JPH02249495A - グリシルリチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、カンゾウ植物不定根を培養してグリシルリ
チンを製造する方法に関する。

［従来の技術］ 従来、グリシルリチンは、主に該成分を含有するカンゾ
ウ植物の根及びストロンから抽出することにより製造さ
れている。このグリシルリチン（Ｃ４ｓＨｓｓＯ＋−）
には副腎皮質ホルモンと同様な作用があり、アジラン病
に対する治療効果を有する。１また。その特異的な甘味
から煙草や醤油にも用いられている。最近では、カンゾ
ウに含まれるクリシルリチン及びその他の副成分にエイ
ズウィルス増殖抑制効果があることが見つかっており、
その安定した生産性の高い製造方法が望まれている。

しかし、このカンゾウ植物は中国や欧州等の限られた地
域の乾燥地帯においてのみ生育し、また、自然環境によ
り、その成長が左右され安定的な供給が難しい為に、グ
リシルリチンの供給も不安定である。また、グリシルリ
チンの含量も低く、生産性が低いという欠点があった。

一方、特公昭５０−１６４４０号には、カンゾウ植物の
組織培養によりカンゾウカルスから誘導される未分化状
態の分散細胞及びこれを含む培養液から煙草加香用とし
てのカンゾウエキス様物質を得る方法が記載されている
。しかしながら、このカンゾウエキス様物質は未分化培
養細胞より得られるものであり、またグリシルリチンの
含量も微量であった。さらに、特公昭５９−２３７９８
号には誘導したカンゾウカルスをオーキシン１０−６モ
ル／β以上及びサイトカイニン１０−４〜１０−６モル
／βを含む栄養培地で培養することにより、根、葉、茎
等の器官分化を誘導し、その培養物よりグリシルリチン
を採取する方法が記載されている。この方法によりグリ
シルリチンの含有量は改善されたが、生産性の面ではま
だ不充分な点が多い。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明は、より生産性の高いグリシルリチン
製造方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、これまでの研究の結果、カンゾウ植物
のカルスな、特定のオーキシン及びサイトカイニンを含
む培地で培養することにより、不定根のみを再分化させ
ることができることを見出し、特願昭６３−１２１４６
６に開示している。これによりカンゾウ植物の不定根の
みを効率的に再分化することが可能となり、カンゾウ植
物の組織培養によるグリシルリチンの生産性は向上した
。

さらに、本発明者らは、カンゾウ不定根のグリシルリチ
ン生産性をより向上させるために鋭意研究した結果、カ
ンゾウ不定根をグリシルリチンのアグリコンであるグリ
シルレチン酸を含む培地で培養すると、不定根の細胞が
グリシルレチン酸を取り込み、自らの変換能力でこれを
配糖化しグリシルリチンとして細胞内に蓄積することを
見出し、この発明を完成した。

すなわち、この発明は、カンゾウ植物不定根をグリシル
レチン酸を含む培地で培養し、該不定根からグリシルリ
チンを回収する工程を含むグリシルリチンの製造方法を
提供する。

【発明の効果］ この発明により、カンゾウ植物の不定根に高濃度でグリ
シルリチンを蓄積させる方法が提供された。この発明の
方法を用いると、季節や天候等の環境条件に左右される
ことなく安定して、上記したように医薬及び甘味料とし
て有用なグリシルリチンを効率的に製造することができ
る。

［発明の詳細な説明］ この発明の方法において用いられるカンゾウ植物は、グ
リシリザ属に属するいずれの植物であっでもよいが、グ
リシルリチンの生産を目的とする場合には、好ましいカ
ンゾウ植物としてウラルカンゾウＩＧＩ　ｃ　ｒｒｈｉ
ｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　Ｆｉｓｃｈｅｒ。

ｅｔ　ＤＣ，ｌ及びナンキンカンゾウ（Ｇｌ　ｃ　ｒｒ
ｈｉｚａ旺硅胚り、　ｖａｒ、　　１ａｎｄｕｌｉｆｅ
ｒａ　Ｒｅｇｅｌ　ｅｔ　Ｈｅｒｄｅｒｌを挙げること
ができる。

カルスを誘導する組織片はカンゾウ植物のいずれの組繊
に由来するものであってもよいが、茎部及び置部が好ま
しく、Ｒ開開もない葉柄部が特に好ましい。

この発明において用いられる不定根は、いかなる方法で
誘導及び再分化された不定根であってもよいが、好まし
い方法としては特願昭６３−１２１４６６に詳しい、特
願昭６３−１２１４６６号に記載された方法では、先ず
、カンゾウ植物の組織を切り出し、これを殺菌する。殺
菌は常法により行なうことができる０例えば、組織片を
水で十分に洗浄した後、７０％エタノール水溶液に数秒
間浸漬し、滅菌水で洗浄した後、５％次亜塩素酸水溶液
等の殺菌剤に適当な時間浸漬して再び滅菌水により残存
殺菌剤を完全に洗い流すことによって殺菌を行なうこと
ができる。

このようにして殺菌した組織片を例えば５■ｍ角程度に
切断し、寒天培地に置床し、２０℃ないし３０℃の温度
下、好ましくは２５℃の暗所に置いて培養する。この際
、培養に用いる培地は公知の適当な基本培地、例えばＭ
Ｓ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ。

Ｔ、　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、　Ｆ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ−
Ｐｌａｎｔ、、　１５．４７３１１９６２）ｌ　に植物
成長調節物質として２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−ＤＪ等のオーキシン類やカイネチン等のサイト
カイニン類を含有させた寒天培地を用いることができる
。オーキシン類及びサイトカイニン類の培地中の含有量
は通常、それぞれ０．１−ｇ／　１２〜１０　ｖａｇｕ
Ｉ２及び５■ｇ／β以下である。

このようにして培養された組織片からは、約２〜４週間
でカルスが形成される。

カンゾウ植物の組織片から誘導されたカルスは、ｌａ）
インドール酢酸、インドール酪酸及びナフタレン酢酸か
ら成る群より選ばれる少なくともｌｆｉのオーキシン０
．１＋ｍｇ／Ｉ２ないし１０　ｍｇ　／　ｇ、ｆｂｌカ
イネチン０ないしＩＯＢ／βとを含む培地で培養するこ
とができる。基本培地としては、植物の組織培養に用い
られている公知の培地を用いることができ、例えば上記
したＭＳ培地の他、Ｎ１ｔｓｃｈ培地（Ｎｉｔｓｃｈ、
　　Ｊ、　　Ｐ、　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｂｏｔ、　　３
８゜５６６（１９５１）ｌ、　　ＢＳ培地（Ｇａｓｂｏ
ｒｇ、　Ｏ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　５０．１５１　（１
９６８１１等を用いることができる。

培養温度は２０℃ないし３０℃が好ましく。

特に好ましくは２５℃である。また、暗所にて培養する
ことが好ましい。

カルスを上記条件で２〜４週間培養すると、カルス表面
に分化組織が誘導される。なお、ここで言う分化組織と
は、不定根を形態的に分化する前の段階の組織若しくは
塊を意味する。

誘導された分化組織をさらに上記（ａｌ　（ｂｌの成分
を上記量含有する培地で上記と同様な条件下で培養する
ことにより、分化組織から不定根が再分化される。

上述のように、カルスからの分化組織の誘導に用いられ
る培地と分化組織からの不定根の誘導に用いられる培地
とは同じものであるから、分化組織が誘導された後も、
最初にカルスを置床した培地上でそのまま培養を続ける
ことにより不定根を得ることができる。この場合、培地
としては寒天栄養培地を用いることが好ましい、一方、
カルスから分化組織の誘導までを液体培地中での振盪培
養によって行ない、分化組織からの不定根の誘導を寒天
栄養培地上での静置培養によって行なうと、不定根の形
成率が特に良くなるので好ましい、なお、カルス誘導時
又は不定根誘導時の培養は継代培養によっても行なうこ
とができる。

上記のようにして再分化された不定根は、さらに、上記
した培地及び条件で培養を行なうことにより不定根のみ
を増殖させることができる。

本発明のグリシルリチンの製造方法は、植物組織培養に
よる物質の変換、いわゆる植物変換（ｐｌａｎｔ　ｂｉ
ｏｔｒａｎａｆｏｒｍａｔｉｏｎｌ能を利用してグリシ
ルリチンを産生ずる方法である。すなわち、カンゾウ不
定根が前駆物質と考えられるグリシルレチン酸をその配
糖体であるグリシルリチンに変換し、細胞内に蓄積させ
るものである。

上記のようにして得られたカンゾウ不定根は、適当な基
本培地、例えばＭＳ培地に植物成長調節物質としてイン
ドール酢酸等のオーキシン類やカイネチン等のサイトカ
イニン類及びグリシルリチンの前駆体であるグリシルレ
チン酸を含有させた液体培地を用いて培養することがで
きる。

オーキシン類及びサイトカイニン類の培地中の含有量は
、通常それぞれ０．１　Ｂ／１−１０　Ｂ／ｌ及び５ｍ
ｇ八以へが好ましい、また、グリシルレチン酸の培地中
の含有量は、ｌ　ｍｇ／ｌないし１　　ｇ／ｌが好まし
く、さらに好ましくは、　５０　ｍｇ／ｌないし３００
■ｇ／ｌである。グリシルレチン酸は、培養の始めに液
体培地に加えても予め前培養した後に加えてもどちらで
も構わないが、無菌的に投与する。培養途中で投与する
場合は、培養開始後４日から１４日くらいが好ましい。

グリシルレチン酸を含む培地でのカンゾウ植物不定根の
培養は、静置培養でも行なうことができるが、振１培養
で行なうことが好ましい、また、光の照射についても特
に限定されないが、最初からグリシルレチン酸を含む液
体培地での培養は、暗所で２〜４週間、また、培養途中
でグリシルレチン酸を投与する場合には投与後１〜３週
間暗所で振盪培養を行なうことが好ましい、培養温度は
２０℃ないし３０℃が好ましく、特に好ましくは約２５
℃である。

培養終了後、カンゾウ植物不定根は回収し。

凍結乾燥させた後、粉砕する。粉砕したカンゾウ植物不
定根は、常法に従い溶媒抽出を行なうことによりグリシ
ルリチンを抽出することが出来る。

例えば、メタノール、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を
用いて順次抽出を行なうことができる。

［実施例１ 以下、この発明の実施例及び比較例を示し、この発明の
効果を具体的に説明する。

！ｉ亘ユ ウラルカンゾウ植物体より新鮮な葉又は茎を摘出し、水
で洗浄した後、７０％エタノール水溶液に数秒間浸漬し
、滅菌水で３回洗浄した０次に５％次亜塩素酸水溶液に
５〜１５分間浸漬して再度滅菌水で３回洗浄した。この
ようにして殺菌した組織を５Ｉｌ１１角程度の大きさに
切断し、これを１．０■ｇ／　１２の２．４−Ｄと０．
１　ｍｇｌ　ｉｔのカイネチンを含むＭＳ寒天培地（寒
天濃度０．９％）に置床し、２５℃、暗所下で３週間培
養することにより組織切片よりカルスが形成された。

次に該カルスを３週間毎に同培地で継代培養して増殖さ
せたもの、又は直接該カルスをインドール酢酸１０６／
ｌ、カイネチン０．１　ｍｇｌｌを含むＭＳ液体培地に
移植し、２５℃、暗所で回転振盪培養（１２０ｒｐｍｌ
　を行なった。２〜４遍間培養することにより、カルス
表面に分化組織が誘導された。

さらに、該分化組織を同組成のＭＳ寒天培地に移植して
２５℃、暗所にて培養することにより、７〜ｌＯ日後に
不定根が形成された。

該不定根をインドール酢酸１０　ｓｉｇ／ｌ　、カイネ
チン０．１■ｇ／ｌを含むＭＳ液体培地で２〜３週間毎
に継代したもの５．６ｇ（新鮮重量）をインドール酢酸
１０ｍｇｌβカイネチン０．１　ｍｇｌｌを含むＭＳ液
体培地（２５０ｍ１７５００■ｌフラスコ）に移植し、
２５℃、暗所下で往復振盪培養（８０〜９Ｏｒｐｍ）を
行なった。２週間前培養した後、７０％エタノール少量
に溶かしたグリシルレチン酸を培地中の最終濃度が５０
Ｂ／ｌとなるように無菌的に投与した。さらに、１週間
同条件で培養し不定根１８．３　ｇ　（新鮮重量）を得
た。

得られた培養不定根を凍結乾燥後、粉砕した。粉砕した
カンゾウ不定根はメタノールにて抽出した。抽出物をさ
らに酢酸エチル、ｎ−ブタノールにより溶媒分離し、ブ
タノール抽出物６４．７１ｍｇを得た。

得られたブタノール抽出物を高速液体クロマトグラフィ
ー（Ｗａｔｅｒｓ社製）により下記の条件で分析を行な
った。

カラム：　ＯＤＳカラム　（４，６＊　Ｘ　２５０ｍｍ
：センシュー科学社製） 溶出溶媒ニアセトニトリル＝２％酢酸　（３６：６４１
流速：ｌ　■ｌ／ｓｉｎ 検出波長：　２４８　ｎｍ その結果を図１に示した。これから明らかなように、本
実施例の培養カンゾウ不定根にグリシルリチンが含有さ
れていることが確認された。また、グリシルリチンの収
量は乾燥重量当たりｌ、３５１１ｇであった。これは、
本実施例でグリシルリチン培養に用いた元の不定根に含
まれる量（０，３５ｗ＋ｇｌに比べ約３．９倍の量であ
る。

！五亘ユ 実施例１で継代培養したカンゾウ不定根４．８　ｇ　（
新鮮重量）ライントール酢１１１１０　ｍｇｌｌ　。

カイネチン０．１　Ｂ／ｌ及びグリシルレチン酸５０Ｂ
／ｌを含むＭＳ液体培地　（２５０ｍｌ培地１５００■
ｌフラスコ）に移植し、実施例１と同様の条件で３週間
培養して不定根１６．７　ｇ　（新鮮重量）を得た。さ
らに、得られた不定根を凍結乾燥後、粉砕した。粉砕し
たカンゾウ不定根は、実施例１と同様にして溶媒抽出を
行ないブタノール抽出物４６．１Ｂを得た。得られたブ
タノール抽出物は、実施例１と同様の方法により高速液
体クロマトグラフィーを行なった。

その結果１本実施例の培養カンゾウ不定根にグリシルリ
チンが含有されていることが確認された。また、グリシ
ルリチンの収量は乾燥重量当たり１．１２ｍｇであった
。これは、本実施例でグリシルリチン培養に用いた元の
不定根に含まれる量（０，３５ｍｇｌ　に比べ約３．２
倍の量である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カンゾウ植物不定根をグリシルレチン酸を含む培
   地で培養し、該不定根からグリシルリチンを回収する工
   程を含むグリシルリチンの製造方法。
2. （２）前記グリシルレチン酸の培地中の濃度は、１ｍｇ
   ／ｌないし１ｇ／ｌである請求項１記載の方法。