KR101377808B1 - 푸사리움 그라미네아룸 ＦｇＶ1―ＤＫ21이 전달된 생물학적 방제를 위한 진균 및 이를 이용한 생물학적 방제방법 - Google Patents

푸사리움 그라미네아룸 ＦｇＶ1―ＤＫ21이 전달된 생물학적 방제를 위한 진균 및 이를 이용한 생물학적 방제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 푸사리움 그라미네아룸 FgV1-DK21이 전달된 생물학적 방제를 위한 진균 및 이를 이용한 생물학적 방제방법에 관한 것으로서, 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스가 인위적으로 전달된 생물학적 방제를 위한 진균, 이를 포함하는 생물학적 방제용 조성물 및 이를 이용한 생물학적 방제방법을 제공한다. 한편, 자연계의 병원성 야생종과 바이러스 인위적으로 삽입된 진균을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법을 제공한다. 또한, 원형질융합(protoplast fusion) 방법을 통하여 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스를 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공한다.

Description

푸사리움 그라미네아룸 ＦｇＶ1―ＤＫ21이 전달된 생물학적 방제를 위한 진균 및 이를 이용한 생물학적 방제방법{Fungi for biological control by transmission of Fusarium graminearum virus 1-DK21 and method for biological control using thereof}
본 발명은 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21)이 전달된 생물학적 방제를 위한 진균, 이를 포함하는 생물학적 방제용 조성물 및 이를 이용한 생물학적 방제방법에 관한 것이다.
살진균제가 식물병원성 진균에 의해 야기된 많은 질병을 효과적으로 억제할지라도, 여전히 진균성 병원균은 식물 질병에 있어서 주요한 원인 중에 하나이다. 살진균제 내성균주 발달 및 환경과 식품안전에 대한 대중적 관심의 증가로 인해, 저병원성 마이코바이러스(hypovirulent mycoviruses)의 응용에 기초한 생물학적 방제가 고려되고 있다.
식물병원성 진균 방제를 위한 마이코바이러스의 잠재성은 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)를 통해 최초로 보고되었다[1]. 하이포바이러스(hypovirus)를 이용한 생물학적 방제의 성공 여부는 표적 진균의 병원성을 감소 (저병원성을 유도하여) 시킬 수 있는지에 달려있다. 하이포바이러스(hypovirus)는 두 균주가 식물생육상 호환성(vegetatively compatible)이 있는 경우, 균사융합(hyphal fusion 또는 hyphal anastomosis)에 의해 저병원성 균주에서 병원성 진균 균주로 전염될 수 있으나, 하이포바이러스(hypovirus)는 세포외 루트에 의해서는 전염될 수 없다[2, 3]. 가깝게 연관된 진균 균주들만이 식물생육상 호환성이 있으므로, 농업 생태계에서 많은 진균 종들 사이에 식물생육상 비호환성(vegetative incompatibility)은 생물학적 억제제로서 하이포바이러스(hypovirus)의 사용에 주된 걸림돌이 되고 있다[4, 5].
이중쇄 RNA(double-stranded RNA; dsRNA) 마이코바이러스는 효모, 버섯 및 곰팡이(filamentous fungi)에서 발견되었다[6, 7, 8]. 이들은 바이러스 구조 및 유전체 구성면에서 5개 과(family)로 분류되지만, 몇몇의 경우는 속(genus) 또는 과(family)로 분류되지 않고 있다[9]. 이러한 점이 마이코바이러스가 식물 병원성 진균의 성장 및 병원성을 감소시킬 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. 상기 기재한 바와 같이, 병원성을 약화시키는 dsRNA 분자는 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)에서 발견되었으며, 5종의 마이코바이러스는 염기서열이 완전히 분석되었다[9]. 이들 중 크리포넥트리아 하이포바이러스 1(Cryphonectria hypovirus 1; CHV1)은 유럽에서 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)에 대한 생물농약(biological control agent)으로 성공적으로 사용되었다. 이렇게 CHV1으로 감염된 균주들은 독성 감소, 무성 및 유성포자 감소, 그리고 색소 생산 감소를 나타내었다. 그러나, 북아메리카에서는 숙주 진균이 바이러스 확산을 제한하는 다중 식물생육상 호환성 그룹(vegetative compatibility groups: VCGs)을 가지기 때문에 CHV1이 생물 농약으로서 성공을 거두지는 못하였다[10].
식물생육상 비호환성에 기인한 마이코바이러스 감염의 실패는 원형질 융합(protoplast fusion)을 이용하여 실험실에서 극복할 수 있다[11]. 원형질 융합을 통한 dsRNA 마이코바이러스의 감염은 아스퍼질러스(Aspergillus)와 푸사리움 포에(Fusarium poae) 및 로셀리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)를 포함하는 식물병원성 진균에서 보고되었다[12, 13, 14].
본 발명자들은 이미 푸사리움 그라미네아룸 DK21(Fusarium graminearum strain DK21) 균주로부터 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스를 분리하였다[15]. 계통학적 종 인식(genealogical concordance phylogenetic species recognition; GCPSR)에 따르면, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 종 복합체(Fg complex)는 13개의 독립적인 유전자 좌(loci)의 DNA 염기서열을 기초로 하여 13개의 계통학적으로 다른 종들을 포함하고 있다[16, 17]. DK21 균주는 선택된 유전자 DNA 염기서열을 이용한 GCPSR에 의해 푸사리움 부티이(Fusarium boothii)로 동정되었다. FgV1-DK21은 밀(wheat)에서 푸사리움 부티이(Fusarium boothii)의 균사(mycelial) 성장을 감소시키고, 색소 형성을 증가시켰으며, 병원성을 감소시켰다[15]. 6,621 뉴클레오타이드-코딩 가닥은 폴리아데닐화되며, 4개의 ORFs(open reading frames)(ORFs 1-4)를 포함한다[18]. ORFs 2-4의 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열 비교에서는 현재 GenBank에 게재된 다른 단백질 서열과는 관련이 없는 것으로 나타났으나, ORF1의 추정 아미노산 서열은 계통발생 분석을 통하여 추정 RNA-의존 RNA 폴리머라아제(RNA-dependent RNA polymerase: RdRp)를 암호화하는 것으로 나타났다. 한편 이는 일부 하이포바이러스(hypovirus)와는 다른 바이러스 분기군(clade)을 형성하고, 다른 마이코바이러스와는 관련성이 적은 것으로 나타났다[18]. FgV1-DK21은 외피 단백질을 암호화하지 않으나, 유전체 조직화와 적어도 2 이상의 서브게노믹 RNAs(subgenomic RNAs; sgRNAs) 축적은 FgV1-DK21이 아직 확정되지 않은 마이코바이러스의 속(genus)으로서 신규한 균주임을 나타낸다[18].
본 발명자들은 원형질 융합이 하이포바이러스의 숙주로서의 범위를 확대시킬 수 있고, 새로운 진균 숙주에서의 하이포바이러스-매개 변화를 연구하는데 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허출원 제10-2010-7018484호는 "신규 마이코바이러스, 식물 병해 진균 약독균주, 식물 병해 방제제, 마이코바이러스의 생산 방법, 식물 병해 진균 약독화 방법 및 식물 병해 방제 방법"에 관한 것으로서, 벼도열 병균을 억제하는 신규한 마이코바이러스를 개시하고 있으나, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스를 이용하고 있다는 기재나 원형질융합을 통해 푸사리움 속 진균을 억제한다는 기재는 없다.
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본 발명의 목적은 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스가 인위적으로 전달된 생물학적 방제를 위한 진균, 이를 포함하는 생물학적 방제용 조성물 및 이를 이용한 생물학적 방제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 자연계의 병원성 야생종과 바이러스 인위적으로 삽입된 진균을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 원형질융합(protoplast fusion) 방법을 통하여 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스를 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 제1의 양태는 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스가 인위적으로 전달된 생물학적 방제를 위한 진균을 제공한다.
상세하게는 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 2, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 3 및 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 4로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하며, 보다 상세하게는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제를 위한 진균을 제공한다.
또한, 상기 진균은 푸사리움 속 진균인 것을 특징으로 하고, 보다 상세하게는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 또는 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제를 위한 진균을 제공한다. 한편 상기 진균은 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제를 위한 진균일 수도 있다.
본 발명의 제2의 양태는 상기 진균을 포함하는 생물학적 방제용 조성물 및 이를 이용한 생물학적 방제방법을 제공한다.
생물학적 방제용 조성물은 본 발명에 따른 푸사리움 감염성 바이러스 또는 본 발명에 따른 생물학적 방제를 위한 진균 중 어느 하나를 적어도 함유하는 것을 전부 포함한다. 또한, 푸사리움 감염성 바이러스 또는 본 발명에 따른 생물학적 방제를 위한 진균을 모두 함유할 수도 있고, 그 밖의 성분을 함유할 수도 있다.
그 밖의 성분으로서, 예를 들면 소정의 담체, 점결제, 증점제, 고착제, 방부 방미제, 용제, 안정화제, 산화 방지제, 자외선 방지제, 결정 석출 방지제, 소포제, 물성 향상제, 착색제 등을 함유할 수도 있다. 또한, 다른 농약 성분, 예를 들면 살진드기제, 살선충제, 살균제, 항바이러스제, 유인제, 제초제, 식물 성장 조정제, 공력제 등을 함유할 수도 있다.
담체로는, 예를 들면 고체 담체·액체 담체 중 어느 하나 또는 둘 다 사용할 수 있다. 고체 담체로서, 예를 들면 전분, 활성탄, 대두 분말, 밀 분말, 나무 분말, 어류 분말, 분유 등의 동식물성 분말, 탈크, 카올린, 벤토나이트, 제올라이트, 규조토, 화이트카본, 클레이, 알루미나, 탄산칼슘, 염화칼륨, 황산암모늄 등의 광물성 분말을 들 수 있다. 액체 담체로서, 예를 들면 물, 이소프로필알코올, 에틸렌글리콜 등의 알코올류, 시클로헥사논, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노-n-부틸에테르 등의 에테르류, 케로신, 경유 등의 지방족 탄화수소류, 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 메틸나프탈렌, 용매 나프타 등의 방향족 탄화수소류, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류, 지방산의 글리세린에스테르 등의 에스테르류, 대두유, 유채씨유 등의 식물유를 들 수 있다.
점결제, 증점제, 고착제로서, 예를 들면 전분, 덱스트린, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸전분, 풀루란, 알긴산나트륨, 알긴산암모늄, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 구아검, 로커스트 빈 검, 아라비아 고무, 크산탄 검, 젤라틴, 카제인, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌·프로필렌 블록 중합체, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
본 방제제의 제형은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 유제, 현탁제, 분말제, 입제, 정제, 수화제, 수용제, 액제, 유동가능(flowable)제, 과립 수화제, 에어졸제, 페이스트제, 오일제, 유탁제 등의 형태를 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 생물학적 방제방법은, 특정한 식물에 부가하는 공정을 적어도 포함하는 것을 모두 포함한다. 식물에 방제제를 부가시키는 수단으로서, 예를 들면 방제제를 잎의 표면 또는 이면에 도포하는 방법, 소정의 담체 등을 이용하여 방제제를 잎의 표면 또는 이면에 부착시키는 방법, 방제제를 잎에 산포 또는 공급하는 방법 등을 들 수 있다.
방제제의 도포량 또는 산포량은 유효 성분의 농도, 제제의 형태, 대상 병해나 작물의 종류, 병해에 의한 피해의 정도, 시용 장소, 시용 방법, 시용 시기, 혼용·병용하는 약제나 비료 등의 사용량, 종류 등의 여러가지 조건에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 방제제를 잎 표면 또는 이면에 도포하거나 부착시킴으로써, 식물 병해를 억제할 수 있을 가능성이 있다.
본 발명은 진균을 주된 병의 원인으로 하는 모든 식물 병해에 적용할 수 있을 가능성이 있다. 적용 가능성이 있는 푸자리움 속 관련 식물 병해로서, 콩과 작물의 입고병, 감자과 작물의 덩굴쪼김병, 위조병, 건부병, 갈색 부패병, 박과 작물의 덩굴쪼김병, 가지과 작물의 위조병, 근부위조병, 반고병, 위조병, 십자화과 작물의 위황병 등이 있다.
본 발명의 제3의 양태는 자연계의 병원성 야생종과 바이러스 인위적으로 삽입된 상기 진균을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법을 제공한다. 상세하게는 상기 자연계의 병원성 야생종은 푸사리움 속 균주인 것을 특징으로 하고, 보다 상세하게는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 또는 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법을 제공한다. 한편 상기 자연계의 병원성 야생종은 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법일 수도 있다.
본 발명의 바이러스를 인위적으로 삽입하는 방법은 원형질체 또는 세포에 의한 직접적 흡수 방법을 포함한다. 이는 PEG 또는 전기천공 매개된 흡수, 입자 충격-매개된 전달 또는 미세주사에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 제4의 양태는 원형질융합(protoplast fusion) 방법을 통하여 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스를 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공한다.
상세하게는 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 2, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 3 및 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 4로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하며, 보다 상세하게는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스인 것을 특징으로 하는 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 진균은 푸사리움 속 진균인 것을 특징으로 하고, 보다 상세하게는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 또는 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)인 것을 특징으로 하는 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공한다. 한편 상기 진균은 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)인 것을 특징으로 하는 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법일 수도 있다.
한편, 보다 더 상세하게는 상기 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스를 포함하는 공여체(donor) 균주 및 수용체(recipient) 균주의 원형질을 준비하는 단계; 상기 공여체(donor) 균주 및 수용체(recipient) 균주의 원형질을 융합하는(protoplast fusion) 단계; 및 FgV1-DK21 바이러스가 감염된 균주를 선택 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 FgV1-DK21 바이러스를 자연적으로는 식물생육상 호환성(vegetatively compatable)이 없는 균주에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 원형질 융합이 유전적 다양성 및 다중 VCGs에 의한 전염의 장애를 극복할 수 있다. 또한 진균에 의한 질병을 억제하는데 있어서, FgV1-DK21를 이용하여 지속적이고 전염가능한 시스템으로 확대시킬 수 있다. 한편, 푸사리움속 진균에 속하는 식물병원균에 있어서 낮은 병원성을 나타냄에 따라 푸사리움속 진균에 의하여 피해가 나타나는 다양한 식물에 있어서 농약조성물로서 이용될 수 있다.
도 1은 하이그로마이신 B 내성 유전자를 가진 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum) 균주의 형질전환에 관한 것이다. (A)는 Kpn I으로 처리된 게노믹 DNAs의 서던 블랏 하이브리다이제이션(Southern blot hybridization) 결과이다. 하이그로마이신 B 내성 형질전환체는 플라스미드 pUCH1을 이용하여 진균 원형질을 형질전환해서 얻었다. 프로브(probe)는 hygB 유전자의 EcoR I 및 Hind III 처리 단편(1.4 kb)을 이용하였다. 레인 M, λDNA-Hind III 처리된 DNA 마커; 레인 1, 야생형 균주(wild-type); 레인 2, 하이그로마이신 B 내성 균주; 레인 3, 바이러스 감염된 균주(원형질 융합체). (B)는 접종 4일 후의 진균 콜로니에 대한 사진을 나타낸다.
도 2는 바이러스에 감염된 G418(제네티신) 내성 돌연변이 균주의 제작과정을 나타낸다. (A)는 G418(제네티신) 내성 돌연변이 균주의 제작 방법을 나타낸다. (B)는 Kpn I 및 Spe I 처리한 게노믹 DNAs의 서던 블랏팅(Southern blotting) 결과로서, 1.9 kb 제네티신 프로브를 가지고 하이브리다이제이션하였다. 레인 M, λ DNA-Hind III 처리된 DNA 마커; lane 1, 야생형 균주(wild-type); 레인 2, G418(제네티신) 내성 균주; 레인 3, 바이러스 감염된 균주(G418 선별). (C)는 접종 5일 후, 야생형 균주와 G418 내성 균주에 대한 무-바이러스 균주 및 바이러스 감염된 균주의 콜로니 형태를 나타낸다.
도 3은 진균 콜로니들의 표현형 및 푸사리움 균주들의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다. Fb = 푸사리움 부티이(F. boothii); Fg = 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum); Fa = 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum); Fo = 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici). (A)는 무-바이러스 균주(VF) 및 원형질 융합에 의해 바이러스 감염된 균주(VI)의 콜로니 형태를 나타낸다. (B)는 진균 균주들에 대한 dsRNA의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다. 레인 M, 1-kb 래더 DNA 사이즈 마커; 레인 1, 음성 대조군[negative control (no DNA 주형)]; 레인 2, 4, 6 및 8, 무-바이러스 균주; 레인 3, 5, 7 및 9, 바이러스 감염된 균주. FgV1-DK21의 RdRp 서열로부터 제작된 프라이머 쌍으로 RT-PCR 분석한 결과, 바이러스의 dsRNA가 존재함이 확인되었다.
도 4는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum)(A) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)(B) 균주의 히스톤 H3 서열의 비교 분석 결과를 나타낸다. VF = 무-바이러스 균주; VI = 바이러스 감염 균주. 고정된 염기서열 특성은 녹색으로 표시하였다. 염기서열 G(278 위치) 및 T(279 위치)는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에서 각각 다르게 고정되어 나타난다. 염기서열의 GenBank accession numbers는 다음과 같다. NRRL 6101 (AY452820.1), NRRL 13818 (AY452821.1), NRRL 26156 (AY452843.1), NRRL 28720 (AY452844.1), NRRL 5883 (AY452815.1), NRRL 6394 (AY452817.1), NRRL 13383 (AY452819.1),NRRL 28063 (AY452816.1), NRRL 28336 (AY452818.1), NRRL 29169 (AY452836.1), NRRL 31084 (AY452852.1).
도 5는 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum) 균주 복합체에 속하는 진균 균주로 접종한 밀 상부 작은 이삭(wheat head spikelets)에서의 병징을 나타낸다. 무감염 또는 FgV1-DK21로 감염된 각 균주의 분생포자 부유액(Conidial suspensions)이 밀에 접종되었다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다.
도 6은 토마토 묘목에서 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)의 무-바이러스 균주(VF) 및 바이러스 감염 균주(VI)의 병원성을 나타낸 결과이다. (A) 접종 3주후에 진균 균주에 의해 야기되는 병징 정도를 나타낸다. 병징 지수(Disease index)는 0-4 정도로 나눈다. 0, 건강한 식물; 1, 약간 부어오름 또는/및 구부러진 배축(bent hypocotyl); 2, 배축에 하나의 갈색 관다발(vascular bundle); 3, 적어도 2 이상의 갈색 관다발 및/또는 심각한 성장 장애(불균형 성장); 4, 적어도 3 이상의 갈색 관다발 및/또는 매우 작고 마르는 식물(또는 죽음). 결과는 PASW 통계분석 18.0(SPSS Inc.)을 이용하여, the General Lineal Model (GLM)에 의해 분석하였다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다. 바에 표시된 글자는 p≤0.05 에서의 의미있는 차이를 나타낸다. (B) 접종 4주 후의 토마토 묘목의 사진이다.
도 7은 dsRNA 감염에 의해 영향을 받은 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)의 표현형 및 성장률을 나타낸다. (A) 콜로니 형태, (B) RT-PCR 분석결과. EP155 (하이그로마이신 B 내성 돌연변이): 무-바이러스 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica), UEP: CHV1으로 감염된 EP155, 1-4: FgV1-DK21로 감염된 EP155. 레인 M, λ DNA-Hind III 처리된 DNA 마커; NC, DNA 주형 없음.
도 8은 사과에 접종 3주 후 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 균주의 병원성을 나타낸다. (A) 사과에서 각각의 균주에 의해 유도된 병징. 무감염 EP155 균주(EP155) 또는 CHV1 감염 EP155 균주(UEP) 또는 FgV1-DK21로 감염된 EP155 균주(1-4)의 배양액으로 접종한 사과를 나타낸다. (B) 진균 균주에 의해 유도된 병징의 크기를 나타낸다. 에러바는 표준 편차를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1 > 균주 배양 조건
본 발명에 이용된 균주들(표 1)은 25% 글리세롤(glycerol)로 -80℃에서 보관되었다가 필요시 포테이토 덱스트로즈 아가(Potato dextrose agar; PDA, Difco)에서 키워 사용하였다. 총 RNA의 추출을 위하여, 푸사리움 그라미네아룸 복합체(Fusarium graminearum complex)에 속하는 균주는 50ml의 액체 완전 배지(Complete medium; CM)에서 25℃, 150 r.p.m.에서 5일간 배양하였고, 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 균주는 EP 완전 배지에서 26℃, 120 r.p.m.에서 5일간 배양하였다. 균사는 Miracloth(Calbiochem)를 통하여 여과하여 모았고, 모아진 균사는 액체 성분을 제거하고, 액체 질소를 부어가며 막자사발로 고운 가루 상태로 갈아 사용하였다.
본 발명에 사용된 균주들
분류 특징 생식
F. boothii (Fb) Strain DK21; vius-free and virus-infected (GenR) 동주성
(Homothallic)
F. asiaticum (Fa) Strain 88-1 (HygBR) 동주성
(Homothallic)
F. graminearum (Fg) Strain DK3; virus-free (HygR) 동주성
(Homothallic)
F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fo) HygBR 무성생식
(Asexual)
Cryphonectria parasitica (Cp) HygBR 이주성
(Heterothallic)
HygBR: 하이그로마이신 B 내성, GenR: G418(제네티신) 내성; DK21 및 DK3 균주로부터 분리된 무-바이러스 균주는 단일 분생포자 분리(single conidial isolation)에 의해 얻었다.
< 실시예 2 > 항생제 저항성 균주제작
진균 균주의 원형질(protoplast)은 YPG 액체 배지(0.3% yeast extract, 1% peptone, 2% glucose)에서 자란 균사를 여과지에 걸러 모아 1M NH4Cl에 녹인 10mg/ml 드리세라제(driselase; InterSpex Products)에 30℃, 50 r.p.m.에서 3시간 처리하여 준비하였다. 20ug의 plasmid DNA는 1ml PEG (60% polyethylene glycol 3350, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM CaCl2) 용액과 함께 원형질 부유액에 첨가하였다. 하이그로마이신B 내성 형질전환체는 pUCH1 플라스미드을 이용하여 진균 원형질에 형질전환함으로써 얻었고, 80ug/ml hygromycin B가 포함된 배지에서 선별하였다. 제네티신 내성 균주의 경우는 pII99를 이용하였고, 무-바이러스 푸사리움 부티이의 원형질로 형질전환하였다. 형질전환에 따라, FgV1-DK21은 융합에 의해 감염되고, 50ug/ml 제네티신(Duchefa)이 포함된 PDA 배지에서 선별하였다.
게노믹 DNA 추출을 위해서 Fg 복합체에 속한 균주들은 액체 CM 배지에 접종하여 25℃, 150 r.p.m.에서 5일간 배양하였고, 멸균된 Whatman 여과지 2번으로 걸러 균사를 모았다. 균사는 물로 2번 세척하고, 핸드 타올로 물기를 제거한다. 균사 덩어리는 액체 질소와 막자 사발을 이용하여 곱게 갈았다. 가루 형태의 균사를 2ml 튜브에 옮겨 담고, 700 ul CTAB buffer [2% CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide), 20 mM EDTA, 0.1 M Tris-HCl, and 1.4 M NaCl]:2-mercaptoethaol (100:1)를 넣어 섞어 준 다음, 65℃에서 30분간 반응시킨다. 400 ul 클로로포름:이소아밀알콜 (24:1)를 더 넣고 잘 섞어주고 원심 분리 후 상층액은 새로운 튜브에 옮긴다. 그 다음, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)를 2번 처리하고, RNase A (20 μg/ml)를 넣어 37℃에서 1시간 반응시킨다. 게노믹 DNA를 이소프로파놀(isopropanol)에 침전시키고, 최종적으로 증류수를 넣어 펠릿(pellet)을 풀어준다. 하이그로마이신 B 저항성 균주의 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 위해, 게노믹 DNA는 KpnⅠ와 SpeⅠ/KpnⅠ로 각각 37℃에서 12시간 처리하여 0.8% 아가로스 젤 상에서 8시간 분리하였다. 아가로스 젤은 1.5 M NaCl 및 0.5N NaOH 용액으로 20분간 2번 반응시키고, 0.4N NaOH를 전이 완충액(transfer buffer)으로 하여, 나일론 전이막(nylon transfer membrane)으로 DNA를 이동시켰다.
프로브 라벨링(Probe labeling) 반응은 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 7 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 30 μCi [α-32P] dCTP, 3 mM dNTP mix, 10 pmoles random primers, 2U klenow fragment (TaKaRa)로 수행하였다. 하이브리다이제이션(hybridization) 이후에 상보적 염기에 붙지 않은 프로브는 low stringency wash buffer (2 X SSC, 0.1% SDS)와 high stringency wash buffer (0.1 X SSC, 0.1% SDS)로 씻어 제거한다. 하이브리다이제이션 시그널(hybridization signal)은 Bio-imaging Analyzer system (BAS-2500; Fuji Film)으로 확인하였다.
< 실시예 3 > PCR 및 염기서열 분석
번역 연장 인자(translation elongation factor; TEF)와 histone H3 유전자의 PCR 반응은 94℃/3분 (1회); 93℃/45초, 55℃/40초, 72℃/1분 (35회); 72℃/10분 (1회)의 조건에 따라 수행되었다. PCR 산물은 아가로스젤(agarose gel) 상에서 분리되어, QIAquickgel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. DNA의 염기서열은 서울대학교 National Instrumentation Center for Environmental Management의 ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems)로 확인되었고, 염기서열은 BLAST 와 Clustal W에 의해 분석되었다.
< 실시예 4 > 원형질 융합( protoplast fusion )
어린 균사는 5 mg/ml driselase와 8 mg/ml lysing enzyme (L1412; Sigma)를 녹인 1 M NH4Cl에 넣어 30℃, 60 r.p.m에서 3시간 반응시킨다. 생성된 원형질(protoplast)은 2,544 X g, 4℃로 10분간 원심분리하여 모은다. 그 후, 10 ml STC(1.2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM CaCl2)로 두 번 씻어 준 다음, 300 ul MMC buffer (0.6 M Mannitol, 10 mM MOPS pH 7.0, 10 mM CaCl2)에 풀어준다. 같은 양의 공여체(donor), 수용체(recipient) 원형질체 현탁액 (1 X 106 protoplasts/ml)은 하나의 15 ml 튜브에 넣고 섞은 다음, 얼음에 30분간 둔다. 여기에 500 ul의 PEG 용액 (60% PEG 3350, 10 mM MOPS pH 7.0, 10 mM CaCl2)를 넣어 20℃에서 20분간 반응시킨다. 이 혼합액에 PDB (Potato dextrose broth; Difco)를 700 ul를 넣어 섞어주고, 뚜껑을 닫은 다음 25℃ 암실에서 7일간 배양한다. 배양이 끝나면 300 ul를 15 ml YCDA (0.1% yeast extract, 0.1% casein hydrolysate, 0.5% glucose, 1.5% agar) 배지 위에 깔아준다. 16시간 후, 50 ug/ml hygromycin B 및 50 ug/ml 제네티신이 함유된 PDA를 그 위에 덮은 다음, 항생제 배지를 뚫고 올라오는 콜로니는 하이그로마이신 B가 함유된 PDA 배지에서 한번 더 스크리닝한다.
< 실시예 5 > RNA 추출 및 RT - PCR
추출 완충액(extraction buffer; 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 4 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 분리된 총 RNA는 DNaseΙ을 처리하여 게노믹 DNA를 제거한다. RNA는 에탄올로 침전시키고 DEPC가 처리된 물에 녹인다. 바이러스가 감염된 콜로니에서 바이러스의 dsRNA를 확인하기 위하여, 총 RNA에 oligo d(T)와 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성한다. 20 ng의 총 RNA에서 합성된 cDNA는 5′-TGTGGGAGAAGAAGTATGGCCT-3′(서열번호 1)/5′-ATCAGGAACCATTGAAAGAGTCC-3′(서열번호 2) (RdRp 부분) 또는 5′-ATGGACACCAAGGATATTTA-3′(서열번호 3)/5′-TTAGGGGTGCAAGGCCCTTTTC-3′(서열번호 4) (ORF2 부분)의 프라이머 쌍에 의해 증폭되었다. PCR 반응 조건은 94℃/3분 (1회); 93℃/45초, 60℃/40초, 72℃/1분 30초 (35회); 72℃/10분 (1회)에 따라 수행되었고, PCR 산물은 1% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 확인되었다.
< 실시예 6 > 콜로니 형태 및 균사 성장에 있어서 FgV1 - DK21 의 효과
본 발명자들은 다른 푸사리움 균주들에 있어서 FgV1-DK21이 VCG 장애를 극복할 수 있는지 알아보았다. Fg 복합체[푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)]의 두 종에서 각각 하나의 균주와 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)(외부그룹)에서 하나의 균주를 선택하였다(표 1). 원형질 융합의 스크리닝 효율을 개선하기 위해서, 무-바이러스 수용체 및 바이러스 감염된 공여체는 각각 하이그로마이신 B- 및 제네티신-내성 유전자와 함께 형질전환되었다(도 1 및 도 2). 몇몇의 바이러스-감염된 균주들이 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum), 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum) 및 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)에서 각각 선별되었다.
바이러스 감염된 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 표현형 변화는 푸사리움 부티이(F. boothii)의 표현형 변화와 비슷한 경향이었다. 푸사리움 부티이(F. boothii)와 같이, 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 FgV1-DK21 수용체 균주는 무 바이러스 균주에 비해 성장율이 감소하였고, 색소 형성이 증가하였다(도 3A). 반대로, 바이러스 감염된 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 균주를 PDA 배지에 배양시 단지 미미한 형태 변화만이 관찰되었다(도 3A). 그러나, 푸사리움 종들의 FgV1-DK21 감염된 균주들은 무-바이러스 균주보다 공기균사(aerial hyphae)의 생산이 감소하였다. 총 RNAs를 추출하여 아가로스 젤에서 분리하면, FgV1-DK21 dsRNAs는 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에서 검출되었으나, 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)에서는 검출되지 않았다. 바이러스 감염된 균주들의 경우, 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)이 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 보다 더 많은 바이러스 dsRNA가 증폭되었다(도 3B).
또한 본 발명자들은 DK21균주의 dsRNA가 원하는 수용체 균주에 전달되었는지 확인하기 위해서, 번역 연장 인자(translation elongation factor; TEF) 유전자 및/또는 히스톤 H3(Histone H3) 부분의 DNA를 염기서열 분석하였다. TEF 및 히스톤 H3 유전자는 푸사리움 균주 종을 연구하기 위한 계통학적 마커로 사용되어 왔다. 그 결과, 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum)(히스톤 H3 278 위치;G) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)(히스톤 H3 279 위치;T)의 무-바이러스 균주에서 나타난 고정된 염기서열 특성이 바이러스 감염된 균주에서도 각각 나타났다(도 4). 비록 DK21 균주의 dsRNA가 수용체 균주들로 전달되었다는 결과가 나타나더라도, 수용체 균주들의 형태 및 병원성에 있어서 다르므로 수용체 균주들의 변화된 표현형이 바이러스 전염 때문인지 원형질 융합의 결과인지가 불명확하다. 이 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 증폭 단편 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism; AFLP) 프로파일링을 통해 무감염 및 바이러스 감염된 균주 사이의 DNA 다형성을 분석하였다. AFLP 기술은 게노믹 DNA를 제한효소 처리한 총 단편의 선택적 PCR 증폭을 기반으로 하기 때문에, 기원 또는 복잡성과 무관하게 어떤 DNA라도 구별이 가능하고 진정한 DNA 다형성을 알 수 있다. 무-바이러스 및 바이러스 감염된 균주의 게노믹 DNAs는 AFLP 분석을 위하여 EcoR I 및 Mse I로 처리하였다. 처리된 DNAs는 두 개의 어댑터로 연결되고, 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 본 발명자들이 무감염 및 바이러스 감염된 균주 샘플 사이의 DNA 지문을 비교한 결과, 수용체 균주는 통상적인 원형질 융합에 의한 영향이 아니라, 융합된 원형질로부터 선별되었다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7 > 푸사리움 균주들에서의 병원성 분석
푸사리움 부티이(F. boothii), 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum), 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 관련된 균주에 대한 병원력 검정은 CMC 액체배지(1.5% carboxymethyl cellulose, 0.1% yeast extract, 0.05% MgSO47H2O, 0.1% NH4NO3, 0.1% KH2PO4)에 25℃, 150r.p.m.에서 5-7일 배양 후 얻어진 포자를 이용하였다. 포자는 거즈에 걸러 원심분리로 모은다. 모아진 포자는 0.01% (v/v) Tween-20로 105 conidia/ml의 농도로 희석 시킨다. 이 포자 현탁액을 꽃이 핀 조경밀의 이삭 부위에 피펫을 이용하여 10 ul 접종하여준다. 접종된 밀은 25℃, 80% 상대 습도, 14/10 시간 명/암 주기의 조건을 유지시켜주고, 2주 후 발병 정도를 확인한다.
푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 균주의 경우, 105 microconidia/ml 농도의 포자 현탁액에 4 잎 단계(4-leaf stage)의 토마토의 뿌리를 담궈 접종하여 상토에 옮겨 심는다. 식물생장상에서 28℃, 14/10 시간의 명/암 주기의 조건으로 유지시켜주고, 3주 후 0 (건강한 식물)-4(죽은 식물)로 나누어 발병 정도를 확인한다.
DK21 균주의 병원성이 무-바이러스 균주보다 낮다는 결과에 기초하여, 본 발명자들은 FgV1-DK21 dsRNA가 다른 푸사리움 균주들에 있어서도 저병원성을 유발할 것이라는 가정하에 실험을 진행하였다. 초중기 개화기에 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 무-바이러스 또는 바이러스 감염된 균주의 분생포자 부유액을 밀 상부 꽃부분에 접종하였다. 밀에서 상부 병충해는 바이러스 감염된 푸사리움 아시아티쿰(F. asiaticum) 및 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum) 균주보다 무-바이러스 균주가 더 심각했다(도 5).
푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)의 병원성 분석을 위해, 화분에서 키운 4 잎 단계(4-leaf stage)의 토마토 묘목에 무-바이러스 및 바이러스 감염된 푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코퍼시시(F. oxysporum f. sp. lycopersici)를 뿌리 접종하였다. 접종 3주 후, 묘목을 화분으로부터 제거하고, 뿌리의 병징을 관찰하였다. 푸사리움 마름병이 묘목에서 관찰되었으며, 바이러스 감염된 균주가 무-바이러스 균주보다 낮은 병원성을 나타냈다(도 6A). 접종 4주 후, 무-바이러스 균주로 접종한 60개의 식물 중 46개(76.7%)가 죽었으며, 바이러스 감염된 균주로 접정한 60개의 식물 중 43개(71.7%)가 살아남았다(도 6B).
< 실시예 8 > 크리포넥트리아 파라시티카( Cryphonectria parasitica )에서의 병원성 분석
본 발명자들은 다른 종 진균으로 FgV1-DK21 dsRNA를 도입함에 있어서, 원형질 융합을 사용할 수 있는지 알아보기 위한 실험을 수행하였는데, 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 및 연관된 마이코바이러스들은 바이러스/바이러스 및 바이러스/숙주 상호작용을 알아내는데 좋은 모델이다.
크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) 균주의 병원성 분석은 PDA 상에서 7일간 배양시킨 콜로니를 이용하였다. 콜로니의 가장 자리를 일정한 크기 (지름 5 mm X 깊이 5 mm)로 잘라낸다. 실험에 이용할 사과는 잘라낸 C. parasitica의 콜로니와 동일 크기로 과육을 제거하여, 그 안에 미리 만들어둔 콜로니를 집어넣는다. 접종 후, 수분이 증발하는 것을 방지하기 위하여 랩을 씌우고, 25℃, 12/12 시간의 명/암 주기로 유지시켜주고, 2주 후 병반을 확인한다. 모든 병원성 분석은 3번 반복을 수행하고, PASW statistics software (SPSS Inc.)를 이용하여 통계 분석하였다.
크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)로 원형질 융합을 진행했고, FgV1-DK21의 숙주 가능성이 있는 것으로 평가되었다. 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) EP155 균주는 하이그로마이신 B 내성 유전자로 형질전환되었고, 원형질 융합에 의해 DK21 균주(바이러스 공여체)를 이용하여, 수용체 균주로서 융합되었다. 융합 과정을 통해 만들어진 4가지 균주가 선별되었고, 무-바이러스 EP155 및CHV1-감염된 EP155가 비교되었다. CHV1 감염 콜로니(UEP)는 무-바이러스 콜로니 보다 크기가 작고, 오렌지색 색소가 형성되지 않았다(도 7A). FgV1-DK21에 의해 감염된 콜로니들은 오렌지색이 나타났으나, 무-바이러스 EP155 또는 CHV1 감염된 EP155 콜로니들보다 크기는 더 작았다(도 7A). FgV1-DK21은 RT-PCR을 통해 바이러스 감염 콜로니에서 검출되었다(도 7B). 또한 본 발명자들은 AFLP 프로파일링으로부터 무감염 또는 바이러스 감염 균주 사이에 평행하는 밴드들을 확인했다. 이는 EP155의 무감염 및 바이러스 감염 균주가 융합 과정에 의해 크게 변하지 않는다는 것을 나타낸다. 사과의 병원성 실험에서는 무-바이러스 EP155, CHV1-감염 균주 및 FgV1-DK21 감염 균주에 의해 야기된 병소의 범위는 각각 10, 4 및 0.5㎠로 나타났다(도 8).
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Claims (25)

  1. 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스가 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에 인위적으로 전달된 생물학적 방제를 위한 진균.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 2, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 3 및 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 4로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제를 위한 진균.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스인 것을 특징으로 하는 생물학적 방제를 위한 진균.
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  7. 제 1 항에 따른 진균을 포함하는 생물학적 방제용 조성물.
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  10. 제 1 항에 따른 진균을 이용한 생물학적 방제방법.
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  13. 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)과 바이러스가 인위적으로 삽입된 제 1 항에 따른 진균을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 방제방법.
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  19. 원형질융합(protoplast fusion) 방법을 통하여 푸사리움(Fusarium) 감염성 바이러스를 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에 전달하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 2, 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 3 및 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 4로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하는 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에 전달하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 푸사리움 감염성 바이러스는 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스인 것을 특징으로 하는 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에 전달하는 방법.
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  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제 21 항에 있어서, 상기 푸사리움 그라미네아룸 바이러스 1-DK21(Fusarium graminearum virus 1-DK21; FgV1-DK21) 바이러스를 포함하는 공여체(donor) 균주 및 수용체(recipient) 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)의 원형질을 준비하는 단계; 상기 공여체(donor) 균주 및 수용체(recipient) 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)의 원형질을 융합하는(protoplast fusion) 단계; 및 FgV1-DK21 바이러스가 감염된 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)을 선택 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 FgV1-DK21 바이러스를 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에 전달하는 방법.
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Lee KM et al. Protoplast fusion을 통해 전달된 붉은곰팡이 바이러스에 의한 식물병원성곰팡이의 저병원성 효과. 교육과학기술부/한국연구재단 지정 선도연구센터(ACE) Newsletter No.5, 2011.7, p.8.*
Sun-Jung Kwon et al. Proteomic analysis of fungal host factors differentially expressed by Fusarium graminerarum infected with Fusarium graminerarum virus-DK21. Virus Research 144, 2009, pp.96~106. *
Sun-Jung Kwon et al. Proteomic analysis of fungal host factors differentially expressed by Fusarium graminerarum infected with Fusarium graminerarum virus-DK21. Virus Research 144, 2009, pp.96~106.*

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