CN101715732A - 通过组织培养生产台湾金线莲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括植物体的选择及无菌处理、丛生芽诱导培养和大规模培养三个环节，其技术的关键在于导培养和大规模培养两个阶段采用了两种不同的培养基，诱导培养基为：H培养基+蔗糖10～50g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0；大规模培养基为：B5培养基+蔗糖20～40g/L+琼脂6～8g/L+活性炭2.0～3.0g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5。该方法易操作，生产成本低，产量高，品质好，不污染环境，可以实现批量生产。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法。
背景技术
台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hayata)是一种濒危珍稀的药用植物。药用全草，素有“药王”之称，是我国传统的珍贵药材。其性平味甘，具有清热凉血、祛风利湿的功效，主治咯血、支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、小儿急惊风、毒蛇咬伤等。2005版中国药典尚未对金线莲进行收载。
台湾金线莲是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。
自然条件下台湾金线莲种子难以萌发(萌发率低于5％)。台湾金线莲植株矮小，根系不发达，再生能力差。台湾金线莲由种子到开花需要3～4年，常需与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生台湾金线莲资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生台湾金线莲濒临灭绝。
目前，国内外学者开展了对野生台湾金线莲的初步研究，包括化学成分，药理活性，人工种植等方面的研究，研究成果不多。而台湾金线莲的培养主要集中在组织诱导、基本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决台湾金线莲诱导和增殖中存在的疑点和难点，从而影响了台湾金线莲的深入研究和应用。
天然台湾金线莲已作为濒临灭绝的植物种受到保护，严禁采摘。为此研究台湾金线莲的人工培养技术，实现产业化显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快，总黄酮含量高的通过组织培养生产台湾金线莲的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
选择6～8月份生长的的台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hayata)野生植物，除去根和叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5～1.5cm带茎节的台湾金线莲小段组织；
b、丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10～60天，培养温度：10～35℃，光照时间：0～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖10～50g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0；
c、大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10～60天，培养温度：10～35℃，光照时间：0～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖10～50g/L+琼脂4～10g/L+活性炭0.1～5.0g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0。
作为本发明通过组织培养生产台湾金线莲的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。
所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20～50天，培养温度：20～30℃，光照时间：8～16小时/天，光照强度：50～100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖20～40g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5；
所述的大规模培养：培养周期：20～50天，培养温度：20～30℃，光照时间：8～16小时/天，光照强度：50～100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖20～40g/L+琼脂6～8g/L+活性炭2.0～3.0g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5。
植物体的的无菌处理是本发明的重要技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤：
a)将选取的台湾金线莲植株，用自来水冲洗干净除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；
b)将除去了根和叶的茎段植物体用70～80％的酒精浸泡20～40秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
c)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3～0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3～6分钟，用无菌水冲洗4～5次，再用滤纸吸干无菌水；
d)无菌条件下将氯酸钠消毒的茎段剪成0.5～1.5cm带茎节的小段。
本发明的优点在于：该方法易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生产。选用配方合理的诱导培养基，诱导出的丛生芽比例达到98％以上，通过两段培养的方式再生植株产量大幅度提高，和野生台湾金线莲比较总黄酮含量提高5倍以上。通过本发明方法生产台湾金线莲，不变性，产量大，成本低，周期短，极具市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
a)选择7月份生长的的台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hayata)野生植物，用自来水冲洗干净除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将除去了根和叶的茎段植物体用75％的酒精浸泡30秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗5次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯酸钠消毒的茎段剪成1cm左右带茎节的台湾金线莲小段；
b、丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：30天，培养温度：28℃，光照时间：24小时/天，光照强度：100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖45g/L+α-萘乙酸2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，pH值为5.0；
c、大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：45天，培养温度：28℃，光照时间：24小时/天，光照强度：100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖15.0g/L+琼脂4.5g/L+活性炭2.0g/L+α-萘乙酸1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0mg/L，pH值为5.0。
实施例2：一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
a)选择8月份生长的的台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hayata)野生植物，用自来水冲洗干净除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将除去了根和叶的茎段植物体用78％的酒精浸泡28秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.6％次氯酸钠溶液浸泡消毒4分钟，用无菌水冲洗4次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯酸钠消毒的茎段剪成1cm左右带茎节的台湾金线莲小段；
b、丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：40天，培养温度：25℃，光照时间：15小时/天，光照强度：80μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖35g/L+α-萘乙酸1.8mg/L+6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，pH值为6.0；
c、大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：40天，培养温度：30℃，光照时间：15小时/天，光照强度：50μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖22g/L+琼脂7.0g/L+活性炭3.0g/L+α-萘乙酸2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，pH值为6。
实施例3：对野生台湾金线莲、实施例1和实施例2培养得到的台湾金线莲再生植株总黄酮进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的芦丁对照品9.9mg，置5mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为1.98mg·mL-1的芦丁对照品溶液，备用。精密量取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL带刻度试管中，加水补至5mL；加5％亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6分钟；加10％硝酸铝溶液1.0mL，放置6分钟；加4％氢氧化钠溶液10.0mL，加水定容至刻度，混匀，放置15分钟。于510nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程A＝0.0097C+0.0037(r＝0.9999)。芦丁检测浓度在7.92～79.20μg/mL范围内线性关系良好。
(2)供试品溶液的制备
台湾金线莲试管苗经干燥后粉碎，过80目筛，称取0.25g，置索氏提取器中，加20mL石油醚提取3小时，弃去石油醚提取液，药渣晾干，用20mL70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，旋转蒸发至小体积，用70％乙醇定容至10mL，作为供试品溶液，备用。
(3)测定方法精密量取供试品溶液3mL，置25mL带刻度试管中，按对照品的测定方法于510nm波长处测定样品的吸光度。
通过该方法对野生台湾金线莲与两个实施例样品检测结果如下：
野生台湾金线莲与两个实施例总黄酮含量的比较
试验结果证明，采用本发明的方法生产的台湾金线莲试管苗比野生台湾金线莲的总黄酮含量高出5倍左右。
实施例4：采用MS培养基、B5培养基和本发明的诱导培养基分别对经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，试验结果如下：
不同培养基诱导比较
试验结果证明，采用本发明的诱导培养基对过无菌处理后的台湾金线莲小段组织进行诱导培养，丛生芽鲜重和诱导率显著提高。
实施例5：分别采用单纯的诱导培养基、单纯的大规模培养基和本发明的诱导培养基+大规模培养基两步法培养方法，进行组织培养生产台湾金线莲试验，除了培养基和培养周期不同以外，其它试验条件与实施例1相同，试验结果如下：
采用不同方式的培养基对台湾金线莲产量的影响
试验证明，采用本发明的通过组织培养生产台湾金线莲的方法比单纯使用诱导培养基培养、单纯使用大规模培养基培养产量增加1～2倍。
Claims (3)
1.一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
选择6～8月份生长的的台湾金线莲野生植物，除去根和叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5～1.5cm带茎节的台湾金线莲小段组织；
b、丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10～60天，培养温度：10～35℃，光照时间：0～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖10～50g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0；
c、大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10～60天，培养温度：10～35℃，光照时间：0～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖10～50g/L+琼脂4～10g/L+活性炭0.1～5.0g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0。
2.按照权利要求1所述的通过组织培养生产台湾金线莲的方法，其特征在于：所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20～50天，培养温度：20～30℃，光照时间：8～16小时/天，光照强度：50～100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：H培养基+蔗糖20～40g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5；所述的大规模培养：培养周期：20～50天，培养温度：20～30℃，光照时间：8～16小时/天，光照强度：50～100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：B5培养基+蔗糖20～40g/L+琼脂6～8g/L+活性炭2.0～3.0g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5。
3.按照权利要求1或2所述的通过组织培养生产台湾金线莲的方法，其特征在于植物体的无菌处理方法包括如下步骤：
a)将选取的台湾金线莲植株，用自来水冲洗干净除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；
b)将除去了根和叶的茎段植物体用70～80％的酒精浸泡20～40秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
c)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3～0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3～6分钟，用无菌水冲洗4～5次，再用滤纸吸干无菌水；
d)无菌条件下将氯酸钠消毒的茎段剪成0.5～1.5cm带茎节的小段。
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