CN102783415A - 一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法。该方法是将无菌试管苗继代培养在添加一定浓度的卡那霉素（kanamycin）生长抑制培养基中，其配方为：MS+0.2mg/L NAA +80mg/L Kana +30g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH=5.8。在无污染情况下，试管苗能正常生长保存22～24个月以上，是对照不添加生长抑制物质的培养基保存时间的10～12倍，且在生长抑制培养基中生长的试管苗根系较发达、节间显著缩短、茎节数显著增加、茎杆明显增粗、叶色浓绿，特别是温室移栽成活率高达90%以上，是对照的5～8倍。

Description

一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法。 
背景技术
木薯为大戟科(Euphorbiaceae)、木薯属（Manihot）植物，该属有98个种，其中仅木薯（Manihot esculenta Crantz）一个栽培种，别名木蕃薯，树薯，Yuca, Tapioca 和Manioc，英文名为Cassava。在美洲已有五千年的栽培史，是全球三大薯类作物之一，种植面积约1800万公顷，仅次于马铃薯，大于甘薯，分布于南北纬30°之间，海拔2000米以下，迄今，木薯被广泛种植在非洲（49%）、亚洲（28%）和美洲（23%）的95个国家和地区，成为解决饥饿和贫困的重要热带作物，为超过8亿人口提供必需的热能来源和基本生活保障。特别是近年来木薯成为重要的能源作物，是生产燃料乙醇最适宜的淀粉原料之一。我国现有木薯栽培面积约50万公顷，主要分布于广西、广东和海南等热带、亚热带省区，产量的90%用于淀粉生产，其潜在栽培面积在300万公顷以上。 
木薯种质资源是遗传育种的基础，木薯属包括98个种，与木薯属近缘的几个属中尚有约60个种，即木薯的基因源包括了大约160个种。迄今，全球收集的木薯栽培种内遗传类型超过8000份，绝大多数来自热带美洲，部分来自非洲和东南亚国家。最近报告表明，大约20,000的木薯种质和野生种被保存在国际热带农业中心(CIAT)、国际热带农业研究所(IITA)和世界各地超过45个国家的国家保护区。 
木薯的体外繁殖和保护技术虽然已经很好地在许多基因库中得到开发和应用，但是特别在CIAT和IITA的木薯种质保存是最成功的范例。巴西、阿根廷、巴拉圭和古巴等国家项目计划中也积极推广离体保存技术。我国是木薯种质资 源匮乏的国家，在农业部948等项目资助下，目前收集国内外木薯优良新品种和特异种质资源500多份，各级优良品系5000多份，引进国外特异种子6万多粒，建立了我国唯一的国家级木薯种质资源圃，同时也建立了木薯种质资源的离体保存技术和离体保存库。众所周知，低温或超低温保存设备成本大、耗能高，如何在常温培养条件（25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期）下让保存的种质以缓慢发育，达到延长继代周期，减低培养成本的目的，是当前种质资源离体保存技术的一项重大任务。 
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，本发明是首次（创）利用卡那霉素（kanamycin）作为生长抑物质进行植物种质资源保存的方法，为木薯种质资源保存和创新利用提供了新的节能保存方法，极显著地节约了木薯种质资源保存过程中耗费的人工费、试剂药品费、水电能源等，对木薯产业可持续发展具有显著的生态、经济和社会效益。 
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，包括离体保存材料的外植体消毒处理、无菌试管苗获得和试管苗的继代培养，其具体步骤如下： 
1）、外植体消毒处理 
在大田或实验室盆栽苗中，切取木薯带芽嫩茎，除去叶片和部分叶柄后，用洗衣粉浸泡20min，接着用自来水冲洗20min，在超净工作台上先用浓度为75%酒精浸泡8s，再放入0.5%升汞（HgCl2）溶液中浸泡10～15min，用无菌水冲洗4～5次； 
2）、无菌试管苗获得 
将消毒后的嫩茎放在超净工作台上，切成单芽茎段，保留完整芽眼，并切除叶柄和茎段上、下端多余的部分，接种于以MS培养基为基本培养基，并添加奈乙酸(NAA)0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂9g/L固体培养基上；培养基用1 mol/L的氢氧化钠（NaOH），调整pH值至5.8，在121℃灭菌20分钟后即可；将消毒处理好的外植体接种于上述固体培养基上培养数周后，获得无菌试管苗；培养条件 为25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期； 
3）、试管苗的继代培养 
将经初代培养方法获得的无菌试管小苗，在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，把茎杆切成单芽茎段长约1.2～1.5cm，其中每个茎段含有一个健壮的节，节上部分长约0.4～0.5 cm，节下部分长约0.8～1 cm，并将茎段形态学下端插入固体继代培养基中；所述固体继代培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加NAA 0.2mg/L 、Kana 80mg/L、蔗糖 30g/L、琼脂 9g/L，pH 5.8；培养条件为25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期。 
在无污染情况下，试管苗能正常生长保存至22～24个月以上，是对照（不添加生长抑制的培养基）生长保存时间的10～12倍，在生长抑制培养基中保存的试管苗根系前期基本萌动，完全受抑制，后期逐步发达；木薯种质在整个保存期间生长非常缓慢，节间明显缩短，节数显著增加，茎杆明显增粗、绝大部分叶片颜色为新鲜绿色，基部叶片有少许变白，保存约24个月的试管苗温室移栽成活率高达90%以上，是对照的5～8倍。 
本发明工艺流程简单，通过对外植体的消毒处理、无菌试管苗获得、试管苗的继代培养三个步骤即可获得木薯种质资源的稳定高效保存，有效实现了节约能源、低炭环保和木薯种质资源大规模保存及综合利用的生态、经济和社会效益三者的有机结合。 
具体实施方式
为了详细说明本发明稳定高效的木薯种质资源离体保存方法的技术内容、构造特征、以下结合实施方式作进一步说明。 
稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，包括离体保存材料的外植体消毒处理、无菌试管苗获得、试管苗的继代培养，其具体步骤如下： 
1、外植体的消毒处理 
在大田或实验室盆栽苗中，切取木薯带芽嫩茎，除去叶片和部分叶柄后，用洗衣粉浸泡20min，接着用自来水冲洗20min，在超净工作台上先用75%酒精 浸泡8s，再放入0.5%升汞（HgCl2）溶液中浸泡10～15min，用无菌水冲洗4～5次。 
2、无菌试管苗获得 
将消毒后的嫩茎放在超净工作台上，切成单芽茎段，保留完整芽眼，并切除叶柄和茎段上、下端多余的部分，接种于以MS培养基为基本培养基，并添加奈乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂9g/L固体培养基上。培养基用1 mol/L的氢氧化钠（NaOH），调整pH值至5.8，在121℃灭菌20分钟后即可。将消毒处理好的外植体接种于上述固体培养基上培养数周后，获得无菌试管苗。培养条件为25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期。 
3、试管苗的继代培养 
将经初代培养方法获得的无菌试管小苗，在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，把茎杆切成单芽茎段长约1.2～1.5cm，其中每个茎段含有一个健壮的节，节上部分约0.4～0.5 cm，节下部分约0.8～1 cm长，并将茎段形态学下端插入固体继代培养基中。所述固体继代培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加NAA0.2mg/L 、Kana 80mg/L、蔗糖30g/L、琼脂9g/L，pH 5.8。培养条件同上。在无污染情况下，试管苗能正常生长保存至22～24个月，是对照（不添加生长抑制的培养基）生长保存时间的10～12倍，在生长抑制培养基中保存的试管苗根系前期基本不育，完全受抑制，后期逐步发达；木薯种质在整个保存期间生长非常缓慢，节间明显缩短，茎节数显著增加，茎杆明显增粗、绝大部分叶片颜色为新鲜绿色，基部叶片有少许变白，保存约24个月的试管苗温室移栽成活率高达90%以上，是对照的5～8倍。在生长抑制培养基（本发明培养基）和正常培养基（不添加生长抑制物质的培养基）中对木薯种质保存效果见表1。 
表1 不同培养基对木薯种质资源保存效果 
Figure BDA0000187866161
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。 

Claims (1)

1.一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，其特征在于，包括离体保存材料的外植体消毒处理、无菌试管苗获得和试管苗的继代培养，其具体步骤如下：
1）、外植体消毒处理
在大田或实验室盆栽苗中，切取木薯带芽嫩茎，除去叶片和部分叶柄后，用洗衣粉浸泡20min，接着用自来水冲洗20min，在超净工作台上先用浓度为75%酒精浸泡8s，再放入0.5%升汞溶液中浸泡10～15min，用无菌水冲洗4～5次；
2）、无菌试管苗获得
将消毒后的嫩茎放在超净工作台上，切成单芽茎段，保留完整芽眼，并切除叶柄和茎段上、下端多余的部分，接种于以MS培养基为基本培养基，并添加奈乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂9g/L固体培养基上；培养基用1 mol/L的氢氧化钠，调整pH值至5.8，在121℃灭菌20分钟后即可；将消毒处理好的外植体接种于上述固体培养基上培养数周后，获得无菌试管苗；培养条件为25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期；
3）、试管苗的继代培养
将经初代培养方法获得的无菌试管小苗，在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，把茎杆切成单芽茎段长1.2～1.5cm，其中每个茎段含有一个健壮的节，节上部分长0.4～0.5 cm，节下部分长0.8～1 cm，并将茎段形态学下端插入固体继代培养基中；所述固体继代培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加NAA 0.2mg/L 、Kana 80mg/L、蔗糖 30g/L、琼脂 9g/L，pH 5.8；培养条件为25±2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期。
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