CN117448254B - 一种光果甘草干细胞的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域。本发明提供一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养。对于所述诱导培养将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸和吲哚‑3‑丁酸的B5培养基进行暗培养。另外，所述继代培养可以是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4‑二氯苯氧乙酸的B5培养基和含吲哚乙酸和吲哚‑3‑丁酸的B5培养基进行交替暗培养。另外，所述生物反应器培养可以是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸和吲哚‑3‑丁酸的B5液体培养基进行培养。该方法培养得到的光果甘草干细胞具有高含量的光甘草定，其冻干粉为具有护肤效果优益的原料成分。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种光果甘草干细胞的制备方法及用途。
背景技术
光果甘草(Glycyrrhizaglabra)为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)的多年生草本植物，是最古老的药材之一，传统上用于治疗咳嗽、支气管炎、急性腹痛和哮喘，甘草含有多种天然活性成分，如光甘草定、甘草苷、异甘草苷、甘草酸、甘草素等。化妆品中添加了光果甘草提取物具有美白、抗炎、抗氧化和保湿等功效，富含多种天然活性成分的光果甘草被广泛用于制药、化妆品和食品行业。光甘草定是从甘草根部提取的天然化合物，可以通过显著抑制酪氨酸酶活性和清除自由基达到美白肌肤的功效，是公认最安全的祛斑美白成分，也是世界上最昂贵的天然祛斑美白成分，享有“美白黄金”称号。
光果甘草有广泛的需求领域造成了对光果甘草消费的增加，虽然通过人工驯化的种植的方式可缓解对光果甘草消费的需求，但人工栽培光果甘草存在生长周期长、次生代谢产物含量低，并且产量和品质不稳定，有农残风险。对于这类生境特殊、培育周期长的植物来说，植物细胞培养是获取次生代谢产物相对可行的选择，但传统的愈伤组织细胞培养，因长期培养会出现衰退、褐化等现象限制了其大规模工业化生产，而植物干细胞具有生长周期短、培养条件可控、环境友好和目标次生代谢产物含量高且稳定等特点。通过培养光果甘草干细胞株系，可以实现大规模的生产和供应稳定的光果甘草成分，开发具有护肤功效的原料成分，提供天然、高效和温和的护肤品选项，满足消费者对于美白和舒缓皮肤的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种光果甘草干细胞培养方法，该方法培养得到的光果甘草干细胞具有高含量的光甘草定，且最终的冻干粉能做为具有护肤功效优益的原料成分。
具体的，一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养。
另一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的B5培养基和含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行交替暗培养。
还在一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的质量比为1：0.1～10。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的质量比为1：0.8～1.2。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的质量比为1：1。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)浓度是0.1-10mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)浓度是0.1-10mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)浓度是1-3mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)浓度是1-3mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(IAA)浓度是2mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)浓度是2mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，所述含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基是包含0.1-10.0mg/L吲哚乙酸、0.1-10.0mg/L吲哚-3-丁酸、30-40g/L蔗糖、75-100mg/L抗坏血酸、150-200mg/L柠檬酸和7-10g/L琼脂的B5培养基，pH值5.8-6.2。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，所述吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基是包含1-3mg/L吲哚乙酸、1-3mg/L吲哚-3-丁酸、30-40g/L蔗糖、75-100mg/L抗坏血酸、150-200mg/L柠檬酸和7-10g/L琼脂的B5培养基。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养；其中，所述吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基是包含2mg/L吲哚乙酸、2mg/L吲哚-3-丁酸、30g/L蔗糖、75mg/L抗坏血酸、200mg/L柠檬酸和7g/L琼脂的B5培养基。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，然后用无菌水冲洗，并用柠檬酸冲洗，将根尖接种于含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行暗培养。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，是使用0.5-0.8mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡20-30h处理。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理。
在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，用柠檬酸冲洗是使用150-250mg/L柠檬酸冲洗；优选地，使用200mg/L柠檬酸冲洗。
在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的B5培养基和含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是0.1-10.0mg/L，吲哚乙酸(IAA)的浓度是0.1-10.0mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)的浓度是0.1-10.0mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的B5培养基和含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1-3mg/L，吲哚乙酸(IAA)的浓度是1-3mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)的浓度是1-3mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的B5培养基和含吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1.5mg/L，吲哚乙酸(IAA)的浓度是2mg/L，吲哚-3-丁酸(IBA)的浓度是2mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含0.1-10.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30-40g/L蔗糖和7-10g/L琼脂的B5培养基，其pH值5.8-6.2，继代暗培养7-14天；再使用含0.1-10.0mg/L吲哚乙酸、0.1-10.0mg/L吲哚-3-丁酸、30-40g/L蔗糖、75-100mg/L抗坏血酸、150-200mg/L柠檬酸和7-10g/L琼脂的B5培养基交替培养7-14天。
在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的B5培养基，其pH值5.8-6.2，继代暗培养14天；再使用含2mg/L吲哚乙酸、2mg/L吲哚-3-丁酸、30g/L蔗糖、75mg/L抗坏血酸、200mg/L柠檬酸和7g/L琼脂的B5培养基交替培养14天。
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是4-8mg/L、吲哚乙酸的浓度是0.1-10.0mg/L、吲哚-3-丁酸的浓度是0.1-10.0mg/L；
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是4-6mg/L、吲哚乙酸的浓度是1-3mg/L、吲哚-3-丁酸的浓度是1-3mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是5mg/L、吲哚乙酸的浓度是2mg/L、吲哚-3-丁酸的浓度是22mg/L。
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养；其中，含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基为含有5mg/L大豆苷元、0.1-10.0mg/L吲哚乙酸、0.1-10.0mg/L吲哚-3-丁酸、30-40g/L蔗糖、75-100mg/L抗坏血酸、150-200mg/L柠檬酸和7-10g/L琼脂的B5液体培养基，pH值5.8-6.2。
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基进行培养；其中，含有大豆苷元、吲哚乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)的B5液体培养基为含有5mg/L大豆苷元、1-3mg/L吲哚乙酸、1-3mg/L吲哚-3-丁酸、30g/L蔗糖、75mg/L抗坏血酸、200mg/L柠檬酸和7g/L琼脂的B5液体培养基，pH值5.8-6.2。
在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内培养，培养液是含有大豆苷元(5mg/L)、吲哚乙酸(2.0mg/L)、吲哚-3-丁酸(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5液体培养基，pH值5.8-6.2，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞。
在这些方法的一些实施例中，在诱导培养前，光果甘草幼苗采用如下方式获取：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/L GA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养。
在这些方法的一些实施例中，培养温度保持在(27±2)℃。
有益效果
相比现有技术，本发明的某一个实施例具有至少一个以下的有益效果：
(1)本发明进行光果甘草干细胞的分离制备培养，实现光果甘草干细胞的诱导和大规模培养，突破了传统愈伤组织培养中培养物对剪切力敏感、次生代谢产物低、遗传不稳定等关键技术瓶颈。
(2)本发明通过对光果甘草干细胞放大培养、提取和冻干处理，成功获得了光果甘草干细胞冻干粉，为护肤品的研发与生产提供新的原料来源和技术支持。
术语说明
现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％,N+/-2％,N+/-3％,N+/-5％,N+/-7％,N+/-8％,N+/-10％,N+/-15％或N+/-20％值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
实施例1
光果甘草干细胞的培养：
(1)外植体的选取和消毒：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/LGA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养至获得光果甘草无菌苗。
(2)诱导培养：选择生长状态良好的光果甘草无菌幼苗，切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理，然后用无菌水冲洗5次，并用200mg/L柠檬酸冲洗，将根尖接种于含IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)诱导，温度保持在(27±2)℃进行暗培养14d获得光果甘草干细胞。
(3)继代培养：将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含2,4-D(1.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)继代培养14d，黑暗条件下培养温度保持在(27±2)℃；后使用含IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基交替培养14d。
(4)生物反应器培养：将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至微型生物反应器内培养，培养液为含有大豆苷元(5mg/L)、IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)、琼脂(7g/L)的B5液体培养基(pH值5.8-6.2)，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞，进行光甘草定含量测定，结果表明光甘草定含量占干细胞干重的0.41％。
对比例1
光果甘草干细胞的培养：
(1)外植体的选取和消毒：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/LGA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养至获得光果甘草无菌苗。
(2)诱导培养：选择生长状态良好的光果甘草无菌幼苗，切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理，然后用无菌水冲洗5次，并用200mg/L柠檬酸冲洗，将根尖接种于含IAA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)诱导，温度保持在(27±2)℃进行暗培养14d获得光果甘草干细胞。
(3)继代培养：将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含2,4-D(1.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)继代培养14d，黑暗条件下培养温度保持在(27±2)℃，后使用含IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基交替培养14d。
(4)生物反应器培养：将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至微型生物反应器内培养，培养液为含有大豆苷元(5mg/L)、IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5液体培养基(pH值5.8-6.2)，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞，进行光甘草定含量测定，结果表明光甘草定含量占干细胞干重的0.34％。
对比例2
(1)外植体的选取和消毒：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/LGA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养至获得光果甘草无菌苗。
(2)诱导培养：选择生长状态良好的光果甘草无菌幼苗，切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理，然后用无菌水冲洗5次，并用200mg/L柠檬酸冲洗，将根尖接种于含IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)诱导，温度保持在(27±2)℃进行暗培养14d获得光果甘草干细胞。
(3)继代培养：将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含2,4-D(1.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)继代培养14天，黑暗条件下培养温度保持在(27±2)℃。
(4)生物反应器培养：将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至微型生物反应器内培养，培养液为含有大豆苷元(5mg/L)+IAA(2mg/L)+IBA(2mg/L)+蔗糖(30g/L)+抗坏血酸(75mg/L)+柠檬酸(200mg/L)+琼脂(7g/L)B5液体培养基(pH值5.8-6.2)，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞，，进行光甘草定含量测定，结果表明光甘草定含量占干细胞干重的0.31％。
对比例3
(1)外植体的选取和消毒：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/LGA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养至获得光果甘草无菌苗。
(2)诱导培养：选择生长状态良好的光果甘草无菌幼苗，切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理，然后用无菌水冲洗5次，并用200mg/L柠檬酸冲洗，将根尖接种于含IAA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)诱导，温度保持在(27±2)℃进行暗培养14d获得光果甘草干细胞。
(3)继代培养：将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含2,4-D(1.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)继代培养14d，黑暗条件下培养温度保持在(27±2)℃，后使用含IAA(2.0mg/L)、IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基交替培养14d。
(4)生物反应器培养：将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至微型生物反应器内培养，培养液为含有大豆苷元(5mg/L)、IAA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5液体培养基(pH值5.8-6.2)，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞，进行光甘草定含量测定，结果表明光甘草定含量占干细胞干重的0.35％。
对比例4
(1)外植体的选取和消毒：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/LGA3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到MS基本培养基(蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养至获得光果甘草无菌苗。
(2)诱导培养：选择生长状态良好的光果甘草无菌幼苗，切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理，然后用无菌水冲洗5次，并用200mg/L柠檬酸冲洗，将根尖接种于含IAA(3.5mg/L)、IBA(0.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)诱导，温度保持在(27±2)℃进行暗培养14d获得光果甘草干细胞。
(3)继代培养：将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含2,4-D(1.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂(7g/L)的B5培养基(pH值5.8-6.2)继代培养14d，黑暗条件下培养温度保持在(27±2)℃；后使用含IAA(3.5mg/L)、IBA(0.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)和琼脂(7g/L)的B5培养基交替培养14d。
(4)生物反应器培养：将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至微型生物反应器内培养，培养液为含有大豆苷元(5mg/L)、IAA(3.5mg/L)、IBA(0.5mg/L)、蔗糖(30g/L)、抗坏血酸(75mg/L)、柠檬酸(200mg/L)、琼脂(7g/L)的B5液体培养基(pH值5.8-6.2)，在CO2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞，进行光甘草定含量测定，结果表明光甘草定含量占干细胞干重的0.33％。
实施例2
光甘草定含量测定
采用HPLC法测定光果甘草干细胞中光甘草定的含量
使用高效液相色谱仪Agilent 1100进行光甘草定含量测定，液相色谱分析条件如下：a)色谱柱：ZORBAX StableBond C18(4.6x 250mm,5μm)；b)流速：1.0mL/min；c)流动相:乙腈：水＝80：20，用0.22μm的膜过滤器过滤；d)进样量：10μL；e)柱温：25℃；f)波长：280nm。
采用HPLC法测定光果甘草干细胞中光甘草定含量，结果表明采用本发明所述方法培植的光果甘草干细胞中光甘草定含量占干细胞干重的0.41％，光果甘草本身种植不易，光甘草定更是难得，光甘草定在3-5年生长期的光果甘草中含量通常是在0.1～0.3％，本发明所述方法培植的光果甘草干细胞中光甘草定含量提高了30％以上。本发明具有制备周期短、不受地域、时间和气候限制的优势，使得植物干细胞培养方式生产光甘草定工业化成为一种可能。
实施例3
制备冻干粉
将微型生物反应器内的培养液通过过滤器过滤，去掉培养基，将截留的细胞取出，放入-80℃超低温冷冻3h，取出后室温解冻40min，重复3次；最后一次解冻后使用超声波细胞破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，于Hei-VAPCore HLG3数显旋转蒸发仪内浓缩，得到光果甘草干细胞浓缩物；采用BCA法对获得的光果甘草干细胞浓缩物进行蛋白质浓度测定，加入无菌水调节至蛋白终浓度为50.0μg/ml，加入光果甘草干细胞浓缩物总质量4-6％的甘露醇，在温度为-20～-35℃，真空度为50Pa的条件下冻干48h，制得光果甘草干细胞冻干粉，做为具有护肤功效的原料成分。
本发明光果甘草干细胞浓缩物中光甘草定含量提升，因此本发明所述的光果甘草干细胞冻干粉在美白肌肤等功效具有更优和明显的效果。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (8)
1. 一种光果甘草干细胞培养方法，包括以下步骤制得：1）诱导培养；2）继代培养；3）生物反应器培养；其特征在于，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5培养基进行暗培养，获得光果甘草干细胞；其中，pH值5.8-6.2；所述吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5培养基是包含1-3 mg/L 吲哚乙酸、1-3 mg/L 吲哚-3-丁酸、30-40 g/L蔗糖、75-100 mg/L抗坏血酸、150-200 mg/L柠檬酸和7-10 g/L琼脂的B5培养基；
所述继代培养是将诱导培养分离出来的光果甘草干细胞接入含1-3 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30-40 g/L蔗糖和7-10 g/L琼脂的B5培养基进行培养，获得生长旺盛的光果甘草干细胞，其pH值5.8-6.2，继代暗培养7-14天；再使用含1-3 mg/L吲哚乙酸、1-3 mg/L吲哚-3-丁酸、30-40 g/L蔗糖、75-100 mg/L抗坏血酸、150-200 mg/L柠檬酸和7-10 g/L琼脂的B5培养基交替培养7-14天；
所述生物反应器培养是将生长旺盛的光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5液体培养基进行培养；其中，含有大豆苷元、吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5液体培养基为含有5 mg/L大豆苷元、0.1-10.0 mg/L吲哚乙酸、0.1-10.0 mg/L 吲哚-3-丁酸、30-40 g/L蔗糖、75-100 mg/L抗坏血酸、150-200 mg/L柠檬酸和7-10 g/L琼脂的B5液体培养基，pH值5.8-6.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5培养基进行暗培养；吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的质量比为1：0.8~1.2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的质量比为1：1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，然后用无菌水冲洗，并用柠檬酸冲洗，将根尖接种于含吲哚乙酸和吲哚-3-丁酸的B5培养基进行暗培养。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，是使用0.5-0.8 mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡20-30 h处理。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用0.6 mol/L蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24 h处理。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用柠檬酸冲洗是使用150-250 mg/L柠檬酸冲洗。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用200 mg/L柠檬酸冲洗。
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