CN101124890B - 金线莲组培苗培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及金线莲的组培方法及其应用。本发明提供了一种金线莲组培苗培养方法：以野生金线莲为原材料进行诱导培养，通过无激素培养，获得金线莲组培苗无菌培养系，建立适合大规模生产的组培苗培养系统，其培养物的主要有效成分(多糖、氨基酸)与野生金线莲接近且稳定。主要内容包括组培苗培养基的配制；组培苗培养条件；组培苗栽培技术及用途。解决了野生金线莲的自然资源匮乏的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及金线莲的组培苗培养方法及其应用。
背景技术
金线莲为兰科花叶开唇兰属多年生的珍稀药用植物，全草均可入药。具有清热解毒、固肾平肝、降血糖等功效，近来年的药理学研究表明，金线莲有明显的治疗乳腺癌的作用。由于其营养体繁殖缓慢，种胚发育不全，在自然状态下难以繁殖，造成野生金线莲的自然资源储量日见减少，已成为濒危的药用植物。利用组织培养技术对金线莲进行无性快速繁育，是解决金线莲资源匮乏的关键。目前，有关金线莲的研究备受人们的关注，虽有一些金线莲组织培养的研究，但试管苗的无激素培养及其栽培苗应用未见报道，为了确保金线莲栽培苗食用的安全性，需要寻找一种金线莲组培苗无激素培养的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在于提供一种金线莲组培苗无激素培养的方法，用该方法培育出来的金线莲繁殖快速、适合大规模生产，食用安全，有效成分(多糖、氨基酸)含量与野生型金线莲相似，且相对稳定，解决其营养体繁殖缓慢及生产应用中资源匮乏问题。
本发明的一方面，提供了一种金线莲组培苗培养方法，包括下列步骤：
a)培养基配置：
I)培养基配方为：
MS+生长素+细胞分裂素
生长素：取自萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)中的一种或几种，含量为0.1-2mg/L，优选0.1-0.5mg/L；
细胞分裂素：取自6-苄基氨基嘌呤(BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)中的一种或几种，含量为0.1-2mg/L，优选0.1-0.5mg/L；
II)按I)配方配置培养基，调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，加入8.8-9.0％的琼脂，常规高压灭菌20分钟；
b)选择野生金线莲茎段或茎尖为种源，灭菌后接种于按步骤a)配制的固体培养基中进行诱导培养，培养条件为：光照(500-3000lx)12小时/天，温度20~26℃；
c)经诱导形成的再生芽依次置于生长素和细胞分裂素浓度从高到低再到零的驯化培养基上进行培养(递减梯度0.1~0.5mg/L)，每个梯度培养30天，培养温度20~26℃，光照(500-3000lx)12小时/天，直至培养基中生长素与细胞分裂素浓度为0；
d)从步骤c)的无激素培养基上选取组培苗进行继代培养(每月一次)，优选生长快且健壮的苗。
本发明的另一方面，还提供了按上述方法获得的组培苗的大田栽培技术，包括下列步骤：
a)组培苗移栽：
清水冲洗掉组培苗根部的培养基后，再用0.25-0.5％多菌灵溶液浸10分钟后移栽至有遮荫棚的基质(疏松、透气、湿润)中；
b)组培苗栽培条件：
温度：20～25℃
水分：相对湿度为75～85％
光照：自然散射光
基质：要求疏松、透气、湿润、弱酸性
用黄豆饼发酵后的稀释液定期浇肥：每隔10-15天。
本发明的第三方面，提供了用上述方法获得的金线莲栽培苗用于制备袋泡茶、饮料、和各种口服制剂(如：胶囊剂、片剂、颗粒剂)等的用途。上述制剂的主要成分含有：总多糖含量为：1-20％；总氨基酸含量为：1-10％。
本发明的其他方面，所属技术领域的人员可以通过现有技术得知。
本发明的优点在于：通过本发明培育出来的金线莲繁殖快速、适合大规模生产，有效成分(多糖、氨基酸)含量与野生型金线莲相似，且相对稳定，解决了自然条件下金线莲营养体繁殖缓慢而使得生产中资源匮乏的问题，由于最后实现了无激素培养，因此食用更安全。
具体实施方式
本发明中，“无激素培养”是指植物从有激素培养过渡到无激素培养。
本发明中，MS为一种基本培养基，其配方参见《蔬菜组织培养》(王纪方等编辑，上海科技技术出版社出版)。
本发明中，MS0是指不加激素的基本培养基。
本发明所述袋泡茶由下列方法制得：
取金线莲栽培苗，拣去杂质，喷70％的乙醇灭菌，挥尽乙醇，低温80℃干燥粉碎，取过60目未过100目的细粉，再经80℃恒温灭菌2小时的无菌食用干粉制成保健茶。
本发明所述饮料由下列方法制得：
取金线莲栽培苗，拣去杂质，加水减压回流提取，过滤，滤液加葡萄糖、防腐剂、矫味剂充分溶解后，加水稀释至总量，过滤、灭菌，灌装后即得。
本发明所述口服剂是由下列方法制得：
取金线莲栽培苗，拣去杂质，加水减压回流提取，合并提取液，真空浓缩干燥，得到浸膏粉碎(100目～200目)，加入常用辅料，充分混合，制成颗粒，即得颗粒剂；将颗粒填入空胶囊中，即得胶囊剂；颗粒直接压成片，即得片剂；片子薄膜包衣，即得薄膜包衣片。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：金线莲再生苗的培养
以野生金线莲茎段或茎尖为材料，用70％的医用乙醇浸泡约5分钟，随后转移至10％次氯酸钠水溶液中进行消毒，无菌水漂洗干净后接种于高温灭菌过的MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L固体培养基上，培养条件为：光照(1500lx)12小时/天，温度25℃进行培养，30天后得金线莲再生芽。
实施例2：金线莲组培苗无激素快速繁殖
将实施例1得到的再生芽依次置于激素浓度从高到低再到零的驯化培养基上进行培养。
取再生芽接种于MS+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L+ZT0.1mg/L培养基上进行培养，培养30天，培养温度20~26℃，光照(1500lx)12小时/天。
取上述组培苗在MS0培养基上进行培养，培养30天，培养温度20~26℃，光照(1500lx)12小时/天。
最后，从无激素培养基上选取生长快且健壮的苗进行继代培养(每月一次)。
实施例3：金线莲组培苗的大田栽培
用清水冲洗掉实施例2获得的组培苗根部的培养基后，再用0.25％多菌灵溶液浸10分钟后移栽至有遮荫棚的基质(疏松、透气、湿润)中，保持生长温度在20～25℃，相对湿度在75～85％的小环境下生长，并注意棚内通风换气。实施例4：金线莲组培苗与野生金线莲有效成分多糖和氨基酸比较：
(1)总多糖：
金线莲组培苗(实施例2获得)与野生金线莲多糖含量相似(测定方法：本室测定；采用分光光度法，具体操作方法由《保健食品功效成分检测方法》(王光亚主编，轻工业出版社出版)完全公开)，分别为：15.4％和13.17％。
(2)氨基酸含量：
对人体必须18种氨基酸按国家标准GB5009.124(2003年)方法进行测定，结果总氨基酸含量金线莲栽培苗(实施例2获得)高于野生金线莲，分别为：9.17％和6.26％。
实施例5：金线莲栽培苗的应用
取金线莲栽培苗，拣去杂质，喷70％的乙醇灭菌，挥尽乙醇，低温80℃干燥粉碎，取过60目未过100目的细粉，再经80℃恒温灭菌2小时的食用干粉制成保健茶。多糖含量为：13.8％，总氨基酸含量为：8.17％。
Claims (4)
1.一种金线莲组培苗培养方法，其特征包括下列步骤：
a)培养基配置：
I)培养基配方为：
MS+生长素+细胞分裂素：MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L；
II)按I)配方配置培养基，调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，加入重量百分比8.8-9.0％的琼脂，常规高压灭菌；
b)选择野生金线莲茎段或茎尖为种源，灭菌后接种于按步骤a)配制的固体培养基中进行诱导培养，培养条件为：以500-3000 1x的光照12小时/天，温度20~26℃；
c)经诱导形成的再生芽依次置于生长素和细胞分裂素浓度从高到低再到零的驯化培养基上进行培养，生长素浓度递减梯度为0.1~0.5mg/L，细胞分裂素浓度递减梯度为0.1mg/L，每个梯度培养30~40天，培养温度20~26℃，以500-3000 1x的光照12小时/天，直至培养基中生长素与细胞分裂素浓度为0；
d)从步骤c)的无激素培养基上选取生长快且健壮的组培苗进行继代培养。
2.如权利要求1所述的金线莲组培苗培养方法，其特征在于，还包括下列步骤：
e)组培苗移栽：
冲洗掉组培苗根部的培养基，用0.25-0.5％多菌灵溶液浸10分钟后移栽至有遮荫棚的基质中；
f)组培苗栽培条件：
温度：20～25℃
水分：相对湿度为75～85％
光照：自然散射光
基质：疏松、透气、湿润、弱酸性
用黄豆饼发酵后的稀释液定期浇肥：每隔10-15天。
3.一种如权利要求1或2所述金线莲组培苗培养方法获得的金线莲组培苗的应用，其特征在于将所述金线莲组培苗用于制备袋泡茶、饮料和口服制剂。
4.如权利要求3所述的金线莲组培苗的应用，其特征在于，所述的口服制剂选自：胶囊剂、片剂或颗粒剂中的一种。
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