CN105284618B - 一种香蕉无ms组织培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种香蕉无MS组织培养的方法，在香蕉丛生芽增殖阶段、继代阶段及生根培养阶段分别采用丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液，所述丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液均包含木薯酒精厌氧发酵液培养基。采用本发明的技术方案，使用木薯酒精厌氧发酵液替代基本培养基MS，不但对香蕉组织培养三个不同阶段的正常生长没有任何影响，而且大大的降低生产成本，变废为宝，在生态环境上更加环保，培养出的香蕉苗也能达到以前有MS组织培养培养出的苗的效果，而且生根数量和粗壮更明显，返青期早于基本MS培养基，更易于组培苗的移栽成活，为大规模的组培生产提供有利条件。

Description

一种香蕉无MS组织培养的方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种香蕉无MS组织培养的方法。

背景技术

香蕉(Musa paradisiaca L.)属于芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa L)，为多年生大型常绿草本单子叶植物，起源于亚洲热带地区，是世界主要鲜果种类之一。我国栽培香蕉的历史已有两千多年，是栽培香蕉历史最悠久的国家之一，而华南地区是我国香蕉的主产区，也是香蕉原产地之一。

目前，我国具有商业价值的香蕉栽培品种，几乎全都是营养性结实，果内没有种子或者种子完全退化，属于三倍体(包括AAA基因型、AAB基因型和ABB基因型)，具有高度的雌雄不孕的特性，传统香蕉繁殖多是采用无性繁殖方法，即是利用香蕉植株球茎发生的侧芽，俗称吸芽来延续生命。而通过无性繁殖，香蕉吸芽多数都携有病毒，易造成严重的品种退化，而使得香蕉的产量降低，品质变劣。因此采用传统繁殖方式繁殖会给种植者造成严重的经济损失。自20世纪60年代以来，植物组织培养技术不断地发展，并逐步完善成熟，香蕉组织培养技术也迅速发展，再加上香蕉吸芽茎尖的无毒、增殖率相对较高等特点，使得香蕉组织培养技术成为植物组培技术应用于商业化生产最成功的产业之一。1985年之后,广东、广西、云南、福建、海南等省区组织培养香蕉试管苗先后取得成功并开始工厂化生产。与传统吸芽繁殖相比，香蕉快速繁殖具有能够迅速推广优良品种，繁殖系数高，周期短，整齐，收获期一致，有利于集约化经营和商品化生产等优点。

植物只有在适宜的营养条件下，植物细胞才能正常地分化、分裂，进行正常的生长发育。在组织培养过程中所使用的培养基是向外植体提供营养物质的场所。一个完整的培养基至少包括无机营养元素(如包括大量元素和微量元素)、铁盐及鳌合剂、糖、无机附加成分、植物激素、其他成分和固体培养基，还需要琼脂等。常用的培养基是MS(Murashige andSkoog)培养基，其在配制时需要添加大量元素、微量元素有机物、铁盐、蔗糖、激素、琼脂和蒸馏水，而激素价格昂贵，植株生长容易产生依赖性；且配制时需分步配制母液，步骤繁琐。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种香蕉无MS组织培养的方法，使用木薯酒精厌氧发酵液替代基本培养基MS，更加环保，提供了一种绿色、低成本、便捷的香蕉无MS组织培养的方法，减少了在培养基配制过程中的资源浪费和时间消耗，为大规模的组培生产提供有利条件。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种香蕉无MS组织培养的方法，在香蕉丛生芽增殖阶段、继代阶段及生根培养阶段分别采用丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液，所述丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液均包含木薯酒精厌氧发酵液培养基。

其中，所述木薯酒精厌氧发酵液培养基为木薯酒精厌氧发酵原液经水稀释而成，为无MS培养基。优选的，所述稀释浓度不高于40％，即将木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成不高于40％重量百分比浓度。

本发明的技术方案使用的木薯酒精厌氧发酵液(简称CAAL)，是木薯加工生产酒精产出的废液经过特殊的厌氧发酵工艺处理后的液体，其中，含有氮、磷、钾、钙、镁等营养成分及有机质，可以考虑以此作为培养基，但是因为木薯酒精厌氧发酵液中COD(ChemicalOxygen Demand，化学需氧量)含量高，其中含有一些物质会对植物嫩苗的生长造成副作用，所以往往本领域的技术人员也不会采用酒精厌氧发酵液作为组织培养基，截至到目前，国内外对废液应用于组织培养也未见报道。

采用本发明的技术方案，从资源化优先和循环经济的角度出发，农业利用是处理厌氧发酵液最直接、最有效的方式；且发明人通过实验发现，对木薯酒精厌氧发酵原液经过稀释，并配以营养物质，不但大大的降低了生产成本，变废为宝，在生态环境上更加环保，符合目前绿色农业的发展需求，培养出的香蕉苗也能达到以前有MS组织培养培养出的苗的效果，而且生根数量和粗壮更明显，返青期早于基本MS培养基，易于组培苗的移栽成活，还减少在培养基配制过程中的资源浪费和时间消耗，为大规模的组培生产提供有利条件。

作为本发明的进一步改进，所述丛生芽增殖组织培养液包括28～32％的木薯酒精厌氧发酵液培养基、180～220g/l马铃薯汁、2.5～3.5mg/l 6-BA(6-苄氨基嘌呤)和0.1～0.3mg/l NAA(萘乙酸)，其中所述28～32％的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD(Chemical Oxygen Demand，化学需氧量)含量为1800～2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成28～32％的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

其中，所述马铃薯汁为新鲜马铃薯捣碎，过滤去渣，留取汁液。

本发明的技术方案，在组培培养基配置过程中利用木薯酒精厌氧发酵液取代MS，并且根据不同时期的不同需求，用不同浓度的厌氧液及天然的马铃薯汁及激素配比取代以前的常用培养基和激素配比，不但大大的降低了生产成本，而且变废为宝，在生态环境上更加环保，符合目前绿色农业的发展需求，培养出的香蕉苗也能达到以前有MS组织培养培养出的苗的效果，而且生根数量和粗壮效果较现有采用MS培养基更明显，返青期早于基本MS培养基的，易于组培苗的移栽成活，还减少在培养基配制过程中的资源浪费和时间消耗，为大规模的组培生产提供有利条件。

优选的，所述丛生芽增殖组织培养液包括30％的木薯酒精厌氧发酵液培养基、200g/l马铃薯汁、3.0mg/l 6-BA(6-苄氨基嘌呤)和0.2mg/l NAA(萘乙酸)。

作为本发明的进一步改进，所述继代组织培养液包括23～27％的木薯酒精厌氧发酵液培养基和80～120g/l马铃薯汁，其中，所述23～27％的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800～2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成23～27％的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

优选的，所述继代组织培养液包括25％的木薯酒精厌氧发酵液培养基和100g/l马铃薯汁，所述25％的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800～2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成25％的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

作为本发明的进一步改进，所述生根组织培养液包括12～18％的木薯酒精厌氧发酵液培养基和1.5～2.5mg/l 6-BA，其中，所述12～18％的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800～2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成12～18％的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

本发明采用的无MS组织培养的方法中，培养基的配制不需要添加大量元素、微量元素、有机物、铁盐，根据香蕉成长不同时期的不同需求，用不同浓度的废液和马铃薯汁代替MS提供营养成分，采用本发明的无MS的木薯酒精厌氧液培养基对香蕉进行组培，不但对香蕉组织培养的三个不同阶段的正常生长没有任何影响，反而生根数量和粗壮更明显，返青期早于基本MS培养基，易于组培苗的移栽成活，而且大大的降低生产成本。

优选的，所述生根组织培养液包括15％的木薯酒精厌氧发酵液培养基和2.0mg/l6-BA，所述15％的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800～2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成15％的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

作为本发明的进一步改进，所述丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液的pH值均为5.6～5.8，均包含28～32g/l蔗糖和6.0～7.0g/l琼脂。

作为本发明的进一步改进，所述木薯酒精厌氧发酵液培养基为COD含量为2000mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液。

作为本发明的进一步改进，所述木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释时，采用自来水稀释。本发明的技术方案，采用自来水代替蒸馏水，也节约了更多的能源物质、减少不必要的浪费，将酒精废液利用到组织培养也属于先例，实现资源回收利用，在生态环境上更加环保，符合目前绿色农业的发展需求。

作为本发明的进一步改进，所述的香蕉无MS组织培养的方法包括以下步骤：

步骤A：将香蕉不定芽无菌切取单个芽，去除叶片及褐变部分，留取基部不超过1cm生长点，转接到所述丛生芽增殖组织培养液中，在24～30℃环境下，培养30～40天，光照度1800～2200lx，光照时间15～17h/d；

步骤B：将增殖的丛生芽，分离成单株转入所述继代组织培养液中，继代培养28～32天，成为中苗；培养条件为培养温度24～30℃，光照度1800～2200lx，光照时间15～17h/d；

步骤C：将中苗转入所述生根组织培养液中进行生根培养15～20天生根后移栽，培养条件为培养温度24～30℃，光照度1800～2200lx，光照时间15～17h/d。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A、步骤B和步骤C的培养条件均为：温度26～28℃，光照2000lx，光照时间16h/d。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

第一，采用本发明的技术方案，利用木薯酒精厌氧发酵液取代MS培养基，并配以营养液，不但对香蕉组织培养三个不同阶段的正常生长没有任何影响，而且大大的降低生产成本，变废为宝，在生态环境上更加环保，培养出的香蕉苗也能达到以前有MS组织培养培养出的苗的效果，而且生根数量和粗壮更明显，返青期早于基本MS培养基，更易于组培苗的移栽成活。

第二，本发明的技术方案提供了一种更加环保、绿色、低成本、便捷的香蕉无MS组织培养的方法，该方法减少在培养基配制过程中的资源浪费和时间消耗，为大规模的组培生产提供有利条件。

第三，实现资源回收利用，在生态环境上更加环保，符合目前绿色农业的发展需求。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

实施例1

以下实施例对香蕉丛生芽增殖、继代及生根培养阶段进行组织培养。

(一)香蕉无MS的30％CAAL培养基芽诱导培养

将组培瓶苗(香蕉不定芽)，在超净工作台无菌切取单个芽，去除叶片及褐变部分，留取基部不超过1cm生长点，转接到包含有无MS的30％木薯酒精厌氧液培养基、200g/l马铃薯汁、3.0mg/l 6-BA和0.2mg/l NAA的培养基中，培养30～40天，26～28℃，光照度2000lx，光照时间16h/d；培养基pH值为5.6～5.8，且含30g/l蔗糖，6.5g/l琼脂。所述马铃薯汁为新鲜马铃薯捣碎，过滤去渣，留取汁液。

本例所述的无MS的30％木薯酒精厌氧液(CAAL)培养基是指将从木薯酒精加工厂取回的COD含量为2000mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液，用自来水稀释成30％重量百分比浓度，添加马铃薯汁、6-BA和NAA，再添加琼脂粉和糖，煮沸配制而成。经过分析，所述香蕉无MS的30％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分如表1所示：

表1 香蕉无MS的30％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分

组成成分	含量(mg/L)	组成成分	含量(mg/L)
				Ca	0.04	氮	0.189
Mg	0.025	磷	0.024
				Zn	0.0001	钾	0.456
Fe	0.0018	有机质	0.12
				Mn	0.0002	琼脂	6500
S	0.121	蔗糖	28000
				6-BA	3.0	NAA	0.2
马铃薯汁	200000

从表1可见，所述香蕉无MS的30％木薯酒精厌氧发酵液培养基包含了氮、磷、钾、钙、镁等农作物生长所必需的营养成分及有机质，富含了此阶段香蕉组织培养所需要的营养成分。

(二)香蕉无MS的25％CAAL培养基芽增殖培养

将增殖的圆球状的丛生芽，分离成单株转入含有无MS的25％木薯酒精厌氧液培养基和100g/l马铃薯汁的培养基中，继代培养30天成为中苗；培养条件为：培养温度26～28℃，光照度2000lx，光照时间16h/d；培养基的pH值为5.6～5.8，且含30g/l蔗糖，6.5g/l琼脂。所述马铃薯汁为新鲜马铃薯捣碎获得，过滤去渣，留取汁液。

本例所述的无MS的25％木薯酒精厌氧液(CAAL)培养基是指将从木薯酒精加工厂取回的COD含量为2000mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液，用自来水稀释成25％重量百分比浓度，添加马铃薯汁，再添加琼脂粉和糖，煮沸配制而成。经过分析，所述香蕉无MS的25％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分如表2所示：

表2 香蕉无MS的25％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分

组成成分	含量(mg/L)	组成成分	含量(mg/L)
				Ca	0.033	氮	0.158
Mg	0.021	磷	0.020
				Zn	0.0008	钾	0.38
Fe	0.0015	有机质	0.10

Mn	0.00018	琼脂	6500
				S	0.1008	蔗糖	28000
马铃薯汁	100000

从表2可见，所述香蕉无MS的25％木薯酒精厌氧发酵液培养基包含了氮、磷、钾、钙、镁等农作物生长所必需的营养成分及有机质，富含了此阶段香蕉组织培养所需要的营养成分。

(三)香蕉无MS的15％CAAL培养基生根培养

将中苗转入包含无MS的15％木薯酒精发酵液培养基、2.0mg/l 6-BA的培养基中，进行生根培养，培养基的pH值为5.6～5.8，含30g/l蔗糖和6.5g/l琼脂。培养条件为：培养温度26～28℃，光照度2000lx，光照时间16h/d，培养15～20天。

本例所述的无MS的15％木薯酒精厌氧液(CAAL)培养基是指将从木薯酒精加工厂取回的COD含量为2000mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液，用自来水稀释成15％重量百分比浓度，添加6-BA，再添加琼脂粉和糖，煮沸配制而成。经过分析，所述香蕉无MS的25％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分如表3所示：

表3 香蕉无MS的15％木薯酒精厌氧发酵液培养基组分

组成成分	含量(mg/L)	组成成分	含量(mg/L)
				Ca	0.020	氮	0.095
Mg	0.013	磷	0.012
				Zn	0.0005	钾	0.228
Fe	0.0009	有机质	0.06
				Mn	0.0001	琼脂	6500
S	0.0605	蔗糖	28000
				马铃薯汁	100000

从表3可见，所述香蕉无MS的15％木薯酒精厌氧发酵液培养基包含了氮、磷、钾、钙、镁等农作物生长所必需的营养成分及有机质，富含了此阶段香蕉组织培养所需要的营养成分。

15～20天后观察发现，培育出长而粗壮的根，每株根数量达到4～7条，经过移栽，练苗移栽的成活率高。

对比实施例1

对照组采用MS培养基进行香蕉组织培养。

将组培瓶苗(香蕉不定芽)，在超净工作台无菌切取单个芽，去除叶片及褐变部分，留取基部不超过1cm生长点，转接到MS的培养基中，培养30～40天，26～28℃，光照度2000lx，光照时间16h/d；培养基pH值为5.6～5.8，含30g/l蔗糖，6.5g/l琼脂。

将实施例1和对比实施例1的香蕉组培苗的根系生长情况进行对比，详见表4。通过对比发现，采用实施例1的无MS的木薯酒精厌氧液培养基培养的香蕉苗的根数、根长和根粗都比采用MS培养基的显著增加，这说明木薯酒精厌氧液培养基能显著促进香蕉组培苗根系的生长。

表4 实施例1和对比实施例1的香蕉组培苗的根系生长情况表

处理	根数	平均根长cm	最长根cm	平均根粗mm	最粗根mm
						实施例1	6.17±0.5a	4.27±0.21A	7.50±0.34A	0.66±0.02A	0.77±0.02A
对比实施例1	4.5±0.4b	1.36±0.13B	2.08±0.18B	0.36±0.02B	0.47±0.03B

备注：同一列中含有不同小写字母的表示差异显著，含有不同大写字母的表示差异极显著；同一列中含有相同大写或小写字母的表示差异不显著，下同。

下面对实施例1和对比实施例1得到的香蕉组培苗进行移栽情况对比。

将两种生根培养基的苗，培养20天后，同时将两种组培苗进行炼苗，炼苗时将瓶盖打开，炼苗3-5天，使香蕉组培苗逐步适应外界环境。移栽时，将两种香蕉组培苗根部的培养基清洗干净，再将其移栽到苗床，所述苗床为事先消毒好的70％沙壤土+30％腐叶土，按15cm×15cm规格移栽，两种香蕉组培苗分别移栽150株，即重复三次，每此移栽50株，移栽后的前期用70％遮阳网遮光，后期遮光改为30％。

移栽后，浇透定根水，而后每天早晚各淋水一次，移栽香蕉苗20天后，每隔七天喷施0.1％一0.3％磷酸二氢钾叶面肥，并且定时浇营养液。

每天观察记录，在移栽12天后，采用以下公式调查统计两种组培苗移栽成活率。

移栽成活率(％)＝(每处理移栽香蕉组培苗成活株(丛)数/每处理移栽香蕉组培苗总株(丛)数)x100％。

移栽成活率按照香蕉组培苗株高分为两种统计方法进行比较，即移栽前总苗成活率和5cm以上香蕉苗成活率，具体数据详见表5。

表5 实施例1和对比实施例1的组培苗移栽情况

通过表5中的数据对比表明，结果表明：实施例1的香蕉苗移栽总成活率为89.3％，略高于传统MS培养移栽成活率86.0％；对超过5cm以上香蕉组培苗成活率进行统计，实施例1的香蕉苗5cm以上成活率基本与总成活率相同，而传统MS培养的略低于总成活率；另外，移栽后返青需要的天数，实施例1的略早于对比实施例1的，这充分说明采用本发明的技术方案进行香蕉组织培养，香蕉苗的质量相对较好，根吸收能力较强，移栽后适应环境能力强于传统MS培养，移栽后返青期早，易于成活。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种香蕉无MS组织培养的方法，其特征在于：在香蕉丛生芽增殖阶段、继代阶段及生根培养阶段分别采用丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液，所述丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液均包含木薯酒精厌氧发酵液培养基；所述丛生芽增殖组织培养液包括28~32%的木薯酒精厌氧发酵液培养基、180~220g/l马铃薯汁、2.5~3.5mg/l 6-BA和0.1~0.3mg/l NAA，其中所述28~32%的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800~2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成28~32%的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成；

所述继代组织培养液包括 23~27%的木薯酒精厌氧发酵液培养基和80~120g/l马铃薯汁，其中，所述23~27%的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800~2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成23~27%的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成；

所述生根组织培养液包括12~18%的木薯酒精厌氧发酵液培养基和1.5~2.5 mg/l 6-BA，其中，所述12~18%的木薯酒精厌氧发酵液培养基为将COD含量为1800~2200mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液用水稀释成12~18%的重量百分比浓度，再添加琼脂粉和糖配制而成。

2.根据权利要求1所述的香蕉无MS组织培养的方法，其特征在于：所述丛生芽增殖组织培养液、继代组织培养液和生根组织培养液的pH值均为 5.6～5.8，均包含28~ 32g/l 蔗糖和6.0~7.0g/l 琼脂。

3.根据权利要求1或2所述的香蕉无MS组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述木薯酒精厌氧发酵液培养基为COD含量为2000mg/L的木薯酒精厌氧发酵原液。

4.根据权利要求1或2所述的香蕉无MS组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将香蕉不定芽无菌切取单个芽，去除叶片及褐变部分，留取基部不超过1cm生长点，转接到所述丛生芽增殖组织培养液中，在24～30℃环境下，培养30～40 天，光照度1800~2200lx，光照时间 15~17h/d；

步骤B：将增殖的丛生芽，分离成单株转入所述继代组织培养液中，继代培养28~32天，成为中苗；培养条件为培养温度 24～30℃，光照度1800~2200lx，光照时间15~17h/d；

步骤C：将中苗转入所述生根组织培养液中进行生根培养15～20天生根后移栽，培养条件为培养温度24～30℃，光照度1800~2200lx，光照时间15~17h/d。

5.根据权利要求4所述的香蕉无MS组织培养的方法，其特征在于：所述步骤A、步骤B和步骤C的培养条件均为：温度26～28℃，光照2000lx，光照时间 16h/d。