CN102577874B - 花生转基因苗的移栽方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种花生转基因苗的移栽方法，包括如下步骤：1）出瓶，清除根部培养基，以无菌水冲洗、以适宜浓度生根剂、杀菌剂先后浸泡；2）准备合适的容器，内置灭过菌且疏松透气、保水性好的生长基质备用；3）移栽后在基质上层撒一层3-5mm厚的粗粒状蛭石达到抑菌效果，控制湿度、温度、光照及营养供给。利用本发明使得花生转基因苗成活率达到95%以上，且在整个生长周期生长旺盛，正常开花，平均每株结果6-11个，室内生长饱果数即可达到85%以上。突破了转基因花生移栽难、成活率低的瓶颈，很大程度上提高了花生遗传转化工作的效率，科研价值与社会效益显著。

Description

花生转基因苗的移栽方法

技术领域

本发明涉及一种高效提高花生转基因苗成活率的移栽方法，属于转基因花生组织培养技术领域。

背景技术

花生是重要的油料作物和经济作物，在世界范围内广泛种植，但其种质资源有限，在栽培生产中易受多种病虫害以及干旱等不利因素的影响，导致产量和品质下降。现代转基因技术的发展对提高花生抗性、改良花生品质，实现花生品种改良，发挥重要的作用。目前应用于花生的转基因技术以依赖组织培养的农杆菌介导法和基因枪法为主。同多数豆科作物一样，花生的遗传转化技术难度大，仍存在转化率低、再生频率和体细胞胚成苗率较低、品种基因型依赖以及移栽成活率低等难题。以花生组织培养为基础的遗传转化前期周期长，且由于花生自身特点以及技术限制，目前的花生遗传转化效率最高也只能达到4-5%，前期外植体制备以及筛选的工作量非常大。因此，后期提高阳性苗的成活率至关重要。

花生组培苗本身就存在移栽难度大，成活率低的瓶颈，而花生转基因苗由于阳性率低且某些外源基因的引入使转基因苗的生长特性异于普通栽培花生和普通的花生组培苗，因此必须建立一种高效提高花生转基因苗成活率的移栽方法，这是提高花生遗传转化效率的重要一环，也是节约时间成本和劳动成本的重要一环。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效提高花生转基因苗成活率的移栽方法，以提高花生遗传转化工作效率。

为达到上述目的，本发明采用以下步骤：

（1）出瓶，轻轻清除根部培养基，并以无菌水冲洗、以适宜浓度生根剂、杀菌剂先后浸泡。

（2）准备合适的容器，内置灭过菌且疏松透气、保水性好的生长基质备用。

（3）移栽，并在基质上层撒一层3-5mm厚的粗粒状蛭石达到抑菌效果，严格按生长阶段控制湿度、温度、光照及营养供给。

本发明进一步提供了上述提高花生转基因苗成活率的移栽方法的优选技术方案：

步骤（1）中所述的生根剂为3mg/L吲哚丁酸(IBA)和0.3mg/L α-萘乙酸（NAA），浸泡20分钟；杀菌剂为0.2%的高锰酸钾，浸泡30秒后以无菌水冲洗三次。

进一步优选的，所述的吲哚丁酸(IBA)和a-萘乙酸体积比为1:1。

步骤（2）所述的容器为底部带有透水孔，直径35-40cm，高度30-40cm的花盆。

所述的生长基质须灭菌备用，成分为7/10翠筠营养土、1/5砂土与1/10粗粒状蛭石的混合物（重量比），并以清水搅拌至水不滴漏为佳。

步骤（3）所述的移栽，先挖一个足够根伸展开的坑，深度控制在5cm左右，慢慢填土，第一节肉质茎埋入土中约1/2。

优选的，所述的生长时段湿度、光照强度为：

A. 移栽后三周内，室内湿度需控制在75%以上，光照强度为3000Lx，温度25℃；

B. 三周后，室内湿度可降至65%，光照强度为5000Lx，温度28℃；

C. 待转基因花生苗长至10-15cm高，且叶色正常，长势良好，即可移至室外（温度需25℃以上），或者加强室内光照强度至10000Lx，温度仍设为28℃。

进一步优选的，移栽后一周内不另外浇水，降低污染机率及防止烂根；一周后置1/2 MS液体培养基 (去掉有机成分)于容器底盘中，以基质自行吸附方式补充营养与水分。之后可保持一周浇水一次的频率，水量保持在浇水后一天底盘中水被吸干为宜。

利用本发明使得花生转基因苗成活率达到95%以上，且在整个生长周期生长旺盛，正常开花，平均每株结果6-11个，室内生长饱果数即可达到85%以上。突破了转基因花生移栽难、成活率低的瓶颈，很大程度上提高了花生遗传转化工作的效率，科研价值与社会效益显著。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

将30株经过炼苗的花育26转基因苗出瓶，该批苗是通过农杆菌侵染获得的SAD基因超量表达苗。用镊子轻轻清除根部培养基，先以3mg/LIBA和0.3mg/L NAA浸泡根部20分钟；然后用0.2%的高锰酸钾浸泡30秒后以无菌水冲洗三次。移栽至事先灭过菌的生长基质中。该生长基质为7/10翠筠营养土、1/5砂土与1/10粗粒状蛭石的混合物，所用容器最宽直径40cm，高35cm，底部带有透水孔。移栽过程保证所有的根伸展开，慢慢填土，第一节肉质茎埋入土中约1/2。最上层覆盖一层3mm厚的粗粒状蛭石抑菌。移栽后一周内不另外浇水，降低污染几率及防止烂根；一周后置1/2 MS液体培养基 (去掉有机成分)于容器底盘中，以基质自行吸附方式补充营养与水分。之后可保持一周浇水一次的频率，水量保持在浇水后一天底盘中水被吸干为宜（约500ml）。移栽后三周内，由于根系不发达，室内湿度控制在75-80%，光照强度为3000Lx，温度25℃；三周后室内湿度降至65%，光照强度为5000Lx，温度28℃；29株转基因花生苗长叶色正常，长势良好，长至10-15cm高后，加强室内光照强度至10000Lx，温度仍设为28℃。移栽后29株苗（97%）成活且生长旺盛，正常开花，平均每株结果7-11个，饱果率约90%。

实施例2

将25株经过炼苗的花育17转基因苗出瓶，该批苗是通过农杆菌侵染获得的KASⅡ基因超量表达苗。用镊子轻轻清除根部培养基，先以3mg/LIBA和0.3mg/L NAA浸泡根部20分钟；然后用0.2%的高锰酸钾浸泡30秒后以无菌水冲洗三次。移栽至事先灭过菌的生长基质中。该生长基质为7/10翠筠营养土、1/5砂土与1/10粗粒状蛭石的混合物，所用容器最宽直径40cm，高35cm，底部带有透水孔。移栽过程保证所有的根伸展开，慢慢填土，第一节肉质茎埋入土中约1/2。最上层覆盖一层5mm厚的粗粒状蛭石抑菌。移栽后一周内不另外浇水，降低污染几率及防止烂根；一周后置1/2 MS液体培养基 (去掉有机成分)于容器底盘中，以基质自行吸附方式补充营养与水分。之后可保持一周浇水一次的频率，水量保持在浇水后一天底盘中水被吸干为宜（约500ml）。移栽后三周内，由于根系不发达，室内湿度控制在75-80%，光照强度为3000Lx，温度25℃；三周后室内湿度降至65%，光照强度为5000Lx，温度28℃；24株转基因花生苗长叶色正常，长势良好，长至10-15cm高后，加强室内光照强度至10000Lx，温度仍设为28℃。移栽后24株苗（95%）成活且生长旺盛，正常开花，平均每株结果6-10个，饱果率约85%。

Claims (4)

1.一种花生转基因苗的移栽方法，包括如下步骤：

（1）出瓶，清除根部培养基，以适宜浓度生根剂、杀菌剂先后浸泡，再以无菌水冲洗；

（2）准备合适的容器，内置灭过菌且疏松透气、保水性好的生长基质备用；

（3）移栽，并在基质上层撒一层3-5mm厚的粗粒状蛭石达到抑菌效果，控制湿度、温度、光照及营养供给，其中：

步骤（1）中所述的生根剂为3mg/L吲哚丁酸和0.3mg/L α-萘乙酸按体积比1:1混合，浸泡20分钟；杀菌剂为0.2%的高锰酸钾，浸泡30秒后以无菌水冲洗三次；

步骤（2）中所述的生长基质须灭菌备用，成分为重量比7/10翠筠营养土、1/5砂土与1/10粗粒状蛭石的混合物，并以清水搅拌至水不滴漏为佳；

所述的湿度、温度、光照强度为：

A. 移栽后三周内，室内湿度需控制在75%以上，光照强度为3000Lx，温度25℃；

B. 三周后，室内湿度可降至65%，光照强度为5000Lx，温度28℃；

C. 待转基因花生苗长至10-15cm高，且叶色正常，长势良好，即可移至室外，或者加强室内光照强度至10000Lx，温度仍设为28℃；和

移栽后一周内不另外浇水，降低污染机率及防止烂根；一周后置体积比1/2去掉有机成分的MS液体培养基于容器的底盘中，以基质自行吸附方式补充营养与水分，之后保持一周浇水一次的频率，水量保持在浇水后一天底盘中水被吸干。

2.根据权利要求1所述的移栽方法，其特征在于，步骤（2）所述的容器为底部带有透水孔，直径35-40cm，高度30-40cm的花盆。

3.根据权利要求1所述的移栽方法，其特征在于，步骤（3）所述的移栽，先挖一个足够根伸展开的坑，深度控制在5cm左右，慢慢填土，第一节肉质茎埋入土中约1/2。

4.根据权利要求1所述的移栽方法，其特征在于，所述的室外温度为25℃以上。