CN110226519A - 一种茅苍术的快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种茅苍术的快速繁殖方法，所述方法包括以下步骤：外植体的选择与消毒：取茅苍术的茎尖，冲洗后进行消毒，即得外植体；不定芽诱导培养：将步骤一获得的外植体接种到不定芽诱导培养基中，培养得到不定芽；丛生芽培养：将步骤二得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，培养得到丛生芽植株；生根培养：将步骤三得到的丛生芽植株置于生根培养基中，培养得到带根的完整植株；炼苗与移栽。该方法非常适合工业化生产，配方效果佳、出芽快、培养时间短、植株生长旺盛、可操作性强、应用价值高的优点，具有投入少、产出多的特点。

Description

一种茅苍术的快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种茅苍术的快速繁殖方法。
背景技术
茅苍术(Atractylodes lancea(Thunb.)DC)，属于菊科苍术属，为多年生、宿根、草本植物，根状茎入药。茅苍术挥发油部分是传统用药的主要药用成分，主要包括β－桉叶醇、茅术醇、苍术素、苍术酮等，根茎中亦含有多糖、糖苷等一些水溶性活性成分以及铁、锌、镁、钙等多种人体必需的微量元素，药理药性研究表明茅苍术具有胃肠促进、抗缺氧、抗血糖、抗菌、抑制癌细胞增殖等作用。体外细胞试验表明，茅苍术还具有一定的抗HIV病毒的活性。除药用外，茅苍术还可用作各种饮料的添加剂和加工工艺品香包。茅苍术常规多采用种子繁殖、分株繁殖、根茎繁殖，存在繁殖系数不高、生长周期长、品种退化等问题，不能满足生产的需求，因而探索茅苍术快速繁殖技术具有重要意义。
现有技术中，专利文献CN105993956A中公开了一种茅苍术快速繁殖方法，其将茅苍术种子消毒后进行幼苗培养、丛生芽诱导、根诱导和移栽。选择的是外植体进行繁殖，该处理方法的茅苍术苗的成活率达93％以上。
专利文献CN105284612A中公开了一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，其将已成熟种子为外植体，经消毒后进行愈伤组织诱导培养、继代增殖培养、分化培养、壮苗生根培养、驯化培养、移栽。可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，运输方便，移栽成活率高等优势。
专利文献CN103960129A中公开了一种茅苍术组培快繁的方法，将茅苍术种子消毒后进行发芽培养、愈伤组织诱导、分化成苗、增殖培养、生根培养、炼苗移栽。通过组培快繁技术能在短期内获得大量无菌苗，解决茅苍术种苗问题，为大规模栽培生产和繁殖种苗提供有效途径。
上述专利文献均采用茅苍术的种子作为外植体。在自然界中，茅苍术自然结种率较低，种子饱和度较差，发芽率也较低，因此采用种子作为外植体取材量小且获取不易。而且采用上述专利文献的方法的繁殖时间较长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种茅苍术的快速繁殖方法，该方法非常适合工业化生产，配方效果佳、出芽快、培养时间短、植株生长旺盛、可操作性强、应用价值高的优点，具有投入少、产出多的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种茅苍术的快速繁殖方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取茅苍术的茎尖，冲洗后进行消毒，即得外植体；
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一获得的外植体接种到不定芽诱导培养基中，培养得到不定芽；
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，培养得到丛生芽植株；
步骤四、生根培养：
将步骤三得到的丛生芽植株置于生根培养基中，培养得到带根的完整植株。
优选地，步骤一中，所述消毒的具体步骤为：先将茎尖用75％乙醇消毒10-15s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒8-10min。
优选地，步骤二中，所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+0.5–2mg/L 6-BA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
优选地，步骤二中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天。
优选地，步骤三中，所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+0.5–2mg/L 6-BA+0.5–1.0NAA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
优选地，步骤三中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天。
优选地，步骤四中，所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.1–0.3mg/L IBA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
优选地，步骤四中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天。
优选地，所述方法还包括将步骤四获得的带根的完整植株进行炼苗与移栽的步骤，所述炼苗步骤具体为：将带根的完整植株在室内生长2-3d，然后将瓶盖旋至半开生长3–5d，再全开瓶盖并加入适量自来水生长5–7d；所述移栽的步骤具体为：将炼苗后的植株取出，洗净根部培养基，然后栽于基质中，培养一个月后再移栽大田。
优选地，所述移栽的步骤中，采用的基质为草炭与蛭石按质量比1:4混合成的基质；所述培养条件为：在通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为80–90％的培养室中培养。
本发明提供的茅苍术的快速繁殖方法能够快速高效地获得具有优良母性遗传性状的茅苍术植株，成本低、效率高、品种好，具有重要的农业、医药指导意义。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
第一，本发明克服了传统繁殖方法周期长的缺陷，采用茎尖作为外植体，可以直接诱导不定芽，缺少种子发芽、成苗的过程，在很短的时间内(130-135天)可以大规模繁殖所需要的种苗，大大缩短了快繁体系的培养时间；本方法以茅苍术植株的茎尖作为外植体，在植株生长过程中可随时获取，取材量大，且取材容易，获得无菌苗的过程简单，繁殖系数高，组培苗生根率达到90％以上，移栽成活率可达93％以上；
第二，在不定芽诱导培养基中添加6-BA，能够促进细胞分裂，促进生物体内物质的积累，促进侧芽的发生，消除顶端优势，导致不定芽的大量产生；
第三，在丛生芽诱导培养基中添加6-BA和NAA，NAA是一种广谱性植物生长调节剂，能够促进细胞分裂与扩大；6-BA和NAA的协同作用可以诱导丛生芽的大量产生；
第四，在生根培养基中添加吲哚丁酸(IBA)，能够诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进不定根的形成。
本发明的其他优点、目标和特征等部分将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的方法流程图；
图2为茅苍术快速繁殖体系；
图2A：茎尖诱导获得不定芽；图2B：不定芽诱导获得丛生苗；图2C：茅苍术单棵植株生根；图2D：茅苍术生根苗的根系；图2E：组培苗移栽至基质长成60d苗龄植株；标尺：10mm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种茅苍术的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取野外(大别山)生长健壮的茅苍术的茎尖，先用流水冲洗2h，之后在超净工作台中用75％乙醇消毒10s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒8min，消毒完成后用无菌水冲洗3次，最后用灭菌的滤纸吸去茎尖表面的水分，得到外植体。
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一中获得的外植体，接种到不定芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二中得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天，得到健壮的丛生芽植株；所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.5NAA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤四、生根培养：
将步骤三中得到的健壮的丛生芽植株置于生根培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天，得到带根的完整植株；所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.1mg/L IBA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤五、炼苗与移栽：
将步骤四中获得带根的完整植株在温度为25℃的组培室(组培瓶中带有植物时的培养环境)内炼苗2d，之后将瓶盖旋至半开炼苗3d，再全开瓶盖并加入适量自来水炼苗5d，将苗取出，洗净根部培养基，之后栽于草炭：蛭石＝1:4混合成的基质中，并置于通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为80％的培养室中培养一个月后移栽大田。
本实施例生根率达91％以上，移栽成活率可达93％以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖茅苍术，实验茅苍术的规模化生产。
实施例2
一种茅苍术的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取野外(大别山)生长健壮的茅苍术的茎尖，先用流水冲洗2h，之后在超净工作台中用75％乙醇消毒15s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒8min，消毒完成后用无菌水冲洗3次，最后用灭菌的滤纸吸去茎尖表面的水分，得到外植体。
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一中获得的外植体，接种到不定芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二中得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天，得到健壮的丛生芽植株；所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.5NAA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH5.8)。
步骤四、生根培养：
将步骤三中得到的健壮的丛生芽植株置于生根培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2000Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天，得到带根的完整植株；所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.2mg/L IBA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤五、炼苗与移栽：
将步骤四中获得带根的完整植株在温度为25℃的组培室(组培瓶中带有植物时的培养环境)内炼苗2d，之后将瓶盖旋至半开炼苗5d，再全开瓶盖并加入适量自来水炼苗5d，将苗取出，洗净根部培养基，之后栽于草炭：蛭石＝1:4混合成的基质中，并置于通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为85％的培养室中培养一个月后移栽大田。
本实施例生根率达91％以上，移栽成活率可达94％以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖茅苍术，实验茅苍术的规模化生产。
实施例3
一种茅苍术的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取野外(大别山)生长健壮的茅苍术的茎尖，先用流水冲洗2h，之后在超净工作台中用75％乙醇消毒15s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒8min，消毒完成后用无菌水冲洗5次，最后用灭菌的滤纸吸去茎尖表面的水分，得到外植体。
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一中获得的外植体，接种到不定芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二中得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天，得到健壮的丛生芽植株；所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+2mg/L 6-BA+1.0NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH5.8)。
步骤四、生根培养：
将步骤三中得到的健壮的丛生芽植株置于生根培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天，得到带根的完整植株；所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤五、炼苗与移栽：
将步骤四中获得带根的完整植株在温度为25℃的组培室(组培瓶中带有植物时的培养环境)内炼苗3d，之后将瓶盖旋至半开炼苗5d，再全开瓶盖并加入适量自来水炼苗7d，将苗取出，洗净根部培养基，之后栽于草炭：蛭石＝1:4混合成的基质中，并置于通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为90％的培养室中培养一个月后移栽大田。
本实施例生根率达93％以上，移栽成活率可达95％以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖茅苍术，实验茅苍术的规模化生产。
实施例4
一种茅苍术的快速繁殖方法(图1和图2)，包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取野外(大别山)生长健壮的茅苍术的茎尖，先用流水冲洗2h，之后在超净工作台中用75％乙醇消毒15s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒10min，消毒完成后用无菌水冲洗5次，最后用灭菌的滤纸吸去茎尖表面的水分，得到外植体。
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一中获得的外植体，接种到不定芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天，得到不定芽(图2A)；所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+1.0mg/L 6-BA+28g/L蔗糖+6.8g/L琼脂(pH5.8)。
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二中得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天，得到健壮的丛生芽植株(图2B)；所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5NAA+20g/L蔗糖+6.5g/L琼脂(pH 5.8)。
步骤四、生根培养：
将步骤三中得到的健壮的丛生芽植株置于生根培养基中，在培养温度22±2℃，光照强度2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天，得到带根的完整植株(图2C和2D)；所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH5.8)。
步骤五、炼苗与移栽：
将步骤四中获得带根的完整植株在温度为25℃的组培室(组培瓶中带有植物时的培养环境)内炼苗3d，之后将瓶盖旋至半开炼苗4d，再全开瓶盖并加入适量自来水炼苗5d，将苗取出，洗净根部培养基，之后栽于草炭：蛭石＝1:4混合成的基质中，并置于通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为85％的培养室中培养一个月后移栽大田。所述炼苗后栽于基质中培养60d苗龄植株如图2E所示。
本实施例生根率达96％以上，移栽成活率可达98％以上，达到最优值。该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖茅苍术，实验茅苍术的规模化生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一、外植体的选择与消毒：
取茅苍术的茎尖，冲洗后进行消毒，即得外植体；
步骤二、不定芽诱导培养：
将步骤一获得的外植体接种到不定芽诱导培养基中，培养得到不定芽；
步骤三、丛生芽培养：
将步骤二得到的不定芽置于丛生芽诱导培养基中，培养得到丛生芽植株；
步骤四、生根培养：
将步骤三得到的丛生芽植株置于生根培养基中，培养得到带根的完整植株。
2.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤一中，所述消毒的具体步骤为：先将茎尖用75％乙醇消毒10-15s，然后在含有0.1％Tween-20、质量分数为20％的升汞溶液中消毒8-10min。
3.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤二中，所述不定芽诱导培养基的配方为：MS+0.5–2mg/L 6-BA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
4.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤二中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养20天。
5.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤三中，所述丛生芽诱导培养基的配方为：MS+0.5–2mg/L 6-BA+0.5–1.0NAA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH5.8)。
6.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤三中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养40天。
7.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤四中，所述生根培养基的配方为：1/2MS+0.1–0.3mg/L IBA+20-30g/L蔗糖+5.0–7.0g/L琼脂(pH 5.8)。
8.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，步骤四中，所述培养条件为：在培养温度22±2℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间为12h/d，相对湿度为50％的条件下培养30天。
9.根据权利要求1所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤四获得的带根的完整植株进行炼苗与移栽的步骤，所述炼苗步骤具体为：将带根的完整植株在组培瓶内生长2-3d，然后将瓶盖旋至半开生长3–5d，再全开瓶盖并加入适量自来水生长5–7d；所述移栽的步骤具体为：将炼苗后的植株取出，洗净根部培养基，然后栽于基质中，培养一个月后再移栽大田。
10.根据权利要求9所述的茅苍术的快速繁殖方法，其特征在于，所述移栽的步骤中，采用的基质为草炭与蛭石按质量比1:4混合成的基质；所述培养条件为：在通风良好、光照12h/d、光照强度为1000–2000Lux、空气湿度为80–90％的培养室中培养。
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