CN115281083B - 一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，该方法是所述方法是取虎耳草叶片清洗，选取佳灭菌组合进行消毒灭菌处理，放入培养基中经愈伤组织诱导生长阶段、愈伤组织增殖阶段和代谢物诱导培养阶段无菌培养。通过添加不同浓度的水杨酸SA、硝普钠SNP提高虎耳草愈伤组织的岩白菜素、没食子酸、原茶儿酸等药用成分的含量，为虎耳草在栽培过程中提高次生代谢产物产量提供新途径。

Description

一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法

技术领域

本发明涉及虎耳草栽培领域，特别是一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法。

背景技术

虎耳草(SaxifragastoloniferaMeerb.)为虎耳草科(Saxifragaceade)虎耳草属的多年生常绿全草，性微苦，辛，寒，有小毒。具有祛风、清热、凉血解毒等功效。现代药理研究表明，虎耳草提取物具有抗炎、抑菌、杀菌、抗癌、抗氧化等药理活性，具有较好的药用价值，还可作为观赏植物，而且在净化污水方面也有不错的效果。我国主要分布于华东地区江苏、浙江、安徽，华北地区河北，西南贵州、云南等地、西北地区陕西、甘肃的东南部以及华中地区湖北北部等地。而现今虎耳草野生植物资源越来越少，繁殖系数较低，且繁殖时间较长，难以满足制药对药材来源的批量需求以及人们对观赏植物的需求。

虎耳草含有槲皮苷、没食子酸、绿原酸、岩白菜素和原儿茶酸等药用化学成分，根据现代药理研究表明，虎耳草提取物具有抗炎、抑菌、杀菌、抗癌、抗氧化等药理作用。但是，以上药用成分在药用植物中含量较低，如何在保护药用植物资源条件下调控药用有效成分在药用植物中含量，也是一大问题，有待进一步研究。

现今人们的滥采乱挖，虎耳草野生植物资源越来越少，并且虎耳草通常采用分株繁殖以及压条繁殖等方式来繁育，繁殖系数较低，且繁殖时间较长，难以满足制药对药材来源的批量需求以及人们对观赏植物的需求。近些年虎耳草的研究主要集中在虎耳草干旱、土壤类型对虎耳草成分及光合的影响，虎耳草病害的分离鉴定，虎耳草的提取方法、提取物化学成分的测定、鉴定及虎耳草化学药理作用研究等方面。

诱导子(elicitors)是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应(hypersensitive)或自身防御反应(self-defensereation)的因子)，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。诱导子根据性质可分为生物诱导子和非生物诱导子两类，生物诱导子主要是指微生物类诱导子，是指植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子(conidia)、降解细胞壁的酶类、有机体的细胞壁碎片、有机体产生的代谢物以及培养物滤液中的成分，如真菌的菌丝体、发酵液、真菌分泌物等。目前人们由实验推出的主要第二信使包括Ca2+，cAMP.磷酸肌醇、G一蛋白、水杨酸(Salicylicacid,SA)、茉莉酸盐、茉莉酸(Jasmonates,JAs)、茉莉酸甲酯(methylejasmonate,MeJA)、一氧化氮(NO)、乙烯以及植物细胞壁组成成分等。

水杨酸(Salicylicacid,SA)是一种广泛存在于植物体内的小分子酚类物质，化学名叫邻羟基苯甲酸，化学式为C₆H₄(OH)(COOH)，是桂皮酸的衍生物，在植物的许多生理发挥着重要作用，1828年JohnBuchner首先于柳树皮分离出水杨醇糖苷，在1838年命名为水杨酸，而水杨酸的首次的合成是在1874年。。水杨酸在植物体内有两种存在方式，分别是游离态和结合态，游离态的水杨酸在通常状态下表现为结晶状态，当在157℃～159℃达到熔融状态，能够迅速的从合成部位或被处理的部位运输到远距离的所需组织中。SA是一种能提高植物非生物抗性的信号分子，如抗旱性，抗寒性、抗病性、耐盐性等，不但可以调节植物生长发育过程，还可以对植物种子的萌发、开花、果实成熟等生理生化过程起调控作用。

硝普钠(SNP)为鲜红色透明粉末状结晶，易溶于水，液体呈褐色性质不稳定，放置后或遇光时易分解，使高铁离子(Fe)变为低铁离子(Fe)，液体变为蓝色。由于其作用迅速，而且消失也快，是治疗高血压急症及急性左心衰竭的常用药物。

茉莉酸类(Jasmonates,JAs)物质是一种信号分子，主要包括有茉莉酸(jasmonicacid,JA)和茉莉酸甲酯(methylejasmonate,MeJA)及其他衍生物，JA经过甲酯化形成茉莉酸甲酯(MeJA),普遍存在于植物体内。研究人员在1962年从素馨花(Jasminumgrandiflorum)的香油中提取分离出一种挥发性且含有特殊香味的化合物茉莉酸甲酯(MeJA)，属于环戊酮衍生物类的一种植物生长调节物质。茉莉酸类对植物的生长过程中有许多调节作用，能够调节植物生长发育进程，促进或抑制种子的萌发、花粉的发育与衰老、调节植物的防御系统，包括植株的抵抗病原菌侵袭和伤害应答，还能增加植株的抗性。

目前尚未发现对虎耳草愈伤组织代谢物诱导的研究，本申请是针对虎耳草繁殖率低，且药用成分不高，进行深入研究，以提高虎耳草愈伤组织的生根存活率，为广泛的种植提供种苗，并添加诱导子促进植物次生代谢产物的积累可提高药用植物的药用成分。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法。本发明是通过组织培养技术进行繁殖，可以不受地区与季节气候的限制，而且还具有繁殖系数大，培养周期短等特点。

本发明的技术方案：一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述方法是取虎耳草叶片清洗，选取佳灭菌组合进行消毒灭菌处理，放入培养基中经愈伤组织诱导生长阶段、愈伤组织增殖阶段和代谢物诱导培养阶段无菌培养。

前述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述方法是选取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，用洗涤剂水浸泡外植体后，用蒸馏水清洗，再于超净工作台进行消毒灭菌处理，切掉外植体四周边缘与消毒剂接触的部分，再切成长0.5cm*0.5cm的小片，接种在培养基中培养，在愈伤组织诱导生长阶段，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养，在愈伤组织增殖阶段，选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养，在代谢物诱导培养阶段，是将诱导子加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养。

前述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述诱导子为SA溶液或/和SNP溶液。

具体的说，前述SA溶液的配制：称取0.27624g～1.3812g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成20μmol/L～100μmol/L的SA溶液；

更具体的说，前述SA溶液的配制：称取0.55284g～0.82872g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L～60μmol/L的SA溶液；

具体的说，前述SNP溶液的配制：称取0.5959g～3.5754g的SNP，用无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配成20μmol/L～120μmol/L的SNP溶液。

更具体的说，前述SNP溶液的配制：称取1.1918g～2.3836g的SNP，用无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配成40μmol/L～80μmol/L的SNP溶液。

具体的说，前述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述加入SA溶液或SNP溶液的培育时间为5d。

前述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述佳灭菌组合为70％酒精40s和0.1％HgCl210min。

具体的说，前述述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，所述MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；所述培养基的PH:5.8～6.0；所述培养条件：光照：12h/d，光强度为1500～2500lx，温度：23～27℃。

与现有文件相比较本申请的有益效果：

1、在不同激素配比的培养基上进行无菌培养，优化虎耳草的组培条件，为虎耳草细胞培养体系打下基础，还能为虎耳草的广泛的种植提供种苗。愈伤组织诱导生长阶段使用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基，是绿色致密愈伤，质地硬，诱导率达到88.88％，愈伤组织增值生长阶段使用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基，其生长速率高达2.53，且芽头不会分化。

2、添加不同浓度的SA溶液、SNP溶液来提高虎耳草愈伤组织的岩白菜素、没食子酸、原茶儿酸等药用成分的含量，为虎耳草在栽培过程中提高次生代谢产物产量提供新途径。60μmol/L的SA处理下的愈伤组织中没食子酸含量最高，为0.1514％；40μmol/L的SA和40μmol/L的SNP处理的原茶儿酸含量最高，分别为0.0149％和0.0148％；40μmol/L的SNP处理的岩白菜素含量最高，为0.1554％；80μmol/L的SNP处理下的绿原酸含量最高，为0.0533％；60μmol/L的SA处理下的槲皮苷的含量最高，为0.0132％。

3、通过组织培养技术进行繁殖，可以不受地区与季节气候的限制，而且还具有繁殖系数大，培养周期短等特点，能为虎耳草细胞培养体系打下基础，还能为虎耳草的广泛的种植提供种苗，并添加诱导子促进植物次生代谢产物的积累可提高药用植物的药用成分。

发明人为验证本发明的效果进行了以下实验：

实验例：

一、虎耳草的组培条件的优化

1.1试验材料与试剂仪器

1.1.1试验材料

虎耳草(SaxifragastoloniferaMeerb.)。

1.1.2试验试剂

α-萘乙酸(NAA)(索莱宝)、6-苄基氨基喋呤(6-BA)(索莱宝)、氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、氯化汞、75％酒精、无水乙醇(分析纯)、琼脂(索莱宝)、蔗糖(分析纯)

1.1.3试验仪器

超净工作台(CJ-2D)、高压灭菌锅(GI80DS)、万分之一电子天平(奥豪斯AR224CN)、

1.2试验方法

1.2.1虎耳草叶片的灭菌

取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入1-2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台备用准备进行消毒处理。采用70％的酒精和0.1％氯化汞进行不同时间组合，具体消毒方式如下表1-1。在超净工作台上叶片用70％的酒精消毒对应时间后，用无菌水清洗5次，用0.1％氯化汞外植体进行灭菌相应时间，最后用无菌水清洗5-6次，每次摇洗时间1min左右，把消毒后的外植体放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，切掉外植体四周边缘与消毒剂接触的部分，再切成长0.5cm*0.5cm的小片，接种在1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA的培养基中，每处理接种20块叶片，重复3次。接种后培养30d内定期观察记录愈伤组织的颜色、质地和生长情况，出愈数及生长状况。蔗糖30g/L，琼脂6g/L，PH:5.8～6.0，光照：12h/d，光强度为1500-2500lx，温度：25(±2)℃。

表1-1：虎耳草叶片外植体的灭菌方案

处理	70％酒精/s	0.1％HgCl2/min
			1	20s	8min
2	20s	10min
			3	20s	12min
4	30s	8min
			5	30s	10min
6	30s	12min
			7	40s	8min
8	40s	10min
			9	40s	12min

1.2.2虎耳草叶片愈伤组织的诱导

试验以虎耳草叶片为外植体，以MS基本培养基，通过添加不同浓度的6-BA和NAA激素对虎耳草愈伤组织的诱导。按“1.2.1”的步骤接种在下列配方中，每处理接种30块叶片，重复3次。接种后培养30d内定期观察记录愈伤组织的颜色、质地和生长情况，出愈数及愈伤组织生长状况。蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，PH:5.8～6.0，光照：12h/d，光强度为1500-2500Lx，温度：25(±2)℃，具体试验设计如下：表1-2。

表1-2：虎耳草叶片愈伤诱导增殖方案

处理	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)
			1	1	0.1
2	1	0.2
			3	1	0.3
4	2	0.1
			5	2	0.2
6	2	0.3
			7	3	0.1
8	3	0.2
			9	3	0.3

1.2.3虎耳草愈伤组织的增殖

将叶片诱导出的愈伤组织，选择选取长势良好，大小基本一致的愈伤组织转接到添加不同激素浓度的增殖培养基上，每个处理10瓶，每瓶3个，三个重复，培养20-30天统计增殖情况。增殖培养每20d继代1次。统计相对生长速率及生长情况。蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，PH:5.8～6.0，光照：12h/d，光强度为1500-2500Lx，温度：25(±2)℃，具体激素配比见表1-3。愈伤组织相对生长速率＝(收获愈伤组织鲜重—接入愈伤组织鲜重)/接入的愈伤组织鲜重

表1-3：愈伤组织增殖方案

处理	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)
			1	1	0.1
2	1	0.2
			3	1	0.3
4	2	0.1
			5	2	0.2
6	2	0.3
			7	3	0.1
8	3	0.2
			9	3	0.3

1.3结果与分析

1.3.1虎耳草叶片的灭菌

试验采用70％酒精和0.1％HgCl2联合处理虎耳草的叶片，不同灭菌组合时间对虎耳草叶片外植体的影响不同(见表1-4)。外植体的灭菌效果是直接影响到后续组织培养成功与否的关键因素，不同的消毒剂、消毒方式、消毒时间对外植体的存活率和感菌率影响较大，而单独使用一种消毒剂来进行消毒，外植体的污染率较高。因此大多外植体消毒一般采用的是两种不同消毒配合使用来进行消毒，从而得到无菌材料。由上表可得，虎耳草叶片外植体的存活率随着消毒时间的延长而先升高再降低，但污染率却是呈先下降再升高的趋势，而叶片褐化死亡率也缓慢升高。70％酒精消毒时间下，消毒时间20s和30s时，虎耳草叶片的存活率随着0.1％HgCl2消毒时间增加而增加，污染率则大致随着消毒时间增加而降低；而70％酒精灭菌40s时，随着0.1％HgCl2消毒时间增加而先增加后降低，污染率却是先降低后升高。在众多灭菌组合中，其中1处理70％酒精灭菌20s和0.1％HgCl2消毒8min的存活率最低，为22.22％，而感菌率却是最高，为60.00％，外植体表面存在一定褐化；而8处理70％酒精灭菌40s和0.1％HgCl2消毒10min的外植体的存活率最高，达到82.22％，且感菌率和褐化率是最低的，分别为6.67％和15.56％，证明虎耳草叶片外植体受到的损伤较轻。70％酒精和HgCl2都是一种灭菌效果较好的灭菌剂，但对外植体处理的时间越长，外植体的伤害就越重。综合分析试验的结果，对虎耳草叶片进行灭菌时，最佳的灭菌组合处理为8处理，灭菌时间处理组合为70％酒精40s和0.1％HgCl210min。

表1-4不同灭菌组合对虎耳草叶片的影响

1.3.2虎耳草叶片愈伤组织的诱导

为考察不同浓度的生长素和细胞分裂素配比对虎耳草叶片愈伤组织诱导的影响，设计不同浓度的NAA和6-BA的激素配比，探究两种激素配比对虎耳草叶片诱导愈伤组织的影响。不同浓度的NAA和6-BA配比对虎耳草叶片愈伤组织的诱导率和生长效果有着不同的效果，实验结果见表1-5。将无菌的虎耳草叶片接种在诱导愈伤组织的培养基中，经过5-6天左右的时间，虎耳草叶片开始慢慢弯曲，且有些虎耳草叶片伤口边缘部分逐渐由虎耳草叶片的深绿色转变为淡绿色；经过10-12天以后的时间，虎耳草的叶片开始膨大，叶片增重，愈伤组织在伤口处开始逐渐增多；经过20天左右时间，很明显的看出愈伤组织出现在伤口处，且不同浓度激素配比诱导出的愈伤组织也各不相同；在经30天左右时间，虎耳草叶片愈伤组织接触培养基部分开始变为褐色，且愈伤组织生长也比较缓慢。

植物生长调节剂对于植物组织培养过程中外植体在形态的建立，如不定根、不定芽、不定胚等的分化有着重要而显著的作用，其中影响最为显著的激素是生长素细胞分裂素，一般是两种激素混合使用，也有三种激素混合使用的。生长素和细胞分裂素的比值大小决定了愈伤组织的生长发育的方向，当生长素和细胞分裂素的比值高时，生长素占主导地位，此时有利于根的形成；比值较小的时候，细胞分裂素占主导地位，有利于促进芽的形成；而当比值对外植体诱导愈伤组织较为适中时，会有利于愈伤组织的形成，并不会有器官的分化。在1mg/L6-BA浓度的条件下，虎耳草叶片愈伤组织的诱导率随着NAA浓度的增加逐渐较小，愈伤组织颜色由白绿转为黄绿，由较密状态变为较疏松状态，质地也由偏硬转为偏软；2mg/L6-BA条件时，随着NAA的浓度的升高，诱导率呈先升高后降低的趋势，愈伤组织颜色由黄绿加深变为绿色再变浅为黄绿，由较密状态变为致密状态再变较密状态，质地也由偏硬转为硬再变为较软；而3mg/L6-BA的浓度条件时，随着NAA浓度的升高诱导率逐渐减小，愈伤组织颜色由黄绿加变浅为黄色再变深为黄绿，由较疏松状态变为较密状态再变较疏松状态，质地也由较软转为硬再变为较软。在9个处理中，3号和5号处理的叶片愈伤组织长势最好，3号处理的愈伤组织呈黄绿色疏松愈伤，质地软，5号处理的愈伤组织是绿色致密愈伤，质地硬，相比较5号处理的叶片的诱导率较高，为88.88％，且诱导出愈伤组织的量在众多处理中是最多的；2号、4号和6号处理的愈伤组织长势较好，1、7、8、9和10号处理的愈伤组织的长势一般，且这5个处理诱导的愈伤组织的量较少，并且整个叶片的形态弯曲度及膨大程度都不好(见图1-1)；在10个处理中，诱导率最高的是5号处理，而诱导率最低的是10号处理，且诱导率仅为12.22％，相较于5号处理，相差了76.66％。综上所述，对虎耳草叶片愈伤组织诱导和生长最优处理是5号处理：MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA。

表1-5不同激素组合对虎耳草叶片诱导愈伤组织的影响

注：+.一般 ++.较好 +++.旺盛

1.3.3虎耳草愈伤组织的增殖

不同植物生长调节剂和不同浓度的植物生长调节剂对愈伤组织的增殖生长有不同的影响作用，本试验选择了6-BA和NAA两种激素来处理虎耳草的愈伤组织，将虎耳草叶片诱导的愈伤组织转接在含有不同浓度的6-BA和NAA激素的MS培养基中进行愈伤组织的增殖，结果见表1-6和图1-2。在愈伤组织经过20-30天的生长，通过观察发现NAA和6-BA对虎耳草叶片愈伤组织对的增殖有着不同的作用；通过对9个处理的愈伤组织生长速率进行方差分析结果显示(见表1-7)，发现NAA激素、6-BA激素及NAA*6-BA的交互作用对虎耳草叶片愈伤组织增殖的生长速率的有着极显著的作用。当6-BA浓度为1mg/L时，随着NAA浓度的升高，虎耳草叶片愈伤组织增殖的生长速率先升高再降低，愈伤组织的颜色也随之加深，由乳白变为黄色，愈伤组织状态都为疏松；当6-BA浓度为2mg/L时，随着NAA浓度的升高，愈伤组织的生长速率也随之升高，颜色由黄绿加深变为绿色，状态都为致密。当6-BA浓度为3mg/L时，随着NAA浓度的升高，愈伤组织的生长速率呈先升高再降低的趋势，颜色却逐渐变由绿色变为深绿再变为黄绿色，愈伤组织状态都是致密。随着6-BA浓度的升高，愈伤组织的状态会由疏松状态开始加重变为致密，并且颜色也会逐渐向加深向绿色方向发育。在9个处理中，8号处理的虎耳草叶片愈伤组织增殖的生长速率最高，为2.94，1号处理的虎耳草叶片愈伤组织增殖的生长速率最低，仅为0.73，相较于8号处理生长速率相差了1.21，但是在后期对虎耳草愈伤组织进行继代增殖时，8号处理和7号处理会在光照条件下开始分化长出芽头，而后我们在进行再分化诱导丛生芽时可以考虑在这两个处理的条件下进行优化。

对外植体长出的愈伤组织进行继代增殖是让愈伤组织数量变多和进行愈伤组织再分化的一个重要的阶段，其愈伤组织的生长速率、颜色、状态及褐化率等对愈伤组织增殖是一些比较重要的指标，愈伤组织的生长速率适中，说明愈伤组织的质地生长的均匀，而褐化率越低，证明愈伤组织的活性越高。因此综合考虑，6号处理的6-BA和NAA激素配比为虎耳草叶片愈伤组织增殖的最适处理：MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。

表1-6不同激素组合对虎耳草愈伤组织增殖的影响

表1-7不同激素组合对虎耳草愈伤组织增殖的方差分析

方差来源	III类平方和	自由度	均方	F	显著性
						NAA浓度	0.987	2	0.494	11.517	0.001
6-BA浓度	7.640	2	3.820	89.117	0.000
						NAA浓度*6-BA浓度	5.142	4	1.285	29.987	0.000
误差	0.772	18	0.043
						总计	105.263	27

1.4结论

在对虎耳草的组培条件的优化的试验中，根据不同试验结果可得：(1)对耳草叶片进行灭菌时，最佳的灭菌组合处理为8处理，灭菌时间处理组合为70％酒精40s和0.1％HgCl210min。(2)对虎耳草叶片愈伤组织诱导和生长最优处理是5号处理：MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA。(3)对虎耳草叶片愈伤组织增殖的最适处理：MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。

1.5讨论

植物组织培养的成功与否，很大程度上的取决于培养基的选择，一般进行愈伤的诱导、增殖、或者丛生芽的增殖、生根等生长过程时，基本的培养基MS或者1/2MS就够用了，但是有些培养基是为某种类型的植物专门设计的，如B5培养基专为大豆组织培养，WPM培养基其氮含量较低，有利于木本植物的生长和分化，等等。除了培养基成分外，决定植物组织培养成败的另一个重要的因素是外植体的来源。然而外植体来源在选材方面基本选择的是生长健壮、无病虫害的、发育正常的较幼嫩的外植体，因为此种状态下的外植体的生活力较好，年老组织的外植体分化程度高，脱分化的就会越难。而为了得到较多的愈伤组织，需要进行愈伤组织的诱导，而虎耳草匍匐茎进行诱导时，会生成很多芽头，因此考虑用虎耳草的叶片来作为愈伤组织的外植体。然而在选择好合适的外植体时，对外植体进行合理合适的灭菌又是另一项重要任务，通过消除外植体上的杂菌来获得无菌外植体是植物组织培养成功的必要前提。虎耳草叶片两面含丰富的绒毛，且叶片上的毛孔也较大，因此需要对虎耳草叶片进行合适的灭菌程序。HgCl2和酒精是用途较为广泛的灭菌剂，单独使用任何一种的消毒效果都不太理想，若是结合使用，灭菌的效果会有很大的提高。酒精具有较强的穿透力和灭菌作用，氯化汞可以使得蛋白质变性，从而杀死菌体，因此本试验采用两者混合使用来进行灭菌。

在进行虎耳草的愈伤的诱导和增殖时，不同浓度的激素配比组合诱导出的愈伤组织和增殖的愈伤组织都是不一样的。在不同浓度的6-BA和NAA处理中，诱导出了白绿、黄绿、绿色、黄色四种不同的愈伤组织，但是最好的还是属2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA处理的愈伤组织最好，而黄绿色和黄色的愈伤组织，两种的状态较疏松，可以进行优化激素配比，向虎耳草愈伤组织的悬浮培养的方向靠拢。在进行虎耳草叶片愈伤组织诱导时，需要注意的是自身操作时尽量操作规范，减少感菌的风险，并且在接种在培养基后，先进行2-3天的遮光处理，让外植体适应环境，再进行光照处理。而在进行愈伤组织诱导和增殖培养时，时间一般为30天，诱导时间合适，但是对于愈伤组织增殖时间太长，易导致愈伤组织褐化，并且虎耳草所含酚类物质较多，也有可能是6-BA更加的促进了多酚氧化酶的活性，增加了褐化的几率，因此需要缩短增殖培养时间。不同激素对虎耳草愈伤组织增殖处理中，6-BA浓度越高，愈伤组织的状态越致密，且颜色偏绿，而且愈伤组织表面会偏红绿，有可能是因为在光的诱导下，开始逐渐长出芽头，进行愈伤组织的分化生长，因为3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA和3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA两个处理下的愈伤组织在进行第二次或者第三次继代培养时，会长出一些芽头，所以才考虑用2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA这个处理来进行愈伤组织的增殖。

二、不同诱导子对虎耳草愈伤组织的影响

2.1试验材料与试剂仪器

2.1.1试验材料

由虎耳草叶片诱导出的愈伤组织，并进行愈伤组织增殖而得到的材料。

2.1.2试验试剂

甲醇(色谱级)、超纯水、没食子酸标准品(批号：1110O021)、原茶儿酸标准品(批号：402D023)、岩白菜素(批号：918B022)、绿原酸(批号：SC8210)、槲皮苷(批号：719J021)、槲皮素(批号：1115N021，所有标准品都是北京索莱宝科技有限公司提供)、磷酸(分析纯，)水杨酸(分析纯)、亚硝基铁氰化钠(SNP，分析纯)、茉莉酸甲酯(索莱宝)

2.1.3试验仪器

万分之一电子天平(奥豪斯AR224CN)、十万分之一天平(奥豪斯PX85ZH)、超纯水制水机、Waterse2695型高效液相色谱仪、色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(250mm*4.6,5μm)、超声波清洗机(信仪SB-5200DT)、球磨仪(Retsch，MM400)

2.2试验方法

2.2.1SA的配置及处理

用十万分之一天平称量0.27624g的SA，加95％乙醇溶解后用无菌水定容至100mL，配成20μmol/mL的溶液，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌。在配置好MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基后，进行高压灭菌，取出后放置已经过紫外灭菌的超净工作台上，待冷却至50℃-60℃时，分别加入适量经过灭菌的SA溶液，分别配制成含0μmol/LSA，20μmol/LSA，40μmol/LSA，60μmol/LSA，100μmol/LSA的培养基，以不加SA为对照，每个组培瓶接种3个愈伤组织，10瓶为一个处理，每个处理三个重复。在愈伤组织培养5d后收获，用滤纸吸干愈伤组织表面的水分，然后放置在60℃的烘箱中烘干，用球磨仪打粉后放置备用。

2.2.2SNP的配置及处理

用万分之一天平称量2.9795g的SNP，用无菌水定容至100mL，配成100μmol/mL的溶液，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌。在配置好MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基后，进行高压灭菌，取出后放置已经过紫外灭菌的超净工作台上，待冷却至50℃-60℃时，分别加入适量经过灭菌的SNP溶液，分别配制成含有0μmol/LSNP，20μmol/LSNP，40μmol/LSNP，80μmol/LSNP，120μmol/LSNP的培养基，以不加SNP为对照，每个组培瓶接种3个愈伤组织，10瓶为一个处理，每个处理三个重复。在愈伤组织培养5d后收获，用滤纸吸干愈伤组织表面的水分，然后放置在60℃的烘箱中烘干，用球磨仪打粉后放置备用。

2.2.3MeJA的配置及处理

取573μL的MeJA用95％乙醇定容至5mL，配制成0.5mol/L的母液，再将母液稀释配制成100μmol/mL的MeJA溶液，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌。在配置好MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基后，进行高压灭菌，取出后放置已经过紫外灭菌的超净工作台上，待冷却至50℃-60℃时，分别加入适量经过灭菌的MeJA溶液，分别配制成含有0μmol/LMeJA，20μmol/LMeJA，40μmol/LMeJA，80μmol/LMeJA，120μmol/LMeJA的培养基，以不加MeJA为对照，每个组培瓶接种3个愈伤组织，10瓶为一个处理，每个处理三个重复。在愈伤组织培养5d后收获，用滤纸吸干愈伤组织表面的水分，然后放置在60℃的烘箱中烘干，用球磨仪打粉后放置备用3.3虎耳草愈伤组织中六种成分提取及含量的测定

2.3虎耳草愈伤组织成分测定

2.3.1对照品溶液的制备

精密称定没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素的对照品适量于容量瓶，加入甲醇定容，配制成没食子酸0.0330mg/L、原茶儿酸0.0450mg/L、岩白菜素0.2683mg/L、绿原酸0.0660mg/L、槲皮苷0.1617mg/L、槲皮素0.0473mg/L的混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备

取经过60℃烘干、过60目筛子的虎耳草愈伤组织粉末0.5g，放置在50mL锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，称定重量，在超声功率为250W，40kHz，50℃的条件下水浴超声1h，放冷，用70％甲醇补足重量，摇匀，过滤，用0.22μm的针孔滤膜过滤，得供试品溶液，待测。

2.3.3色谱条件

色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18色谱柱(250mm*4.6,5μm)；流速为1.0mL/min，柱温为25℃，紫外检测波长为270nm；进样量为10μL，流动相为以有机相(甲醇A)—水相(0.1％磷酸溶液B)进行梯度洗脱(见表2-1)。

表2-1流动相梯度洗脱

时间(min)	有机相(％)	水相(％)
			0	15	85
10	15	85
			15	25	75
20	27	73
			25	35	65
30	45	55
			45	60	40
50	15	85

2.3.4方法学考察

2.3.4.1精密度试验

取盆栽里的虎耳草药材供试品1份，照“2.3.2”项的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下的色谱条件进行测定，重复进样6次，每次进样量10μL，测得虎耳草没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为1.32％、2.66％、1.20％、0.29％、2.19％、2.16％，结果RSD值都小于3％，表明仪器精密度良好。结果见表2-2。

表2-2精密度考察结果

2.3.4.2重复性试验

取盆栽里的虎耳草药材供试品6份，照“2.3.2”项的方法制备供试品溶液6份，按“2.3.3”项下的色谱条件进行测定，每次进样量10μL，测得虎耳草没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为1.91％、2.80％、1.55％、1.11％、0.95％、2.30％，结果RSD值都小于3％，表明该样品的制备方法重复性良好。结果见表2-3。

表2-3重复性性考察结果

2.3.4.3稳定性试验

取盆栽里的虎耳草药材供试品1份，照“2.3.2”项的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下的色谱条件进行测定，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，进样量10μL，测得虎耳草没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素的峰面积，分别计算其RSD值为2.17％、2.70％、1.93％、0.34％、2.57％、2.26％，结果RSD值都小于3％，表明该样品的在24h内稳定。结果见表2-4。

表2-4稳定性考察结果

2.3.5线性关系的考察

分别精密量取混合对照品溶液2μL、4μL、8μL、10μL、15μL，按照按“2.3.3”项下的色谱条件进行测定，记录没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素的峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积(单位：万)为纵坐标绘制没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素等6个成分的标准曲线，结果见图2-1至图2-6。没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素等6种成分的回归曲线及线性范围的结果见表2-5和2-6。

表2-5线性关系测定结果

表2-6 6种成分的回归方程及线性范围

化合物	线性回归方程	R2	线性范围/μg
				没食子酸	y＝320.51x-0.8627	R2＝0.9994	0.06600-0.49500
原茶儿酸	y＝239.86x-2.1804	R2＝0.9996	0.09000-0.67500
				岩白菜素	y＝136.93x+3.372	R2＝0.9991	0.53670-4.02500
绿原酸	y＝92.371x-2.147	R2＝0.9995	0.13200-0.99000
				槲皮苷	y＝196.77x+10.952	R2＝0.9993	0.32334-2.42505
槲皮素	y＝286.12x-2.9132	R2＝0.9996	0.09466-0.70995

2.3.6加样回收率的试验

精密称取已知各成分含量盆栽虎耳草粉末6份，每份0.5g，分别精密加入没食子酸对照品0.825mg、原茶儿酸1.125mg、岩白菜素6.7mg、绿原酸1.65mg、槲皮苷4.05mg、槲皮素1.175mg，按“3.3.2供试品溶液的制备”，然后按照“2.3.3色谱条件”进行测定，结果如表2-7至表2-12，RSD，和图2-7、图2-8。

表2-7没食子酸加样回收考察

表2-8原茶儿酸加样回收考察

表2-9岩白菜素加样回收考察

表2-10绿原酸加样回收考察

表2-11槲皮苷加样回收考察

表2-12槲皮素加样回收考察

2.4虎耳草愈伤组织样品的测定结果

2.4.1SA对虎耳草愈伤组织中成分的影响

添加不同的SA于虎耳草愈伤组织培养基中，对虎耳草愈伤组织内的没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素含量的影响如图2-9所示。由不同浓度的SA对虎耳草愈伤组织中6种化学成分的影响进行方差分析可得：不同浓度的SA对虎耳草愈伤组织中原茶儿酸含量的影响不显著，对没食子酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素含量有显著的影响。随着SA浓度的升高，虎耳草愈伤组织中没食子酸呈先升高再降低趋势，其中SA浓度为60μmol/L时没食子酸含量最高，为0.1514％，比对照组的0.0648％增加了0.0866％，两者之间存在着显著差异；不同SA浓度对虎耳草愈伤组织原茶儿酸含量的影响整体呈现先上升再下降的趋势，其中40μmol/L的SA的处理下原茶儿酸的含量最高，为0.0149％，比最小值20μmol/L处理下的原茶儿酸含量0.0131％高了0.0018％，并且两者之间存在显著差异；不同浓度SA对虎耳草愈伤组织中岩白菜素的含量影响呈随着SA浓度的升高，岩白菜素含量先升高再降低的趋势，40μmol/L的SA处理下的岩白菜素的含量最高，为0.1387％，比对照组的0.0972％要高出0.0415％，并且两者之间有显著的差异；不同浓度的SA对虎耳草愈伤组织中绿原酸含量的影响整体上呈随着SA浓度的升高，绿原酸含量先升高再降低的趋势，40μmol/L的SA的处理下的愈伤组织中绿原酸的含量最高，为0.0479％，比含量最低的处理20μmol/L下的0.0249％要高出0.023％，且两者间存在显著差异；不同浓度的SA对虎耳草愈伤组织中槲皮苷含量的影响整体上呈随着SA浓度的升高，槲皮苷的含量逐渐先升高再降低的趋势，60μmol/L的SA处理下愈伤组织中槲皮苷含量最高，为0.0132％，与对照组相比高出了0.0131％，并存在显著差异；不同浓度的SA对虎耳草愈伤组织中槲皮素含量的影响整体上呈随着SA浓度的升高，槲皮素的含量逐渐升高的趋势，100μmol/L的SA处理下愈伤组织中槲皮素含量最高，为0.0093％，与对照组相比高出了0.0093％，两者之间存在显著差异。

根据不同浓度的SA处理对虎耳草愈伤组织中化学成分的影响实验结果可知，在SA的实验浓度范围内，低浓度的SA均可促进虎耳草愈伤组织中没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷含量的增加，高浓度则抑制其生成，对槲皮素则是促进作用。

2.4.2SNP对虎耳草愈伤组织中成分的影响

添加不同的SNP于虎耳草愈伤组织培养基中，对虎耳草愈伤组织内的没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素含量的影响如图2-10所示。由不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中6种化学成分的影响进行方差分析可得：不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中槲皮素含量的有显著的影响，对没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷的含量影响没有显著作用。不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中没食子酸的含量的影响整体上呈随着SNP浓度的升高，没食子酸的含量先升高再降低的趋势，20μmol/L的SNP处理下的没食子酸含量最高，为0.0908％，与含量最低的100μmol/L处理下的0.0610％相比高出了0.0298％，两者之间存在着显著差异；不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中原茶儿酸含量的影响呈随着SNP浓度的升高而先升高再降低的趋势，40μmol/L的SNP处理下的原茶儿酸含量最高，为0.0148％，与含量最低的120μmol/L处理下的0.0116％高出了0.0032％，两者之间差异不显著；不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中岩白菜素含量的影响呈随着SNP浓度的升高而先升高再降低的趋势，40μmol/L浓度的SNP处理下岩白菜素含量最高，为0.1554％，与含量最低的120μmol/L处理下的0.0867％高出了0.0687％，并且存在着显著差异；不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中绿原酸含量的影响整体上呈随着SNP浓度的升高而先升高再降低的趋势，80μmol/L浓度的SNP处理下绿原酸含量最高，为0.0533％，与含量最低的120μmol/L处理下的0.0220％高出了0.0313％，两者之间没有显著差异；不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中槲皮苷含量的影响呈随着SNP浓度的升高而先升高再降低的趋势，20μmol/L浓度的SNP处理下槲皮苷含量最高，为0.0098％，与对照组的0.0010％高出了0.0088％，两者之间没有显著差异；不同浓度的SNP对虎耳草愈伤组织中槲皮素含量的影响整体上呈随着SNP浓度的升高而先升高再降低的趋势，20μmol/L浓度的SNP处理下槲皮素含量最高，为0.0106％，比对照组高出了0.0106％，两者之间存在着显著差异。

根据不同浓度的SNP处理对虎耳草愈伤组织中五种药用成分的影响实验结果可知，在SNP的实验浓度范围内，低浓度的SNP均可促进虎耳草愈伤组织中没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷、槲皮素含量的增加，高浓度则抑制其生成。

2.4.3MeJA对虎耳草愈伤组织中成分的影响

添加不同的MeJA于虎耳草愈伤组织培养基中，对虎耳草愈伤组织内的没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷含量的影响如图2-11所示。由不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中6种化学成分的影响进行方差分析可得：不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中岩白菜素、绿原酸的含量有显著的影响作用，对没食子酸、原茶儿酸、槲皮苷的含量影响不显著。不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中没食子酸的含量的影响呈随着MeJA浓度的升高，没食子酸的含量逐渐降低的趋势，对照组的处理下的没食子酸含量最高，为0.0647％，与含量最低的120μmol/L的MeJA处理下的0.0328％相比高出了0.0319％，两者之间存在着显著差异；不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中原茶儿酸含量的影响整体上呈随着MeJA浓度的升高而先升高再降低再升高的趋势，120μmol/L的MeJA处理下的原茶儿酸含量最高，为0.0148％，与80μmol/L的MeJA的0.0131％高出了0.0017％，两者之间没有显著差异；不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中岩白菜素含量的影响呈随着MeJA浓度的升高而再降低的趋势，20μmol/L浓度的MeJA处理下岩白菜素含量最高，为0.1085％，与含量最低的120μmol/L处理下的0.0785％高出了0.0297％，两者之间存在着显著差异；不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中绿原酸含量的影响整体上呈随着MeJA浓度的升高而先降低再升高再降低的趋势，对照组的绿原酸含量最高，为0.0252％，与含量最低的40μmol/L的MeJA处理下的0.0226％高出了0.0026％，两者之间存在着显著差异；不同浓度的MeJA对虎耳草愈伤组织中槲皮苷含量的影响呈随着MeJA浓度的升高而先升高再降低的趋势，80μmol/L浓度的MeJA处理下槲皮苷含量最高，为0.0117％，与对照组的0.0010％高出了0.0107％，两者之间存在着显著差异。

根据不同浓度的MeJA处理对虎耳草愈伤组织中五种药用成分的影响实验结果可知，在MeJA的实验浓度范围内，低浓度的MeJA均可促进虎耳草愈伤组织中原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷含量的增加，高浓度则抑制其生成，而MeJA虎耳草愈伤组织中没食子酸有抑制作用。

2.5小结

将不同浓度的SA、SNP和MeJA分别添加在虎耳草愈伤组织增殖培养基中，不同浓度的SA、SNP和MeJA对虎耳草愈伤组织中药用成分有不同的影响作用。60μmol/L的SA处理下的愈伤组织中没食子酸含量最高，为0.1514％；40μmol/L的SA和40μmol/L的SNP处理的原茶儿酸含量最高，分别为0.0149％和0.0148％；40μmol/L的SNP处理的岩白菜素含量最高，为0.1554％；80μmol/L的SNP处理下的绿原酸含量最高，为0.0533％；60μmol/L的SA处理下的槲皮苷的含量最高，为0.0132％。

2.6讨论

研究表明，添加不同诱导子能够促进不同植物愈伤组织中次生代谢的合成，不同诱导子对同一植物愈伤组织中的各成分影响的趋势和含量各不相同，在MeJA的处理条件下，虎耳草愈伤组织中没食子酸的含量逐渐降低的趋势，而白菜素含量的影响呈随着MeJA浓度的升高而再降低的趋势。

在用诱导子对虎耳草愈伤组织进行处理时，SA浓度超过400μmol/L、SNP和MeJA的浓度超过200μmol/L，虎耳草愈伤组织就会开始慢慢褐化死亡，其原因可能是由于浓度太高，刺激虎耳草愈伤组织，损伤了细胞，使其愈伤组织的生长受到抑制。而在不同诱导子对虎耳草愈伤组织的处理时间上仅有5d，在前期处理时，虎耳草愈伤组织放置在含有诱导子的培养基里培养时，超过10天以上就会开始褐化死亡，因此缩短了培养时间，而愈伤组织在含有诱导子的培养基进行长时间培养时，可能会一直刺激着愈伤组织进行次生代谢物的合成，经过长时间的诱导子处理，会导致MDA的含量会增加，导致愈伤组织褐化死亡，也有可能是时间的增加，培养基中养分用完，虎耳草愈伤组织产生较多酚类物质导致开始褐化死亡。

三、总结

1、根据对虎耳草的组培条件的优化试验结果可得：(1)对虎耳草叶片进行灭菌时，最佳的灭菌时间及处理组合为70％酒精40s和0.1％HgCl210min。(2)虎耳草叶片愈伤组织诱导和生长阶段优选：MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA。(3)虎耳草叶片愈伤组织增殖阶段优选：MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。

2、将不同浓度的SA、SNP和MeJA分别添加在虎耳草愈伤组织增殖培养基中，不同浓度的SA、SNP和MeJA对虎耳草愈伤组织中各成分有不同的作用。60μmol/L的SA处理下的愈伤组织中没食子酸的含量最高，为0.1514％；40μmol/L的SA和40μmol/L的SNP处理的原茶儿酸和岩白菜素含量最高；40μmol/L的SNP处理的岩白菜素含量最高；80μmol/L的SNP处理下的绿原酸含量最高；60μmol/L的SA处理下的槲皮苷的含量最高，为0.0132％。

附图说明

图1-1 6-BA和NAA对虎耳草叶片愈伤组织的诱导图；

图1-2 6-BA和NAA对虎耳草叶片愈伤增殖状态图；

图2-1没食子酸对照品的线性回归方程图；

图2-2原茶儿酸对照品的线性回归方程图；

图2-3岩白菜素对照品的线性回归方程图；

图2-4绿原酸对照品的线性回归方程图；

图2-5槲皮苷对照品的线性回归方程图；

图2-6槲皮素对照品的线性回归方程图；

图2-7标准品加样回收率HPLC图(1.没食子酸；2.原茶儿酸；3.岩白菜素；4.绿原酸；5.槲皮苷；6.槲皮素)；

图2-8样品加样回收率HPLC图(1.没食子酸；2.原茶儿酸；3.岩白菜素；4.绿原酸；5.槲皮苷；6.槲皮素)；

图2-9不同浓度SA对虎耳草愈伤组织影响；

图2-10不同浓度SNP对虎耳草愈伤组织影响；

图2-11不同浓度MeJA对虎耳草愈伤组织的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入1ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为6.0。

诱导子准备：称取0.55284g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SA溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将40μmol/L的SA溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为2000lx，温度为25℃。

实施例2。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗6次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取0.82872g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成60μmol/L的SA溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将60μmol/L的SA溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为2500lx，温度为27℃。

实施例3。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入1ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取1.1918g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将40μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为1500lx，温度为24℃。

实施例4。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗6次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取2.3836g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成80μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将80μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为1800lx，温度为23℃。

实施例5。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗6次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取0.5959g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成20μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养养20d；将20μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为2500lx，温度为26℃。

实施例6。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗6次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取0.82872g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成60μmol/L的SA溶液；称取2.3836g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成80μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养，培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养，培养20d；将60μmol/L的SA溶液和80μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为2000lx，温度为23℃。

实施例7。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入1ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台备用准备进行消毒处理。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为6.0。

诱导子准备：称取0.55284g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SA溶液；称取1.1918g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将40μmol/L的SA溶液和40μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为1500lx，温度为24℃。

实施例8。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入1ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为6.0。

诱导子准备：称取0.55284g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SA溶液；称取2.3836g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成80μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将40μmol/L的SA溶液和80μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为1500-2500lx，温度为25℃。

实施例9。

清洗：取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，进而对其深层清理，在杯中加水，放入2ml的洗洁精，制成洗涤剂水，浸泡外植体8min，经流水冲洗30min后，用蒸馏水清洗5次，将叶片表面水分用滤纸吸干，放置在超净工作台，备用。

消毒灭菌：取清洗好的虎耳草叶片，用75％的酒精浸泡40s，用无菌水清洗5次，每次摇洗1min，然后再用0.1％的升汞浸泡10min，用无菌水清洗6次，每次摇洗1min，放置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干表面的水分，备用。

培养基准备：MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；调节PH值为5.9。

诱导子准备：称取0.82872g的SA，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成60μmol/L的SA溶液；称取1.1918g的SNP，加95％乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L的SNP溶液；

培养：取清洗、消毒灭菌好的虎耳草叶片，选用MS+2mg/L6-BA+0.15mg/LNAA培养基培养30d；选用MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基增殖培养20d；将60μmol/L的SA溶液和40μmol/L的SNP溶液加入MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培养基重诱导培养5d。

培养条件设置为：在光照为12h/d，光强度为2000lx，温度为27℃。

Claims (3)

1.一种诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，其特征在于：所述方法是取虎耳草叶片清洗，选取灭菌组合进行消毒灭菌处理，放入培养基中经愈伤组织诱导生长阶段、愈伤组织增殖阶段和代谢物诱导培养阶段无菌培养；

所述次生代谢产物为没食子酸、原茶儿酸、岩白菜素、绿原酸、槲皮苷和槲皮素；

所述方法是选取虎耳草叶片在流水下用毛刷轻刷，去除表面灰尘、杂质，用洗涤剂水浸泡外植体后，用蒸馏水清洗，再于超净工作台进行消毒灭菌处理，切掉外植体四周边缘与消毒剂接触的部分，再切成长0.5cm*0.5cm的小片，接种在培养基中培养，在愈伤组织诱导生长阶段，选用MS+2mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA培养基培养，在愈伤组织增殖阶段，选用MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA培养基增殖培养，在代谢物诱导培养阶段，是将诱导子加入MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA培养基中诱导培养；

所述诱导子为SA溶液或/和SNP溶液；

所述SA溶液的配制：称取0.27624g~1.3812g的SA，加95%乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成20μmol/L~100μmol/L 的SA溶液；

所述SNP溶液的配制：称取0.5959g~3.5754g的SNP，用无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配成20μmol/L~120μmol/L的SNP溶液；

所述加入SA溶液或SNP溶液的培育时间为5d；

所述灭菌组合为70%酒精40s和0.1%HgCl₂ 10min；

所述MS是由30g蔗糖和6g琼脂加入到1L的MS培养基中制得；所述培养基的pH:5.8~6.0；培养条件：光照：12h/d，光强度为1500~2500lx，温度：23~27℃。

2.根据权利要求1所述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，其特征在于：所述SA溶液的配制：称取0.55284g~0.82872g的SA，加95%乙醇溶解后无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配制成40μmol/L~60μmol/L 的SA溶液。

3.根据权利要求1所述的诱导虎耳草愈伤组织次生代谢产物的方法，其特征在于：所述SNP溶液的配制：称取1.1918g~2.3836g的SNP，用无菌水定容至100mL，用0.22μm的有机滤膜过滤除菌，配成40μmol/L~80μmol/L的SNP溶液。

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