ、該ポドフィロトキシン類化
合物を採取することを特徴とする方法により解決される
。

〔具体的な説明〕

本発明はホトフィルム属植物を用いるポドフィロトキシ
ン類化合物の製造方法において、ホトフィルム属植物の
不定胚を培養することにより不定器官の誘導を行い、次
に該不定器官を生長せしめることによりポドフィロトキ
シン類化合物を産生せしめ、該ポドフィロトキシン類化
合物を採取することを特徴とするポドフィロトキシン類
化合物の製造方法に関する。

本発明の方法に用いられるホトフィルム属に属するＭ物
とは、例えばホトフィルム・ペルタツム（Ｐｏｄｏｐｈ
ｙｌｌｕｍ　四江吐吐）、ポトフィルムエモティ（Ｐ、
　ｅｍｏｄｉ）、ホトフィルム・ヘキサン′ドルム（Ｐ
、　ｈｅｘａｎｄｒｕｍ）、ボドフイルム・プレイアン
ツム（Ｐ、　ｐｌｅｉａｎｔｈｕｍ）、ホトフィルム・
ヘルシベレ＜Ｐ。

遅」王様！上瞼−）などのホトフィルム属に属する植物
およびそれらの亜種、変種なとは好適に用いることかで
きる。

本発明の方法の出発材料として用いられる不定胚は例え
ばホトフィルム＜跋動軸りげ悲）属植物の細胞を糖濃度
２重量％以下の条件で培養した後、糖濃度２重量％を越
える条件で培養することにより該植物の不定胚を誘導せ
しめることにより調製することができる。前記の細胞は
カルスまたは液体培養細胞の形で用いるのが普通である
。カルスは常法に従って得ることができる。即ち、ホト
フィルム属植物の葉、茎及び根等の各部をよく水洗いし
たのちエチルアルコール水溶液、次亜塩素酸ナトリウム
水溶液、塩化ベンズアルコニウム水溶液等で殺菌をし、
しかる後に滅菌水で洗浄する。

得られた滅菌済みの植物を試験管、フラスコあるいはシ
ャーレ等に入れである培地上に置き培養することにより
該植物の細胞または組織を得る。このとき使用する培地
としては一般に使用される植物組織培養に用いられる培
地ならば支障なく用いることができる。このような培地
の例として、基本培地としてムラシゲ・スクーグの培地
、ガンボルグのＢ５培地、ニッチ及ニッチの培地、ホワ
イトの培地等にビタミン類及び１ｊＩｅｌ生長調節物質
を添加したものが好適に使用でき上記記載のものに限定
されない。植物生長調節物質としては例えばインドール
−３−酢酸、α−ナフタレン酢酸、２゜４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸等のオーキシン、カイネチン、６−ベンジ
ルアデニン等のサイトカイニン等が挙げられる。これら
は単独あるいは他の成分と組み合わせて用いられる。上
記のような培地で２０−３０℃で培養を続けることによ
り通常１−４週間で目的とするボドフイルム属植物のカ
ルスを得ることができる。このカルスを固体培地あるい
は液体培地で培養することにより容易にホトフィルム属
植物の液体培養ｍ胞を得ることができる。

なお、本発明ていう培養とは、上記のようにして得られ
たホトフィルム属植物のｍ胞の固体培地上での培養およ
び液体培地中での培養をさす。固体培地とは後述する培
地成分を含有する含水ケル上に上述の細胞を置床して培
養することである。

含水ゲルの例としては、寒天、ゲランガムなどが好適に
用いられる。また液体培養とは、上記のようにして得ら
れたポドフィルム属植物の細胞の一部または全部が液相
の培地に接触する状態における培養条件であり、例えば
、通気撹拌式培養槽、エアーリフト型培養槽、往復ある
いは回転振盪されている三角フラスコ、ベーパーウィッ
ク法を用いる培養方法などがこれに該当する。

ポドフィルム属植物の培養物を長期間にわたり生存状態
で維持し又は増殖させるためには一般に２重量％を越え
る糖の存在が好適であるか、本発明の方法においては、
例えばホトフィルム属植物の細胞、例えばカルス又は液
体培養細胞を、−時的に、且つ該細胞の生存が維持され
る程度において糖飢餓状態におくことにより不定胚を誘
導する。

この様な飢餓状態に置くためには糖濃度を２重量％以下
にすればよいが、好ましくは１．５重量％とじ、さらに
好ましくは１重量％以下、例えぽ０．５重量％とする。

糖濃度を０％又はそれに近い低濃度にすることも可能で
あるが、この場合は、培養期間が長期間、例えば１０週
間を越える場合には、植物細胞の死滅が起こり、好まし
くない。

本発明で用いる培養細胞の糖濃度２重量％以下における
培養細胞の培養は、基本培地として、ムラシゲ・スクー
グの培地、ガンボルグのＢ５培地、ニッチ及ニッチの培
地あるいはこれらを修正した培地を好適に用いることが
できる。また栄養源としてカゼイン加水分解物やココナ
ツ・ミルクを用いることもできる。植物生長調節物質に
ついてはこれを使用しないか、オーキシンとサイトカイ
ニンを両者の濃度がそれぞれ３ｍＭ以下の条件で単独で
あるいは、混合して好適に用いることができる。

この工程における培養期間は、この工程における糖濃度
等により異るか、通常２日から１０週間が好適である。

本発明の方法によれば、低糖濃度培地て培養した培養物
を次に通常の糖濃度の培地で培養するが、この場合のＮ
ＷＡ度は２重量％を越える濃度てあればよい、この濃度
は好ましくは２．５重量％以上であり、例えば約３重量
％である。

本発明で用いる培養細胞の糖濃度２重量％を超える培地
における培養細胞の培養は、基本培地として、ムラシゲ
・スクーグの培地、カンホルクのＢ５培地、ニッチ及ニ
ッチの培地あるいはこれらを修正した培地を好適に用い
ることかできる。とくにマグネシウムイオンの補強は不
定胚の誘導を加速する好ましい結果をもたらす。また栄
養源としてカゼイン加水分解物やココナツ　ミルクを用
いることもできる。植物生長調節物質についてはこれを
使用しないか、オーキシンとサイトカイニンを両者の濃
度がそれぞれ３Ｉｌ１Ｍ以下の条件で単独であるいは、
混合して好適に用いることかできる。

二の工程に要する培養期間は通常２日から５週間で、こ
の期間の経過とともに目的とするボドフイルム属Ｖｉ物
の不定胚が培養物中に誘導されてくる。

上述の２つの工程を通じて共通の培養条件として好適に
用いられるものとして、培養温度は１〇−３０’Ｃ１照
明は明暗両条件が挙げられる。さらに糖として使用可能
なものとして、シｇ糖、グルコース、ガラクトースが例
として挙げられる。

このようにして得られた不定胚は、そのまま次の不定器
官誘導工程の材料として用いることができる。あるいは
、培養が固体培地上であればビンセットなどを用いて容
易に収穫することが可能であり、また培養か液体培養で
あれば濾過なとの操作により容易に収穫することができ
る。従ってこうして得られた不定胚を、次の不定器官誘
導工程に用いることもできる。

本発明で用いる不定器官の誘導は、ボドフイルム属植物
の不定胚を適切な培地条件および培養条件で培養するこ
とにより行うことができる。不定器官の誘導は不定胚を
固体培地上に置床して行う固体培養又は液体培養条件で
行う。不定器官の誘導に用いる培地は基本培地としてム
ラシゲ・スクーグ、リンスマイヤー・スクーグ、ニッチ
＆二・ンチおよびガンボルグの８５培地およびこれらの
培地を修正した培地にビタミン類を添加したものが好適
に使用できる。

植物生長物質としては例えはインドール−３〜酢酸、α
−ナフタレン酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸等
のオーキシン、カイチネン、６−ベンジルアデニン等の
サイトカイニンが挙げられるが、これらを無添加あるい
はオーキシン又はサイトカイニンの濃度が５−以下のも
のを単独あるいは混合して好適に用いることかできる。

また栄養源としてカゼイン加水分解物やココナツ・ミル
クを用いることもてきる。また糖としてはグルコース、
ショ糖、ガラクトースを０−５重量％の範囲で好適に用
いることができる。不定器官の誘導に用いることのでき
る培養条件としては、上記の固体あるいは液体培養条件
において上記ポトフ１ルム属植物の不定胚を温度、１０
〜３０°Ｃ１明所あるいは暗所にて２〜１６週間培養す
ることにより好適に不定器官を得ることができる。

本発明の方法によれば、不定器官の誘導に適する培地お
よび培養条件で不定胚を固体培養又は液体培養すること
により不定器官を誘導することができる。しかしながら
不定胚を上述の如く培養することにより不定胚からの不
定器官への分化と不定胚の増殖を同時に行うこともでき
る。

なお、本発明でいう不定器官とはＭ物の不定胚を固体又
は液体培養することにより、該不定胚から分化誘導され
る組織のうち、その形状が不定芽あるいは不定根の形状
を示すものをいう。

上記の方法により得られた不定器官は固体培地あるいは
液体培地、例えば上記の如き常用の培地で例えば２週間
以上培養することにより生長させることがてきる。

このようにして得られる分化器官は母植物の含有してい
るポドフィロトキシン類化合物を含有しておりしかも母
植物の含有量と同等以上のポドフィロトキシンを含んで
いる。分化器官中に含有されるポドフィロトキシン類ｆ
ヒ合物はアルコール。

ケトンなとの溶媒を用いることにより抽出することによ
り分化器官内から容易に分離することができる。

以上の発明を用いることにより、自然環境、植物固体差
、入手の困難等の外部的要因に左右されることなく、ホ
トフィルム植物の増殖性の大きい培養細胞を用いること
により、工業的に価値のあるポドフィロトキシンを得る
ことか可能となった。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明は実施例により制限されない。

実施例１゜ 十分水洗したホトフィルム　へルタツムの根茎を７０２
５アルコールを用いて２分間殺菌する。次に１％の次亜
塩素酸ナトリウムにより１分間殺菌した後、滅菌水によ
り十分に洗浄した。この滅菌した根茎を無菌的雰囲気で
長さ約５ＩＩ１ｍにきざみ、ムラシゲ・スクーグ培地（
ショ糖３重量２６含有〉にαナフタレン酢酸ＩＨ／Ｌ、
カイチネン０．２Ｂ／Ｌ及びカゼイン加水分解物５００
ｍｇ／　Ｌを添加した１％濃度の寒天培地に置床し５週
間暗所で静置培養したところカルスが発生した。このカ
ルスを数回継代培養した後、ショ糖濃度が０．５％のム
ラシゲ・スクーグ培地にカゼイン加水分解物５０（ｈｏ
ｇ／Ｌを添加した液体培地１００ｍＮを含む３００−フ
ラスコに移し５週間暗所にて２５℃、１３０ｒｐｒｒｌ
の振盪速度で回転式振盪培養を行った。その後培養物を
ショ糖濃度３重量％のムラシゲ・スクーグ培地にα−ナ
フタレン酢酸１ａｇ／Ｌ、カイチネン０．０２ｇ／Ｌ、
カゼイン加水分解物５００ｍｇ／　Ｌを添加した液体培
地１００社を含む３００−フラスコに移して２週間暗所
にて２５℃、１３０ｒｐｍの振盪速度で回転式振盪培養
を行った。培養フラスコ内の細胞の３０重量％が不定胚
であった。

上記のようにして調製したホトフィルム・ペルタツムの
不定胚をムラシゲ・スクーグ培地（ショ糖３重量％含有
）にα−ナフタレン酢酸１ｍｇ／Ｌ、カイチネン０．２
ｔａｇ／　Ｌ及びカゼイン加水分解物５００ＩＩ＋ｇ／
　Ｌを添加した液体培地上のペーパーウィック培地に置
床し４週間暗所て静置培養したところ不定器官か発生し
た。上記と同一組成の培地に植えつぎさらに４週間培養
を行ったところ全長約２ｃｍの不定器官へと生長した。

この不定器官をエチルアルコールで抽出し高速液体クロ
マトグラフィーを用いて抽出台の分析を行ったところ、
不定器官乾燥重量当り１．５重量％のポドフィロトキシ
ンが蓄積していることがわかった。

炙東鯉ｉ− 実施例１に記載したようにして調製したホトフィルム・
ベルタツムの不定胚を、ムラシゲ・スクーグ培地（ショ
糖３重量％含有）にα−ナフタレン酢酸ｌ鴫ｇ／Ｌ、カ
イチネン０．２ｍｇ７’Ｌ及びカゼイン加水分解物５０
０ｍｇ／　Ｌを添加した２０−の液体培地に加え、１０
０−のエーレンマイヤーフラスコ中に移して暗所で２５
℃、３Ｏｒｐｍで回転式の振盪培養を４週間暗所で行っ
たところ、不定器官が発生した。更に４週間明所で培養
を行ったところ全長約１．５ｃｍの不定器官へと生長し
た。この不定器官をエチルアルコールで抽出し高速液体
クロマトグラフィーを用いて抽出台の分析を行ったとこ
ろ、不定器官乾燥重量あたり０．８重量％のポドフィロ
トキシンが蓄積していることがわかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ポドフィルム（￥Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ￥）属植
   物を用いるポドフィロトキシン類化合物の製造方法にお
   いて、ホトフィルム属植物の不定胚を培養することによ
   り不定器官の誘導を行い、次に該不定器官を培養するこ
   とによりポドフィロトキシン類化合物を産生せしめ、該
   ポドフィロトキシン類化合物を採取することを特徴とす
   る方法。