CN110432145A - 一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，包括：取材及消毒处理：选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段和顶端小叶，并做消毒处理：愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基中培养至产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；愈伤增殖培养：将愈伤组织移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃。本发明愈伤组织的诱导和增殖培养置于20℃温度条件下，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，同时低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

Description

一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养 方法

技术领域

本发明涉及一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]属双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，其在观赏、药用、材用方面具广阔利用前景。在观赏方面，其树形美且通直，果具圆盘状果翅，远观似铜钱；根系发达，根蘖强，是优良的景观造林树种。在材用方面，其生长速度快，年轮粗细均匀，木材强度高，耐磨损，适作家具、室内装饰和建筑用材。在药用方面，其叶特有的总黄酮、总三萜、总多糖和总酚类化合物，具降血压、降血脂、降血糖、抗氧化和抗PTP1B等功能，并具有改善肾功能、调节血糖紊乱、缓解肝脏损伤、提高免疫功能等生理作用。

目前青钱柳药用活性成分主要从叶片中提取，从愈伤组织中提取的相关报道较少。关于其次生代谢产物的研究主要集中于提取方法的优化、代谢产物分析等方面，随着市场需求量增大，植物提取技术面临有效提取量低、天然资源受限、成本高等问题，其次生代谢产物又受种源、生长条件影响，含量差异明显，故通过愈伤组织进行次生代谢产物生产具有现实意义。青钱柳愈伤组织已被证实含有黄酮类、三萜类和总酚类等化合物，且通过优化培养条件和应用生物反应器可提升产量。愈伤组织培养技术具有增殖效率高、培养成本低、材料生长快等特点，不仅是植物间接快繁的重要步骤，而且在药用植物次生代谢产物生产方面也具有广阔的应用前景。但是，青钱柳愈伤组织在培养过程中容易产生酚类物质，不利于愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，愈伤组织的诱导和增殖培养置于20℃温度条件下，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，同时低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

为解决上述技术问题，本发明提供一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，包括：

取材及消毒处理：选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段和顶端小叶，并做消毒处理：

愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基中培养至产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；

愈伤增殖培养：将愈伤组织移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃。

进一步地，所述消毒处理的具体方法为：茎段和叶片先经1～2滴洗涤剂浸泡2min，流水冲洗1～2h；茎段在超净工作台上经75％酒精处理30s，随后流水冲洗干净，在5％次氯酸钠溶液中浸泡3～5min，流水冲洗干净备用；叶片在超净工作台上经75％酒精处理10s，随后流水冲洗干净，在5％次氯酸钠溶液中浸泡2～2.5min，流水冲洗干净备用。

进一步地，所述叶片的消毒时间短于茎段，多次冲洗以洗脱消毒剂，茎段消毒后去除首尾两端，叶片消毒后于维管束处划痕。

进一步地，所述取样时间为4月至9月；茎段取自青钱柳无病害枝条顶端1～2节；叶片取自青钱柳复叶上的顶端小叶。

进一步地，所述诱导培养基为：3/4MS基本培养基中，添加1.5mg·L^-16-BA、0.05mg·L^-1NAA、30～35g·L^-1蔗糖、7～7.2g·L^-1琼脂粉、100～200mg·L^-1抗褐化剂PVP。

进一步地，所述继代增殖培养基为：WPM基本培养基中，添加1.5mg·L^-16-BA、0.05mg·L^-1NAA、30～35g·L^-1蔗糖、7～7.2g·L^-1琼脂粉、100～200mg·L^-1抗褐化剂PVP。

进一步地，所述诱导培养基或继代增殖培养基的pH为5.75～5.80。

进一步地，所述茎段、叶片于诱导培养基中培养30d后产生愈伤组织，愈伤组织每隔28d继代一次。

本发明所达到的有益效果：本发明促进了青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累，本发明中整体污染率低，愈伤组织能够稳定增殖到第10代，保持良好的生长状态，生物量大，具体地：

(1)75％乙醇+5％次氯酸钠的消毒组合可以在降低茎段和叶片污染率的同时，保证良好的生长状态，保证了外植体其后续愈伤诱导和增殖；

(2)温度能够抑制植物体内酶活性，本发明愈伤组织的诱导和增殖培养置于20℃温度条件下，连续黑暗处理，培养周期为28d，相比于传统的25±2℃的培养温度和光周期处理，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，同时低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累；

(3)本发明采用的愈伤组织诱导配方中采用的3/4MS基本培养基，初期诱导能够产生大量疏松松软的愈伤组织，在继代过程中，改用WPM基本培养基，能够促进淡黄色愈伤组织质地趋向紧密并快速继代繁殖；

(4)本发明采用的愈伤组织诱导和殖配方培养获得的青钱柳愈伤诱导率高且继代7次生长状态良好，愈伤增长倍数达4.1，青钱柳愈伤组织生长速度快、状态良好、质地紧密，无玻璃化现象；

综上所述，采用本发明诱导培养的青钱柳愈伤组织状态良好、产量大，技术操作简单、生产周期短，耗能耗时少，能够实现次生代谢产物的大规模生产，能有效解决工业化提取青钱柳次生代谢产物对原料的需求与野生种质资源缺乏之间的矛盾。

附图说明

图1是温度对青钱柳愈伤组织总黄酮含量的动态影响；

图2是温度对青钱柳愈伤组织总三萜含量的动态影响；

图3是温度对青钱柳愈伤组织总酚类化合物含量的动态影响；

图4是光照对青钱柳愈伤组织总黄酮含量的动态影响；

图5是光照对青钱柳愈伤组织总三萜含量的动态影响；

图6是光照对青钱柳愈伤组织总酚类化合物含量的动态影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，具体包括以下步骤:

(1)取材：取样时间为4月至9月，于温室培养(严格日常管理，每月喷多菌灵抑菌，并施加缓释肥)的三年生平茬苗上选取当年生半木质化带芽茎段和顶端小叶；

(2)消毒：叶片(75％酒精30s+5％次氯酸钠2～2.5min)的消毒时间短于茎段(75％酒精30s+5％次氯酸钠3～5min)，多次冲洗以洗脱消毒剂，茎段消毒后去除首尾两端，叶片消毒后于维管束处划痕；

(3)愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基(3/4MS+1.5mg·L^-1 6-BA+0.05mg·L^-1NAA)中培养30d后产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃，切取淡黄色、浅绿色、无褐变、质地疏松、生长旺盛的愈伤组织，转移至增殖培养基中培养；

(4)愈伤增殖培养：愈伤组织每隔28d继代一次，将其移至继代增殖(WPM+1.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA)培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；

(5)次生代谢产物提取：取出愈伤组织块，去除底部琼脂，用滤纸吸干表面水分；至60℃烘箱中烘干至恒重，干燥后研磨成粉末。取粉末0.4g于试管中,按料液比为1∶12.5加70％乙醇，在70℃下超声辅助45min，在70℃水浴加热15min，取液体，离心去沫，取上清液为提取液。总黄酮含量采用AlCl3甲醇—溶液比色法测定，总三萜含量采用香草醛—冰醋酸溶液比色法测定，总酚类化合物含量采用福林酚—碳酸钠溶液比色法测定。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

以2018年南京林业大学白马基地青钱柳苗圃和南京林业大学生物技术大楼10楼温室采集的当年生健康、无病害营养枝作为试验材料。

实施例1、消毒方法筛选

茎段的选取：2018年于南京林业大学生物技术大楼10楼温室培养的三年生平茬苗的顶端1、2节处剪取长约3～4cm的半木质化带芽茎段，保留1个腋芽。

材料预处理：修剪除去茎段上的叶片，用自来水冲洗1～2小时。

为了筛选出最佳的青钱柳茎段消毒时间处理组合，选择了0.1％升汞和5％次氯酸钠两种消毒剂对青钱柳的消毒处理进行研究，0.1％升汞和5％次氯酸钠的消毒时间选用5个水平：3、5、7、9、11min。实验设计详见表1。茎段经过修剪和冲洗后置于超净工作台上，用乙醇和次氯酸钠进行进一步的消毒，消毒完成后用无菌水冲洗4～5次。在滤纸上将消毒好的带芽茎段切去与消毒液接触的部分并平放于培养基中，10d后观察外植体接种后的污染情况，并观察外植体污染特征，进一步判定造成污染的原因，并统计污染率和死亡率。

表1 基于青钱柳茎段的消毒组合筛选

Table1 Selection of disinfection combination based on the germinationof stem segments of C.paliurus

注：数值为均值±标准误，表中相同小写字母表示同一指标下各处理间在P＝0.05水平下无显著差异，下同。

由上表1可以看出，75％酒精+0.1％升汞的消毒组合整体优于75％酒精+5％次氯酸钠的消毒组合，其中在75％酒精处理30s，随后5％次氯酸钠消毒5min的组合下，污染率最低为10％，死亡率为1.7％，萌发率为88.3％。本研究中只筛选了茎段的消毒组合，叶片的消毒处理在茎段消毒结果的基础上进行轻微调整，污染率为17％，故本研究中未针对叶片进行消毒处理的筛选。

因此，本部分选择用75％的酒精消毒30s后用5％的次氯酸钠消毒5min作为温室材料青钱柳带芽茎段的最佳消毒操作。

实施例2、愈伤诱导配方筛选

为诱导青钱柳茎段和叶片产生愈伤组织，以改良MS(除CaCl2全量，其他大量元素为全量的3/4)为基本培养基，设计6-BA(0.5、1.0、1.5mg·L^-1)+NAA(0.05、0.1mg·L^-1)的激素组合；以WPM为基本培养基，设计6-BA(0.5、1.0mg·L^-1)+IBA(0.05、0.1mg·L^-1)的激素组合用于茎段、叶片的愈伤诱导，具体操作见下表2。每试管接种一个材料，每次处理15管，三次重复。每隔10d观察一次，培养30d后统计愈伤诱导率。

表2 青钱柳愈伤诱导配方筛选

Table2 Selection of callus induction formula for C.paliurus

注：+表述愈伤数量一般，++表示愈伤数量多，下同。

比较不同激素组合对青钱柳愈伤组织诱导的影响，结果如下：

(1)10个配方愈伤诱导率均在73.3％以上，说明青钱柳茎段和叶片都极易诱导愈伤。茎段愈伤主要从茎段首位两端伤口部位发生，叶片愈伤从叶脉维管束伤口部位发生。

(2)从愈伤状况看，基本培养基和激素组合显著影响愈伤状态。以3/4MS为基本培养基，除了在1.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA配方下，愈伤为黄褐色，其他愈伤状态均呈现浅黄色，浅绿色；在1.0mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA和1.5mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1NAA配方下，愈伤产量最大。以WPM为基本培养基，最适愈伤诱导配方为0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA，愈伤浅黄色，愈伤量最大。同时以WPM为基本培养所获愈伤组织质地紧密，而以3/4MS为基本培养基所获愈伤组织质地松软，质地松软的愈伤组织进行继代增殖沿用初期诱导配方，多次继代易褐化死亡，而初期颜色不佳的愈伤组织在继代增殖过程中更是容易褐化。质地松软、状态良好的愈伤组织接种到WPM基本培养基，愈伤质地紧密，在光照条件下会轻微褐化，黑暗条件下不褐化，而颜色不佳的愈伤组织少部分能够产生颜色浅色的愈伤组织，但大部分均死亡。故在后期试验中，选用WPM作为基本培养基用于愈伤增殖。

愈伤状况影响后续增殖和分化进程，应当选取浅色，量大的愈伤组织用于试验。3/4MS+1.0mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA、3/4MS+1.5mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1NAA和WPM+0.5mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1IBA三个配方适宜进行愈伤诱导增殖。

实施例3、愈伤增殖配方筛选

增殖培养：以WPM为基本培养基，根据表2配方结果，筛选出三个配方，作为愈伤增殖配方，具体配方见表3。每试管接种一个材料，每次处理15瓶，三次重复。每隔10d观察一次，培养30d后统计愈伤增量和增长倍数，统计继代7代后的愈伤组织的生长状况。(增长倍数＝(继代一次后重量-继代前重量)/继代前重量)

表3 青钱柳愈伤增殖配方筛选

Table3 Selection of proliferation coefficient formula for callus ofC.paliurus

表4 青钱柳继代7次后愈伤生长状态

Table4 Growth state of seven successive generations for callus ofC.paliurus

从增量和增长倍数看，三种配方均能保持较高的增长倍数(表3)，其中WPM+1.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA中获得的增量和增长速率最高，达6.6和4.1。从愈伤生长状态看，三种配方继代7次后，在黑暗条件下，愈伤呈浅黄色；在光照条件下，愈伤呈浅绿色，部分黑褐色，颗粒状，愈伤量大，有活力。在继代培养过程中发现，靠近培养基的愈伤质地紧密，远离培养基的愈伤质地松软；初期未发生褐化、完整未受伤的愈伤组织在暗培养过程中均不发生褐化现象，但在光照条件下(16h/d)会从顶部开始褐化；将光照条件下的褐化愈伤去除后，进行暗处理愈伤从切口部分继续发生褐化，但较光照条件褐化缓慢。

综合增量、增长倍数和愈伤状态，WPM+1.5mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1NAA最适宜愈伤增殖，愈伤呈现良好状态，同时黑暗处理相较光照处理能抑制褐化发生速率。

实施例3、环境条件筛选

试验材料：经继代培养(WPM+1.5mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1NAA)所获得的第9代愈伤组织。

培养方法：以WPM为基本培养基，激素组合为1.5mg·L^-1 6-BA+0.05mg·L^-1NAA；黑暗条件，设置20℃，24℃和28℃三种温度，探求不同温度对青钱柳愈伤生长量和总黄酮、总三萜、总多酚类化合物含量的影响；培养温度25℃，设置光周期(16h/d)和连续黑暗，探求有无光照对青钱柳愈伤生长量和总黄酮、总三萜、总多酚类化合物含量的影响。

标准曲线的制作：总黄酮标准曲线的制作：称取芦丁标准品10mg用80％乙醇溶解，定容至25ml摇匀。吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml于10ml离心管，加入1ml的1％AlCl3甲醇溶液，摇匀静置15min后用甲醇溶液定容至10ml，待溶液显色稳定后，于410nm波长处测定吸光度。经最小二乘法作线性回归得到决定系数R2＞0.99的回归方程：Y＝0.2659x-0.0023；总三萜标准曲线的制作：称取齐墩果酸标准品10mg用70％乙醇溶解，定容至25ml摇匀。吸取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08ml于10ml离心管，加入0.5ml的5％香草醛冰醋酸溶液，1.4ml高氯酸，混匀后60℃水浴15min，冷却至室温后用乙酸乙酯定容至10ml，待溶液显色稳定后于550nm波长处测定吸光度。经最小二乘法作线性回归得到决定系数R2＞0.99的回归方程：Y＝0.3899x+0.0555；总酚类化合物标准曲线的制作：称取没食子酸标准品10mg用70％乙醇溶解，定容至25ml摇匀。吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml于10ml离心管，加入0.5ml福林酚试剂，室温间隔5min后加入1.5ml(20％m/v)碳酸钠溶液，摇匀置于室温暗处理1h,于765nm波长处测定吸光度。经最小二乘法作线性回归得到决定系数R2＞0.99的回归方程：Y＝0614x+0.104。

愈伤组织生长量测定：每个处理接种10瓶，每瓶接种愈伤组织块3～4块，接种量6.2g(FW)左右，每隔14d记录愈伤组织生长量。在42d为保证培养基的营养供给和愈伤组织的正常生长，继代一次，将瓶中所有愈伤组织转接至继代培养基中，保持愈伤结构和状态，避免损伤。

总黄酮、总三萜、总酚类化合物含量测定：每个处理接种20瓶，每瓶接种愈伤组织块3～4块，接种量6.2g(FW)左右。每14d取样一次，每次取10瓶中的1～2块，去除底部琼脂，用滤纸吸干表面水分；至60℃烘箱中烘干至恒重，干燥后研磨成粉末。取粉末0.4g于试管中,按料液比为1∶12.5加70％乙醇，在70℃下超声辅助45min，在70℃水浴加热15min，取液体，离心去沫，取上清液为提取液，重复3次。

总黄酮含量的测定：准确吸取0.1ml提取液于10ml离心管，按上述总黄酮标准曲线操作步骤测定吸光值。

总三萜含量的测定：准确吸取0.1ml提取液于10ml离心管，按上述总三萜标准曲线操作步骤测定吸光值。

总酚类化合物含量的测定：准确吸取0.02ml提取液于10ml离心管，按上述总酚类化合物标准曲线操作步骤测定吸光值。

表5 不同处理对青钱柳愈伤生物量(g)的动态影响

Table5 Dynamic effects of different treatments on callus(g)ofC.paliurus

表6 不同处理对青钱柳愈伤生物量增长倍数的动态影响

Table6 Dynamic effects of different treatments on growth multiple forcallus of C.paliurus

注：表中相同小写字母表示同一培养时间，不同处理之间在P＝0.05水平下无显著差异，

相同大写字母表示同一处理，不同时间之间在P＝0.05水平下无显著差异。

总体而言，低温有益于抑制酚类物质的产生，且当培养温度低于20℃时，青钱柳不能正常生长，故设置20℃，24℃和28℃三种温度进行试验。针对愈伤组织生长的因子分析，25℃下，16h/d光照处理相比黑暗处理有利于愈伤组织的生长(表5)，但光照处理容易诱发愈伤褐化；黑暗处理下，20℃和28℃能促进愈伤组织的增殖生长，增殖高峰期在培养14d内(表6)。

如图1至图6所示，针对愈伤组织次生代谢产物的因子分析，黑暗条件下，20℃培养28d有利于总黄酮、总三萜和总酚类化合的积累；25℃下，16h/d光照处理相比连续黑暗有利于愈伤组织次生代谢产物的积累，继代培养14d内总黄酮、总三萜和总酚类化合物含量均较高，但随培养时间延长，总三萜和总酚类化合物含量低于黑暗条件处理效果。总体以20℃，连续黑暗处理效果最佳，总三萜、总黄酮和总酚类化合物含量最大，考虑到培养基的损耗成本，以28d为较为适宜的培养周期。16h/d的光周期和25±2℃为青钱柳生长的最适宜环境条件，而次生代谢产物在一定逆境下积累较多，当培养温度为20℃时，在能保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，连续黑暗条件可抑制愈伤褐化，故黑暗条件下的低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

本研究中提出的培养方式和次生代谢产物提取方法为后期工业化提取青钱柳三萜、黄酮、多糖等次生代谢产物提供大量的组培材料，为实现青钱柳工厂化生产奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，包括：

取材及消毒处理：选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段和顶端小叶，并做消毒处理：

愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基中培养至产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；

愈伤增殖培养：将愈伤组织移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃。

2.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述消毒处理的具体方法为：茎段和叶片先经1 ~ 2滴洗涤剂浸泡2min，流水冲洗1 ~ 2h；茎段在超净工作台上经75%酒精处理30s，随后流水冲洗干净，在5%次氯酸钠溶液中浸泡3 ~ 5min，流水冲洗干净备用；叶片在超净工作台上经75%酒精处理10s，随后流水冲洗干净，在5%次氯酸钠溶液中浸泡2 ~ 2.5min，流水冲洗干净备用。

3.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述叶片的消毒时间短于茎段，多次冲洗以洗脱消毒剂，茎段消毒后去除首尾两端，叶片消毒后于维管束处划痕。

4.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述取样时间为4月至9月；茎段取自青钱柳无病害枝条顶端1 ~ 2节；叶片取自青钱柳复叶上的顶端小叶。

5.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述诱导培养基为：3/4MS基本培养基中，添加1.5mg·L^-16-BA、0.05mg·L^-1NAA、30~35g·L^-1蔗糖、7~7.2g·L^-1琼脂粉、100～200mg·L^-1抗褐化剂PVP。

6.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述继代增殖培养基为：WPM基本培养基中，添加1.5mg·L^-16-BA、0.05mg·L^-1 NAA、30~35g·L^-1蔗糖、7~7.2g·L^-1琼脂粉、100～200mg·L^-1抗褐化剂PVP。

7.根据权利要求5或6所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述诱导培养基或继代增殖培养基的pH为5.75～5.80。

8.根据权利要求1所述的一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，所述茎段、叶片于诱导培养基中培养30d后产生愈伤组织，愈伤组织每隔28d继代一次。