CN110699264B - 一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，属于病原微生物培养技术领域。本发明花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，包括菌种的活化、富集和扩大培养。本发明中的病原真菌在PDA固体培养基上生长缓慢，产孢时间在15天左右。采用本发明改良的方法进行培养，3‑4天菌丝体即可布满整个平板，长势良好。本发明的培养方法能够实现花生腐烂病病原真菌的快速、大量繁殖；满足了筛选花生抗病种质对病原真菌的大量需求。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物培养技术领域，具体涉及一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法。
背景技术
花生是一种在地上开花，形成果针后钻到地里结果的喜温豆科作物，是世界范围内广泛种植的油料和经济作物。但因其地下结果的特性，易受土传病害的影响。已报道的花生土壤侵染性病害有多种，包括真菌性病害、细菌性病害和线虫病害等。其中真菌病害主要有茎腐病、根腐病、果腐病等。这些真菌性病害往往导致花生苗期死亡或者地下根果腐烂。因真菌性病害导致的花生大面积腐烂减产甚至绝收多有报道，且在北方产区有连年加重之势，因此花生腐烂病病原真菌的筛选、培养和致病性研究变得尤为重要，它是研究花生抗真菌性腐烂病机制和选育抗病品种的前提和基础，也是防控花生腐烂病的关键。
目前，花生大多数病原真菌本身存在生长周期较长、传代慢的特点，因此要想快速获得致病性稳定的纯培养物，必须采用合适的选择性培养方法缩短传代周期。另外，花生抗病种质筛选、鉴定必须结合田间实验，需要大量的病原真菌，这无疑提高了病原真菌的快速、大量繁殖技术的难度。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，以满足筛选花生抗病种质对病原真菌的大量需求。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，包括菌种的活化、富集和扩大培养；
所述的活化是用挑取冻存菌株接种于5ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养8h；
所述的富集是指上述活化后的5ml培养液移入50ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养过夜；
所述扩大培养是指取1ml所述的富集培养液，涂布于PDA培养基平板上，晾干后，重复涂布两次，待晾干后置于25℃暗培养过夜。
在上述方案的基础上，所述的冻存菌株是由分离纯化的单菌落经快速传代至50代，保存的致病性稳定的菌株。
在上述方案的基础上，所述的快速传代是指：
(1)挑取单菌落接种于5ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养8h；
(2)取5ml(1)中的培养液移入50ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养过夜；
(3)最后将(2)中的培养液，涂布于PDA培养基平板上，晾干后，重复涂布两次，待晾干后25℃暗培养过夜；
(4)重复(1)～(3)将其传代至50代。
在上述方案的基础上，所述PDA液体培养基pH值为6.5。
在上述方案的基础上，所述病原真菌为尖孢镰孢菌。
在上述方案的基础上，所述尖孢镰孢菌为尖镰孢菌Hs-f，其分类命名为镰刀菌(Fusarium sp.)，于2019年08月29日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:18130，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，所述尖孢镰孢菌对花生腐烂病具有高致病性且无组织特异性。
在上述方案的基础上，所述尖孢镰孢菌对花生致病性为：茎腐病率达到50％以上、果腐病率达到50％以上、根腐病率达到30％以上。
本发明技术方案的优点
本发明中的病原真菌在PDA固体培养基上生长缓慢，产孢时间在15天左右。采用本发明改良的方法进行培养，3-4天菌丝体即可布满整个平板，长势良好。本发明的培养方法能够实现花生腐烂病病原真菌的快速、大量繁殖；满足了筛选花生抗病种质对病原真菌的大量需求。
具体实施方式：
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：菌种的分离筛选和纯化
在青岛莱西花生生产试验基地于收获期选取两个腐烂病发病比较严重的材料花育917和花育918，分别选取3株烂果率在50％以上的植株。将5株植株的病果混合后装入封口袋中，用放有冰袋的泡沫盒低温保存带回实验室，并置于4℃冰箱保存备用。
两个花生材料分别随机选取5个病果作为实验材料，并分别做三组重复实验。所有实验步骤均为无菌操作。病果用无菌水冲洗5次，去掉泥土与表面附着物，之后在超净工作台用无菌滤纸吸干水分并用灭过菌的剪刀剪碎外壳。取发黄发黑的籽仁，用灭菌的刀片切成0.5cm的小块，至于盛有10mL pH6.5的PDA液体培养基的三角瓶中，于摇床中以25℃、180rpm震荡过夜后，3000g离心3min，上清液按10-1、10-3、10-5进行梯度稀释后在平板上划线、分离。挑取形态不同的单菌落继续划线、纯化培养，所述的纯化方法为指用接种针挑取单菌落接种到10ml PH为6.5的液体PDA培养基中，25℃过夜培养，后3000g离心1分钟，去掉液体培养基，后用0.5ml液体PDA培养基重悬菌体，用划板法接种于10个固体PDA培养基上，以加大纯化量；直至获得纯培养物。采用传统的形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法(ITS序列测序)相结合，对纯培养的微生物进行鉴定分类。获得5株可能与花生腐烂病相关的菌株，且在两个花生材料中均存在。
对这5株菌分别进行致病性实验：对这5株菌分别进行致病性实验：选取40个感病花生品种、5种花生离体组织。结果表明：PPRF-01菌株对选取的40个感病品种的28个具有高致病性，对子叶、茎、根、鲜种子具有致病性；PPRF-02菌株对选取的40个感病品种的25个具有高致病性，对子叶、茎、根、鲜种子具有致病性。PPRF-03菌株对选取的40个感病品种的22个具有高致病性，对子叶、茎、鲜种子具有致病性。PPRF-04菌株对选取的40个感病品种的32个具有高致病性，对子叶、茎、根具有致病性。Hs-f(PPRF-05)为高致病性菌株，对选取的40个感病花生品种的5种花生组织致病率可达到100％，田间接种实验茎腐病率达到50％以上、果腐病率达到50％以上、根腐病率达到30％以上。
其中，Hs-f的形态学特征为：尖镰胞菌在PDA培养基平板上，气生菌丝白色絮状，培养30天中，培养基质由红色转为紫红色，在老熟菌丝上产生许多直径为1.5毫米的疏松絮状菌核，产生大型镰刀形分生孢子和小型椭圆形两种分生孢子。
Hs-f的ITS序列测定：通过挑取单菌落进行ITS区域PCR扩增检测，选取电泳条带明亮单一的样品，保存并测序。将测序结果提交到NCBI数据库进行blastn比较，并根据结果进行序列注释，并提交到GenBank上注册，序列号：MH368499。其ITS序列经比对与Fusariumoxysporum相似度为100％。结合形态学特征，鉴定该菌为尖镰孢菌属(Fusarium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2019年08月29日，保藏编号为CGMCC No.18130。
所述的Hs-f的ITS序列，如下所示：
SEQ ID No.1：
GATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGG
实施例2：Hs-f的快速培养方法
由于Hs-f菌株在PDA固体培养基上生长缓慢，产孢时间在15天左右，所以我们对其传代培养条件进行了改良。
首先挑取单菌落接种于盛有5ml PDA液体培养基的10ml离心管中，于摇床中以25℃、180rpm震荡培养8h。后取5ml培养液移入盛有50ml PDA液体培养基的三角烧瓶中，25℃、180rpm震荡培养过夜。最后将富集的培养液，涂布于9cm直径的PDA培养基平板上，在超净工作台上晾干后，重复涂布两次，待晾干后置于培养箱25℃暗培养过夜。且所用PDA液体培养基PH值为6.5。如此对所得纯培养进行快速传代至50代，保存致病性稳定的菌株。，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏。
为满足筛选花生抗病种质对病原真菌的大量需求，提供一种快速、大量繁殖的方法。
首先对冻存菌进行活化，取0.1ml冻存菌种接种于盛有5ml PDA液体培养基的10ml离心管中，于摇床中以25℃、180rpm震荡培养8h。后取5ml培养液移入盛有50ml PDA液体培养基的三角烧瓶中，25℃、180rpm震荡培养过夜。最后将富集的培养液，涂布于9cm直径的PDA培养基平板上，在超净工作台上晾干后，重复涂布两次，待晾干后置于培养箱25℃暗培养过夜。用此方法3-4天菌丝体即可布满整个平板，长势良好。而用传统的培养方法则需要15天。
实施例3：Hs-f菌株致病性鉴定方法
将感病鲜花生种子、花生幼苗根系、花生苗期茎部、花生幼苗子叶和花生叶片分别消毒、冲洗后，进行微创处理，置于培养皿中并接入直径为0.3cm的相应病原真菌菌丝体块，使花生组织与病原真菌实现共培养。于25℃培养箱暗培养，5天后观察统计侵染致病情况接种的鲜种子和其他组织的接种点发黄发黑至腐烂扩散。
Hs-f病菌对花生个组织及鲜种子具有极强的致病性，其中对鲜花生种子、幼苗根系、幼苗茎部、幼苗子叶和叶片的致病率均超过50％，具有极强的致病性。
该病菌对花生各组织的致病性统计如下：
表1Hs-f对花生各组织的致病性
| 组织 | 致病性 |
| 鲜花生种子 | 80％以上 |
| 幼苗根系 | 50％以上 |
| 幼苗茎部 | 80％以上 |
| 幼苗子叶 | 90％以上 |
| 花生叶片 | 50％以上 |
利用传统方法和本发明方法培养的菌块进行致病性鉴定对照试验，结果表明该菌在培养4天后致病性比传统方法培养15天的菌块在花生子叶上致病性强，接种点形成病斑较大；在花生茎部，接种点形成病斑较大；在鲜种子、花生叶片和花生根部致病性与传统方法相比没有明显变化。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
青岛市环境卫生发展中心
<120> 一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> 尖孢镰孢菌(Fusarium sp)
<400> 1
gatatgctta agttcagcgg gtattcctac ctgatccgag gtcaacattc agaagttggg 60
gtttaacggc gtggccgcga cgattaccag taacgagggt tttactacta cgctatggaa 120
gctcgacgtg accgccaatc aatttgagga acgcgaatta acgcgagtcc caacaccaag 180
ctgtgcttga gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc cgccagaata ctggcgggcg 240
caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt acttatcgca 300
ttttgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa gttttgattt 360
atttatggtt ttactcagaa gttacatata gaaacagagt ttaggggtcc tctggcgggc 420
cgtcccgttt taccgggagc gggctgatcc gccgaggcaa caagtggtat gttcacaggg 480
gtttgggagt tgtaaactcg gtaatgatcc ctccgcagg 519
Claims (5)
1.一种花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，其特征在于，包括菌种的活化、富集和扩大培养；
所述的活化是用挑取冻存菌株接种于5ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养8h；
所述的富集是指上述活化后的5ml培养液移入50ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养过夜；
所述扩大培养是指取1ml所述的富集培养液，涂布于PDA培养基平板上，晾干后，重复涂布两次，待晾干后置于25℃暗培养过夜；
所述PDA液体培养基pH值为6.5；
所述病原真菌为尖镰孢菌(Fusarium sp.) Hs-f，于2019年08月29日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO:18130，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.根据权利要求1所述花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，其特征在于，所述的冻存菌株是由分离纯化的单菌落经快速传代至50代，保存的致病性稳定的菌株。
3.根据权利要求2所述花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，其特征在于，所述的快速传代是指：
（1）挑取单菌落接种于5ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养8h；
（2）取5ml（1）中的培养液移入50ml PDA液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养过夜；
（3）最后将（2）中的培养液，涂布于PDA培养基平板上，晾干后，重复涂布两次，待晾干后25℃暗培养过夜；
（4）重复（1）~（3）将其传代至50代。
4.根据权利要求1所述花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，其特征在于，所述尖孢镰孢菌对花生腐烂病具有高致病性且无组织特异性。
5.根据权利要求4所述花生腐烂病病原真菌的快速培养方法，其特征在于，所述尖孢镰孢菌对花生致病性为：茎腐病率为50%以上、果腐病率为50%以上、根腐病率为30%以上。
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