CN112280751B

CN112280751B - 一种真菌病毒SlMV1、减毒菌株及应用

Info

Publication number: CN112280751B
Application number: CN202011153985.3A
Authority: CN
Inventors: 周倩; 刘洪�
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112280751A

Abstract

一种低毒真菌病毒SlMV1，存在于番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici)SlHN‑03中，具有1.4～3.6kb的4条双链RNA，可通过抑制真菌致病相关毒素的合成降低植物病原真菌的致病力。该真菌病毒可以在细胞外存在，并保持侵染活力，因此具有可不依赖菌丝融合而从细胞外直接感染宿主菌的优点。通过体外侵染，SlMV1可以跨种传播给链格孢(Alternaria spp.)等真菌病原，降低它们的致病力。因此，该病毒可用于链格孢和匍柄霉等真菌引起的植物病害的防治。

Description

一种真菌病毒SlMV1、减毒菌株及应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，涉及一种减毒菌株，具体涉及该减毒菌株含有的真菌病毒SlMV1，同时涉及该真菌病毒或该减毒菌株对链格孢和匍柄霉等真菌引起的植物病害的防治作用。

背景技术

在植物病害中，真菌是最重要的病原之一，约80％左右的植物病害由真菌引起，每年给农业生产造成巨大的经济损失。目前对于真菌病害的防治主要采用化学方法，由于化学药剂长期使用会带来诸如生态平衡破坏、环境污染及病原菌产生抗药性等一系列相关问题，因此，急需挖掘绿色环保的生物防治方法。

真菌病毒(mycovirus or fungal virus)是指侵染真菌并能够在其体内进行增殖的病毒的统称，在真菌的各类群中均能发现侵染活动，其中少数能持久侵染并导致寄主致病力显著降低。这类病毒被称为低毒真菌病毒(hypoviruses)，是潜在的生防因子，可用于植物真菌病害的防控。然而，真菌病毒在自然环境中的扩散主要依赖于真菌的菌丝融合，不同种真菌，甚至同种真菌不同菌丝融合群之间的菌丝不融合现象限制了低毒真菌病毒在生物防治中的应用。因此，挖掘具有体外传播能力的低毒真菌病毒对利用真菌病毒进行植物真菌病害意义重大。

由链格孢(Alternaria spp.)和匍柄霉(Stemphylium spp.)引起的叶斑病是发生于世界各地多种作物的最重要的植物病害之一，经常造成巨大的经济损失。例如，茄链格孢(A.solani)和链格孢(A.alternata)引起的马铃薯与番茄早疫病在发生严重的地块产量损失高达30％以上。匍柄霉引起的叶斑病仅2013年在我国蔬菜上总发生面积就超过300万亩，直接经济损失近10亿元。目前，生产中该类病害的防治仍主要依靠化学药剂，但病原菌对常用杀菌剂的抗性不断出现，导致大部分药剂田间防效明显降低，病菌抗药性问题日趋严重。

发明内容

本发明的主要目的在于，针对现有技术中植物病原真菌对植物、作物的品质和产量等产生重大的影响，但很少发现抑制植物病原真菌的真菌病毒，且使用这样的真菌病毒的植物病害防治的尝试也非常少，而提供一种减毒菌株，该减毒菌株含有能抑制植物病原真菌致病力的真菌病毒SlMV1，该病毒SlMV1能独立于细胞外存在，并保持侵染活力，感染其他种类的植物病原真菌，通过抑制真菌致病相关毒素的形成降低寄主的致病力，从而达到对植物病害的防治作用。

上述提及的减毒菌株，其分类命名为番茄匍柄霉SlHN-03(Stemphyliumlycopersici)SlHN-03，已于2020年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M2020229。

本发明人在鉴定莴苣叶斑病病原的过程中发现1株菌落形态异常的番茄匍柄霉菌株SlHN-03，已分离、鉴定并保藏(保藏信息见上段描述)，其生长缓慢，且致病力显著降低。

进一步研究发现本菌株SlHN-03中含有一种具有1.4～3.6kbp的4条双链RNA的天然存在的真菌病毒，通过高通量测序技术，获得了该病毒的全基因组序列，并将其命名为Stemphyliumlycopersicimycovirus 1(SlMV1)，该病毒基因具有如SEQ ID NO：1～4的4条基因组序列。该真菌病毒SlMV1在双链RNA的序列中含有RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)和CP(衣壳蛋白)的保守基序，且编码RdRp和CP的核苷酸序列与已知的链格孢病毒AaV-1具有同源性。SlMV1基因组的第3条链的5’端和AaV-1第3条链也具有同源性，但第3条链的3’端和第4条链与AaV-1没有同源性。第4条核酸链在NCBI数据库中找不到同源序列。因此，推测病毒SlMV1是一个新型的真菌病毒。

将本菌株SlHN-03通过原生质体再生技术脱毒后获得了菌株SlHN-03的脱毒菌株，脱毒后的病菌生长速度和致病力都得到恢复。本发明病毒SlMV1通过体外传播能感染引起莴苣叶斑病的囊状匍柄霉(S.vesicarium)SvHN-02菌株和番茄匍柄霉菌株SlHN-10以及引起烟草赤星病的链格孢菌(A.alternata)Aa81601菌株，获得病毒的菌株同样表现致病力的显著降低。进一步研究发现SlMV1能通过抑制真菌致病相关毒素的形成降低寄主的致病力。

因此，本发明涉及的真菌病毒SlMV1能体外感染宿主菌，并具有抑制植物病原真菌致病力的作用，能通过例如使该真菌病毒SlMV1体外感染宿主菌，使宿主菌内含该真菌病毒，来降低植物病原真菌的致病力，达到生物防治植物真菌病害的目的。

本发明人研究发现，本发明的真菌病毒SlMV1可以存在于细胞外，并具有侵染能力。因此，可通过例如用液体培养基培养宿主菌，从该培养上清中回收真菌病毒，简单且相对大量地生产真菌病毒。而且，由于SlMV1可不依赖菌丝融合，通过体外传播感染宿主菌，因此，很有可能利用SlMV1简单且高效率进行植物病原真菌的减毒及植物病害的防治。

此外，通过例如将至少含有本发明的真菌病毒SlMV1和/或制备的植物病原真菌减毒菌株的植物病害防治剂附加(散布、涂抹等)于植物，有可能防治该植物病害。

附图说明

图1是本发明菌株菌落图。

图2是本发明检测菌株SlHN-01至SlHN-12中双链RNA的电泳图。

其中：M为5000bp Marker。

图3是本发明菌株SlHN-03和菌株SlHN-06在PDA培养基上的菌落正反面图。

其中：上图为菌落正面，下图为菌落反面。

图4是从本发明菌株SlHN-03中提取的病毒颗粒SlMV1的蛋白电泳图。

图5是本发明病毒颗粒SlMV1的核酸电泳照片。

其中:M-5000bp Marker，1-菌株SlHN-03，2-菌株SlHN-06。

图6是从本发明菌株SlHN-03的培养上清中所得的病毒颗粒的电子显微镜照片。

图7是本发明SlMV1病毒基因组的结构示意图。

图8是病毒SlMV1 RdRp序列构建的系统发育树。

图9是本发明菌株SlHN-03经放线菌酮处理后所得的32株菌株的菌落图。

其中：3、6、12、15、20、23、25、29为治愈株，其余为含双链RNA的菌株。

图10是本发明菌株SlHN-03经放线菌酮处理后所得的32株菌株的双链RNA提取结果的电泳图。

其中：3、6、12、15、20、23、25、29为治愈株，其余为含双链RNA的菌株，M为5000bpMarker。

图11是本发明于同一片莴苣叶上分别接种带毒菌株SlHN-03和脱毒菌株3、15的结果图。

图12是本病毒SlMV1于匍柄霉的菌体外是否具有感染能力的实验结果图。

其中：左竖栏的上、中、下图分别表示未感染病毒的菌株SlHN-10的正面菌落形态、反面菌落形态及发酵液颜色；中竖栏上、中、下图分别表示感染病毒的菌株SlHN-10-V的正面菌落形态、反面菌落形态及发酵液颜色；右竖栏表示感染病毒的菌株SlHN-10-V和未感染病毒的菌株SlHN-10的接种情况。

图13是感染本发明病毒的菌株SlHN-10-V发酵液中的真菌毒素检测图(以未感染病毒的菌株SlHN-10为对照)。

图14是感染本发明病毒的菌株SvHN-02-V发酵液中的真菌毒素检测图(以未感染病毒的菌株SvHN-02为对照)。

图15是感染本发明病毒的菌株Aa81601-V发酵液中的真菌毒素检测图(以未感染病毒的菌株Aa81601为对照)。

图16是含本真菌病毒SlMV1的菌株SlHN-03的分生孢子数检测结果图(以不含病毒的菌株SvHN-02为对照)。

图17是本发明病毒SlMV1对植物病原真菌的防治研究结果一。

其中：左竖栏的上、中、下图分别表示未感染病毒的菌株SvHN-02的正面菌落形态、反面菌落形态及发酵液颜色；中竖栏上、中、下图分别表示感染病毒的菌株SvHN-02-V的正面菌落形态、反面菌落形态及发酵液颜色；右竖栏表示感染病毒的菌株SvHN-02-V和未感染病毒的菌株SvHN-02的接种情况。

图18是是本发明病毒SlMV1对植物病原真菌的防治研究结果二。

其中：A左表示感染病毒的菌株Aa81601-V，A右表示未感染病毒的菌株Aa81601；BI表示同一烟草叶片两边分别接种Aa81601-V(左)和Aa81601(右)的正面；B II表示同一烟草叶片两边分别接种Aa81601-V(左)和Aa81601(右)的背面。

具体实施方式

〈关于本发明的病毒〉

本发明从菌株SlHN-03中提取了具有抑制植物病原真菌致病力的真菌病毒，命名为Stemphyliumlycopersicimycovirus 1(SlMV1)，其具有1.4～3.6kb的4条双链RNA。该真菌病毒的各病毒颗粒均具有1.4～3.6kb的4条双链RNA，且该4条双链RNA包裹在一个病毒颗粒中，同时存在、传代。

该真菌病毒在双链RNA的序列中含有RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的保守基序，且编码该区域的RNA的核苷酸序列与Alternariaalternata virus 1(AaV-1)病毒高度同源，并与产黄青霉病毒科下属病毒基因组中编码RdRp的区域有同源性。

本发明对该真菌病毒进行了序列测定，得到了全长的核苷酸序列。因此，本发明包含全部该真菌病毒基因、具有该核苷酸序列或其一部分的核酸、这些核苷酸序列所编码的蛋白质等。

将该病毒的4条双链RNA的核苷酸序列分别以SEQID NO：1～4表示。本发明也包含全部具有上述核苷酸序列的全部或一部分的核酸。核酸可以是双链、单链的任意一种，此外，DNA、cDNA、RNA等也全部包括在内。例如，SEQ ID NO：1～4的全部或任一序列、在序列中具有规定机能的特定部分的序列、与这些序列具有同等核苷酸序列的cDNA、插入了与这些序列有同等核苷酸序列的重组载体(质粒、病毒等)等，均包含在本发明中。

序列解析的结果显示，在SEQ ID NO：1的序列部分存在RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的保守基序，SEQ ID NO：2的序列部分存在CP(衣壳蛋白)的保守基序，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4编码功能未知的蛋白。因此，依照目的、用途，例如也可制备、使用至少具有作为有规定机能的特定部分的这些序列部分的核酸、重组载体等。

需要说明的是，本发明的核酸(或基因)中也包含与上述核苷酸序列具有同源性的核酸，例如，在严格的条件下与和该核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的核酸杂交，且具有真菌致病力抑制作用的核酸。

而该核苷酸序列SEQ ID NO：1～4所编码的蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO：5～8中，SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：1记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：2记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：3记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：8为SEQ IDNO：4记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列。

需要说明的是，本发明的蛋白质，除了具有SEQ ID NO：5～8的任意一种的氨基酸序列的蛋白质之外，还包含全部与这些具有同源性且保持该机能的蛋白质。例如，将上述核酸插入到重组载体中，并使其在宿主中强制表达，由此可大量制备这些蛋白质。宿主可以考虑利用大肠杆菌类、酵母类、培养细胞等公知的宿主。考虑到真菌病毒可以感染真菌，酵母类具有高增殖性且利用也比较方便等，作为宿主可能以酵母类最适合。至于重组载体，也可以利用公知的载体。插入有SEQ ID NO：1～4的任一序列的多个载体，通过使该四种类的基因的多个共表达，有可能再构成真菌病毒。在这种情况下，也可考虑利用公知的宿主及公知的重组载体，但是从可以同时导入多个载体的角度考虑，可能以酵母类最为适合。

〈关于植物病原真菌的减毒菌株〉

本发明的真菌病毒SlMV1最初是存在于番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici)SlHN-03内。该番茄匍柄霉菌株SlHN-03已经保藏，保藏号为CCTCCNO.M2020229。本番茄匍柄霉菌株SlHN-03的形态性质、培养的性质、孢子形成、生理学的及化学分类学的性质，基本上与公知/常规的匍柄霉菌相同，但是，与常规的匍柄霉菌相比，本菌株的生长缓慢，产孢能力下降，真菌毒素分泌显著减少，致病力显著降低。

但是，本发明的植物病原真菌减毒菌株包含全部含有本发明的真菌病毒SlMV1的菌株。即，例如包含已经内含该真菌病毒SlMV1的匍柄霉和链格孢等的菌株以及感染了该真菌病毒SlMV1的其他植物病原真菌的菌株。

作为使真菌病毒感染植物病原真菌等的方法为本领域的常规技术，例如菌丝融合使宿主菌感染的方法。此外，本真菌病毒SlMV1能独立存在于细胞外，并保持侵染活力，因此也可以从细胞外直接地感染宿主菌。

〈关于植物病原真菌病毒的制备〉

本发明的真菌病毒SlMV1是存在于规定的匍柄霉菌株内，因此，通过从感染该真菌病毒的匍柄霉菌株中分离、回收病毒等，可以获得该真菌病毒。

作为病毒的分离、回收方法，可采用公知的方法。例如，可以用液氮等冷冻、破碎菌体，用规定的缓冲液中混悬后，通过超离心分离等分离病毒，可回收病毒。

但是，本发明的真菌病毒也可存在于宿主菌的细胞外。因此，例如可用液体培养基等培养经真菌病毒感染的植物病原真菌，通过离心分离法来分离菌体后，从该培养上清中分离、回收病毒，从而可简便且相对大量地回收病毒。

但是，本发明的真菌病毒并不仅限于用这种生产方法获得的病毒。即，例如从内含本真菌病毒的链格孢或匍柄霉菌中分离、回收所获取的病毒，也广义地包含在本发明中。

〈关于植物病原真菌减毒的方法〉

可采用使本发明的真菌病毒感染特定的植物病原真菌等，抑制该宿主菌的致病相关毒素合成等从而可使该菌减毒。

〈关于植物病害防治剂〉

本发明的植物病害防治剂包含全部至少含有本发明的真菌病毒或本发明的植物病原真菌减毒菌株的任意一种的防治剂。此外，也可同时含有该真菌病毒和该植物病原真菌减毒菌株，也可含有其它的成分。

作为其它的成分，可含有例如规定的载体、粘结剂、增粘剂、固定剂、防腐防霉剂、溶剂、稳定剂、抗氧剂、紫外线吸收剂、晶体析出防止剂、消泡剂、物性改善剂、着色剂等。此外，也可以含有其它的农药成分，例如杀螨剂、杀线虫剂、杀菌剂、抗病毒剂、引诱剂、除草剂、植物生长调节剂、增效剂等。

作为载体，例如可以使用固体载体和/或液体载体。作为固体载体，可列举例如淀粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、鱼粉、奶粉等动植物性粉末，滑石、高岭土、膨润土、沸石、硅藻土、白炭黑、粘土、氧化铝、碳酸钙、氯化钾、硫酸铵等矿物性粉末。作为液体载体，可列举例如水、异丙醇、乙二醇等醇类，环己酮、甲基乙基酮等酮类，丙二醇单甲基醚、二甘醇单正丁基醚等醚类，煤油、轻油等脂肪族烃类，二甲苯、三甲苯、四甲苯、甲基萘、溶剂粗汽油等芳香族烃类，N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺类，脂肪酸的甘油酯类，大豆油、油菜籽油等植物油。

作为粘结剂、增粘剂、固定剂，可列举例如淀粉、糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基淀粉、普鲁兰、海藻酸钠、海藻酸铵、海藻酸丙二醇酯、瓜尔胶、刺槐豆胶、阿拉伯胶、黄原胶、明胶、酪蛋白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯-丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等。

对本防治剂的剂型无特殊限定。例如可适用乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水合剂、水溶剂、液剂、水悬剂、颗粒水合剂、气溶胶剂、糊剂、油剂、乳浊剂等形态。

〈关于植物病害的防治方法〉

本发明的植物病害防治方法，包含全部的至少含有将上述的链格孢或匍柄霉叶斑病防治剂附加于特定的植物的步骤的方法。

作为使防治剂附加于植物的方法，可列举例如在叶的表面或里面涂抹防治剂的方法、使用规定的载体等使防治剂附着于叶的表面或里面的方法、将防治剂散布或供应于叶上的方法等。

防治剂的涂抹量或散布量，根据有效成分的浓度、制剂的形态、对象病害和作物的种类、病害导致的受害程度、施用场所、施用方法、施用时期、混用、合用的药剂和肥料等的使用量、种类等种种条件，可进行适当的选择。例如，通过向每叶喷雾或供应1～1000mL的调整为1×10³～1×10⁷个/mL的匍柄霉减毒菌株的分生孢子含有液，此外，通过使叶每平方毫米涂抹或附着1×10³～1×10¹⁰个匍柄霉减毒菌株的分生孢子于叶表面或里面，有可抑制植物病害的可能性。

本发明可适用于以真菌为主要病因的所有的植物病害。作为有适用可能性的植物病害，可列举例如下述的病害但不限定于这些：针对蔬菜的植物病害，如：番茄匍柄霉叶斑病(病原菌“S.lycopersici”)、马铃薯和番茄的早疫病(病原菌“A.solani”)等；针对果树的植物病害，如苹果斑点落叶病(病原菌“A.mali”)等；针对经济作物的烟草赤星病(病原菌“A.alternate”)等。

实施例1本发明菌株SlHN-03的制备

从湖南长沙蔬菜基地采摘莴苣叶斑病叶片，采用常规组织分离法，取叶片病健交界处组织进行分离，经升汞1min、70％酒精浸泡5-8s，无菌水润洗三次后晾干，转移至PDA平板，28℃倒置培养；待长出菌丝后将菌株接种于V8培养基(V8果汁200g,CaCO33.0g,琼脂20g,补充去离子水至1L)上，置于28℃光暗交替条件下培养，10d后挑取菌落生长缓慢的菌丝转接至新的PDA平板。继续28℃光暗交替条件下培养，10d在显微镜下观察，挑取单个孢子到新的PDA平板上，新长出的菌落为纯化的感染病毒的菌落(图1)。

实施例2菌株内在双链RNA的检测

从包含本发明菌株SlHN-03的SlHN-01至SlHN-12的12株番茄匍柄霉菌中检测内在的双链RNA。首先，磨碎单独分离培养的12株匍柄霉菌的菌体，用酚SDS法提取核酸后，通过DNase1及S1核酸酶选择性地分解DNA和单链核酸，得到菌体内在的双链RNA。然后，在1％琼脂糖凝胶中于120V下电泳0.5小时，用溴化乙锭进行染色。

结果见图2，结果显示，12个菌株中，除菌株SlHN-03含有1.4～3.6kb的4条双链RNA谱带外，其余11株菌株均为正常或常规番茄匍柄霉菌(不含双链RNA)，但匍柄霉中从未报道真菌病毒。因此，本实施例的结果暗示该匍柄霉菌株中内含真菌病毒。

实施例3

比较上述实施例2中内含双链RNA的菌株SlHN-03和不含双链RNA的菌株的生长速度和菌落形态。

以实施例2中的菌株SlHN-06作为不含双链RNA的菌株代表。将未检测出内在性双链RNA的菌株SlHN-06和检测出双链RNA的菌株SlHN-03，分别用PDA培养基进行培养，于培养开始7天后观察菌落的正反两面，结果见图3。

结果显示，未检测出双链RNA的菌株SlHN-06的菌丝生长速度快，产生色素。另一方面，检测出双链RNA的菌株SlHN-03和未检测出的菌株SlHN-06相比较，其生长迟缓，不产生色素。即，内含双链RNA的菌株和不含双链RNA的菌株相比较，可见到生长抑制和色素分泌减少。这些试验结果暗示实施例2中所得的双链RNA(真菌病毒)是该菌株SlHN-03生长异常的原因。

实施例4

对本发明的真菌病毒的病毒颗粒进行了生物化学特性的分析。

取多瓶在PDA中扩大培养的SlHN-03菌株，过滤用无菌滤纸吸干后，在液氮中碾磨至粉末；按1g菌丝干粉加4mL磷酸缓冲液的比例，于菌丝中加入0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)，震荡5min，4℃10000rpm离心15min；吸取上清，加入10％体积的正丁醇：氯仿(1：1)，震荡5min，4℃10000rpm离心30min；吸取上清，加入50％PEG6000和5M NaCl，使其终浓度分别为6％和0.1M，置于4℃沉淀过夜。4℃12000rpm离心30min，弃除上清，将沉淀悬浮于0.01M磷酸缓冲液(约30ml，使病毒粒子充分溶于磷酸缓冲液)，4℃12000rpm离心30min，留上清(约30ml)。然后，将上述上清液加入超高速离心管中，底部加入20％蔗糖，10万g离心4小时，将所得沉淀物溶于少量的0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)中，该溶液即为病毒粒子粗提液。

将该病毒粒子粗提液的一部分进行SDS-PAGE(8％凝胶、Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.8)、20mA、90分钟)电泳，用CBB(考马斯亮蓝)染色，进行病毒蛋白质的主要成分(外壳蛋白)的分子量分析。其蛋白电泳结果见图4，检测到约90kDa大小来自病毒颗粒的蛋白质的谱带。用SDS-苯酚法从检测出该90kDa的蛋白质的成分中进行核酸提取，结果检测出1.6～3.6kbp的4条双链RNA(见图5)。因此，通过本实施例能确认存在本发明的真菌病毒的病毒颗粒。

实施例5

在本实施例中，通过电子显微镜鉴定菌体外存在病毒颗粒。

将本菌株SlHN-03在PDA培养基中培养，从该培养上清中分离病毒颗粒。将该培养上清离心(10,000×g、5分钟)，然后超离心(100,000×g、30分钟)该上清，可得含病毒颗粒的沉淀物。将该沉淀物溶于0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)中，使用磷钨酸或醋酸铀进行负染色，用电子显微镜(倍数：×20,000～40,000)观察。

结果见图6。如图所示，通过电子显微镜，可鉴定本发明的真菌病毒SlMV1的病毒颗粒。该病毒颗粒为约30～40nm的正六角形状，包在包膜样的结构中。因此，通过本实施例能确认含有真菌病毒SlMV1的菌株液体培养基中存在本发明的真菌病毒的病毒颗粒。

实施例6

对本发明病毒SlMV1的核苷酸序列进行了分析。

1.双链RNA的提取、纯化

对于在实施例2中检测出双链RNA的菌株SlHN-03液体培养1周，然后过滤收集菌丝体；将约0.1g菌丝在液氮中研磨成粉，转移至离心管并加入700μL STE(1M Tris-HCl、0.5MEDTA、5MNaCl、10％SDS)用涡震仪震荡3min使其充分混匀；加入700μL RNA提取酚振荡3min，4℃12000rpm离心3min；取上清约650μL，加入等体积的体积比为25:24:1的RNA提取酚、氯仿及异戊醇的混合液，振荡3min，4℃12000rpm离心3min；取上清约500μL，两管合成1管，加入0.1g纤维素粉末，200μL无水乙醇，振荡5min，冰上静置10min。继续振荡3min，4℃12000rpm3min；弃除上清，加1020μL TE缓冲液(1M Tris-HCl、0.5M EDTA、5M NaCl；PH7.0)及180μL无水乙醇，振荡1min，4℃12000rpm离心3min；弃除上清，加入420μL TE，振荡3min，4℃12000rpm离心3min；取上清约400μL于1.5mL新离心管中，加入等体积异丙醇-20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心15min，弃除上清；加入1mL 70％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清，重复洗涤一次，彻底去除残留的乙醇后加入30μLdd H2O溶解沉淀；加入1.5μLDNaseI(RNase-free)、1μLS1 Nuclease和1/5体积的DNAbuffer缓冲液，在37℃下反应40分钟后，得到目的双链RNA。双链RNA高通量测序按照通用的高通量测序方法送公司测序。

2.末端序列的获得

在双链RNA的3’端加上5’磷酸化，3’氨基化的接头引物PrimerA，加完接头的双链RNA经末端补平后纯化回收。再以随机引物和Primer B引物(PrimerA的反向互补引物)进行反转录合成cDNA。为模板合成cDNA，然后进行末端序列的克隆测序。再以高通量测序得到的片段设计基因特异性引物和Primer B引物做PCR，将所得的条带纯化回收后，连接至T载体，并转化大肠杆菌筛选得到阳性克隆。然后对各阳性克隆进行序列测定。得到真菌病毒SlMV1的基因组信息的全长序列。该真菌病毒SlMV1由4条双链RNA构成(见图7)，各双链RNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：1～4，该核苷酸序列所编码的蛋白质的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：5～8。需要说明的是，为了将双链RNA取代为cDNA后进行序列测定，在序列表中“尿嘧啶”被取代为“胸腺嘧啶”。

根据本病毒SlMV1的RdRp序列构建的进化树见图8。

实施例7

在本实施例中是用低浓度的放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)处理内含双链RNA的菌株，尝试制备真菌病毒治愈株。

制备添加有0.25～0.50μg/ml放线菌酮的PDA平皿培养基，并向其中移植实施例3中于PDA培养基中培养的菌株SlHN-03(检测出双链RNA的菌株)，如此继代培养N代(N>10)，观察菌株的菌落形态是否会发生变化。然后，将恢复正常生长速度的菌株进一步移植到新的PDA平皿培养基中，得到放线菌酮处理后恢复生长速度的真菌病毒治愈株(标号为3、6、12、15、20、23、25、29的菌株)。接着，从所得的放线菌酮治愈株中，用与实施例2同样的方法提取双链RNA，通过电泳来尝试检测双链RNA的谱带。结果显示，真菌病毒治愈株3、6、12、15、20、23、25、29菌株恢复生长(图9)，放线菌酮处理治愈株未检测到双链RNA的谱带(图10)。同时，将本菌株SlHN-03(带毒菌株)和治愈株3或治愈株15(脱毒菌株)分别接种于同一莴苣叶上，见图11，显示脱毒后的病菌生长速度和毒力都得到恢复(叶片左侧接种菌株SlHN-03，右侧接种治愈株3或治愈株15)。

上述结果显示，匍柄霉菌中内含的双链RNA为真菌病毒，且该真菌病毒对匍柄霉菌的生长有抑制作用。

实施例8

在本实施例中，对SlMV1是否具有体外感染能力进行了研究。

将含有真菌病毒SlMV1的菌株SlHN-03移植于PDA液体培养基中并进行培养，2周后离心培养液并回收该培养上清。接着，将所得培养上清用孔径0.22μm的细菌过滤器过滤，除去菌体细胞。然后在100mL的三角瓶中加入50mLPD培养基和10mL滤液，并在其中接种番茄匍柄霉菌的正常菌株SlHN-10(无真菌病毒的菌株)，共培养7天后，取菌丝接种到PDA平板，以未感染病毒菌株SlHN-10为对照，观察菌落的生长情况。

结果见图12，结果显示，在接种第7天后，未添加培养上清的菌株SlHN-10，其菌落平整，边缘整齐，表现出正常的生长状态(见图12左竖栏)，而添加了培养上清的菌株SlHN-10-V，其菌落褶皱，边缘扭曲(见图12中竖栏)。将SlHN-10和SlHN-10-V的菌饼分别接种在同一莴苣叶片的两边，5天后观察到感染了病毒的菌株不能导致叶片发病(见图12右竖栏)。

考虑该结果的原因是，存在于培养上清中的真菌病毒SlMV1感染了匍柄霉的正常菌株，降低其致病力。即，本实验结果说明了菌体外存在的真菌病毒并对正常的菌株具有感染能力。

实施例9

在本实施例中，对于已感染真菌病毒的匍柄霉株和链格孢菌株，测定了其产生真菌致病相关毒素的能力。

将未感染病毒的匍柄霉菌株SvHN-02、SlHN-10和链格孢菌株Aa81601以及对应的感染了病毒的SvHN-02-V、SlHN-10-V和Aa81601-V菌株分别接种至PDA培养基，200rpm，28℃震荡培养7天后取培养基上清液离心，然后采用色质联用分离鉴定发酵液中的真菌毒素。

结果显示，匍柄霉感染病毒后发酵液中主要致病相关毒素Altersolanol A、Macrosporin、Alternariol和Altenusin的含量显著降低(图13和14)；链格孢感染病毒后发酵液中主要致病相关毒素Alternariol、Macrosporin、Scirpentriol和HC-Toxin的含量显著降低(图15)。该结果显示本发明的真菌病毒SlMV1可能通过抑制宿主菌的真菌致病相关毒素合成来抑制植物病菌致病力。

实施例10

在本实施例中，对于已感染和未感染SlMV1的菌株，测定了其分生孢子数目。

将未感染病毒的匍柄霉菌株SvHN-02、SlHN-10和链格孢菌株Aa81601以及对应的感染了SlMV1病毒的SvHN-02-V、SlHN-10-V和Aa81601-V菌株分别接种至PDA培养基，培养2周后，用直径5mm的打孔器打出菌饼。接着，在1.5ml的离心管内加入5％甘油，再加入菌饼，混和、悬浮5分钟。然后使用血细胞计数器来计算悬浮液中存在的分生孢子数。

结果显示，正常菌株产生的分生孢子数量比感染了真菌病毒SlMV1的菌株产生的分子孢子数量要多(图16)。该结果表明本发明的真菌病毒SlMV1能抑制宿主菌的分生孢子形成，表示在其抑制植物病菌致病力的同时，也很有可能会抑制其传播、感染扩大等。

实施例11

在本实施例中，用针刺接种法研究了本发明病毒SlMV1对植物病原真菌的防治是否有效。

1.在PDA液体培养基中接种本菌株SlHN-03，在25℃的室内进行培养。接种后第14天后，离心收集上清液，用0.22μm直径的细菌过滤器，除去菌体细胞。然后在100mL的三角瓶中加入50mLPDA培养基和10mL滤液，并在其中接种正常的囊状匍柄霉菌株SvHN-02(不含真菌病毒SlMV1)，共培养7天后，取菌丝接种到PDA平板，获得感染SlMV1病毒的菌株SvHN-02-V。用针尖刺在20～30℃的温室培育的莴苣的第4叶左右两侧，造成伤口，在该伤口部分分别覆盖SvHN-02和SvHN-02-V的菌丝琼脂块，将植物体置于26℃、相对湿度为100％的接种箱中静置24小时后，将苗盆移到温室内，并维持室温在23～30℃，在接种后培养7天。然后计测病斑的大小。

结果见图17，结果显示菌株SvHN-02感染了病毒SlMV1后，不形成病斑。说明本发明的病毒SlMV1对植物病原真菌的防治是有效的。

2.以前述同样方法感染正常的烟草赤星病菌菌株Aa81601(不含真菌病毒SlMV1)，获得感染SlMV1病毒的菌株Aa81601-V，结果见图18，结果显示菌株Aa81601感染病毒SlMV1后生长速度减慢，未形成病斑。说明本发明的病毒SlMV1对植物病原真菌的防治是有效的。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种真菌病毒SlMV1、减毒菌株及应用

<130> 0006

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3594

<212> RNA

<213> 合成()

<400> 1

cggggggcuu aaagcuaucg uaccucuggu acacauaagu cuuuggucug augcgaagug 60

acaaaucccu uuugcuucug ggguucagga augcugguug guugcgugca cagggggaac 120

accccgauuu aggcgcgauu ccaaagcgag cuuucguccc ggagccggaa gagguugaug 180

ccugccugaa ggguaucgag gacggauggg gugacggugc cuuuuggugc ccgacaguca 240

uugggagcgc uuuuccuguc uuuuuuguuu ugucuaauga aacgcguaau gcuuucugcc 300

acucuuuuag uucuguuggu ggugauguca acugguugac guuugggcuc acugaugcac 360

gcacuuugcu guaucggcgu ccgcagguuu gugucguugc caaaccgagg ccaugugucg 420

ccuaccauag agaccugucc agcaucgcgc gggucuugag guaugguguu uugaacucgg 480

accacaagcu uugcgaugcu uauacugacu uugugcguuc accuguugcg cggacggagg 540

aggugugggg uacgcucggg gcguacccau ggggggaucu ggacacgcug guuggccaau 600

ccacgcgugc ggaguacgau gccgucaagg acgccgcggu cguuggcuuu cuugauaggu 660

ugugggguaa gaagcgcggc aaaggugccc cgcgugaucg gaaggugcgu gcaaaggcag 720

cgauggccug gggggaugca cggcuuuggu cacgugaggu aucguuuaag cgcagacacu 780

acuacgacgu cgcaaccuuu cugugcguga uggaugaggu cuggggaucu agggaugugg 840

cccuucgggg cggcgcaacu aaugcugagg cggggcucca agugggcucc uuccgcaagg 900

cggugcgcau gguguugucc gaguugguca uggggccggc uagcuaugaa cgccuauacu 960

ugacaaucuu uuggguguuc ucaacucgcu gguggccuag ucuuguaccu gugcugauac 1020

guuauggcac gcuugguaug agugacgacg aguacacugc cauacacaag gagauuacug 1080

cuguggugac uucgacaugg auggugccug gcaccugucg ccaacaucag uuuucugcca 1140

auuuccuuaa cgcggaggau cucacagggu ggucagaucg ugauucguug aagggggggg 1200

uguguacgga gaucaucaaa uucgcacuug cgacuuuuga guaccgggcg gaugugcgug 1260

ggggcggugg cgagcgcggc augccgauca uagccaaaga ggggucuccu ucggaguacc 1320

ugagucggua ucgggccgcg auggaccaac ugcugcgucc uauguacgcc aaguauucug 1380

cgaauaugac ugaccuucgu ucgcacaugg aaaagaggau ggcuuggaug ucgggcggcg 1440

cugugggcag gcgcgccaaa gaguuguugg guccggggau ugccccgccc ggcaguucga 1500

aggcguaugu ugcgucuagg gccgacgcug accaguugac acgggauugg ggugagaugc 1560

ggauagaggu cggggggaag gguaacgagc gugggucuga acgcacccug cuugcgacgg 1620

aucugcguga ucagguuagc gagucguauu ugcugcaugc uuucaagaau cguuauggcc 1680

ugauuggagu cgacgucggc gaaacaccug uggagauguu caagcggcau gucaccgugg 1740

cuucagcuac agacgugccc augucuuucc acgguagaga gaagaagguu cucgccgcgu 1800

gggacuacuc caagugggac caucauguca ugcucgcgga gcgguugcuu cuggugcaag 1860

ugaugcguga uuuggugcug gaguacguac agcgugauga cauacgcguu gauaugcuga 1920

aggaacuuga uguucuggag ucgagucauc guguggcaau cuaucggucg cgugcguaug 1980

cggaugcucg guacacggau cagguugaug cgcucauacg ggauggcguc aaggcggggu 2040

ucaaggggca ggcugugcgg uugucggcgg aucaggugcg gauaacggau uaugcagguc 2100

aacaauccgg caggcggagc acguuggagu cgaacacuuu cuacucgcgc gcgcgccugc 2160

ucguccguga ugcugagcug gccgaggggg agcggagugu guaccuccuc aaucgggcgg 2220

augacguccu ugagguguac agggcuuggg agcaugcucg caaugccauc gaugucaugc 2280

ugcugcaagg gcauaaggcc aacaagaaga aacaggucgu ccagguccga acgggcgucu 2340

auuucaggau ucucuaugcu gccggcagca ugcgagguuu uccuccaagg gcuguuuaug 2400

cuugugcuuc agcagguccg ucgauggcgg caaguggggg guucgacccu guugagcggc 2460

ucucuucucu gucaggugca cuugaucgcu uggcacggcg ugguucaggc uauugggugg 2520

cccgggcucu uuaccucgag gcggaggauu auuaccgcga uguucgcgug caguuggcgg 2580

ucaaggcuga caaauucacu cguuuuacua uucccaggga gguguugcgu gcgucgccgg 2640

auuugggugg cuguggugug cuuccgccag gcaauuacga uuucgaucug agcaucaagu 2700

guucggagau cgucggugag aauggcaggu uguggcaggc gguccgugag cggcuggaga 2760

agaggcauaa guuuagaggc cuugcugacc uucagggauc ggcggggcgu gccuuuuccc 2820

acgaugugcc guuggacguu ccugagaagg ccuggcagca guggcagaag cgcuggaggg 2880

gggaucgugc ggcacaggau ggccguggcg aguugcugag ggcgcgcuug augggcaagc 2940

uguggaggua caagcgcucu uggcaucgug aucggaaggg cgacgcgugg ggguuggagg 3000

gcuucggcca uuuacugucu uuaccuguug auuucuuuca gcuuucuugg aggauauugc 3060

gugacugucc gggaucaggg gagguggacc guuugaugaa gggcguccag gggccgccag 3120

ccgagggcau guuggccaag uugugguaug ggcuggggca ggacgucauu uccgugcucg 3180

guagagaugu uuuggagguu auucaaucug cuuccgcucc ggggcgugag uuugcugcug 3240

aaugggggug guuaccauua gaugugcgug agaaguuuuu gcguggucau uugggcccgg 3300

cuggagcuug gaugaaccug augccugcga guuucgcucc cuggcuuaau caggcaguca 3360

auuucguccu guuucaggcc uucgccacag gugugcgcua ucaugguucu cauugguuau 3420

ugcauguucg ucaggcuuua accggcgcua ucaccaggca guucguggac gcuagacccu 3480

uaguggugcu acauuaaguc gaucauuugc caugggcggu uuuacgugcc ggcgggccgu 3540

cuucacgugu uuacccgguu cuacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3594

<210> 2

<211> 2770

<212> RNA

<213> 合成()

<400> 2

ggcgggggcu uaaagcaauc guaucucuag auacacauaa gucuuugccc ugguucguua 60

ugucuuuuuc cguuucugau uucuucguuu guggcgguuu cgaggagggg uggcuugagu 120

gugggcuucu agaugagaag accgcuuucc accuggcugc gcaugugggc ucggauggca 180

ucauugaugu caaucuggag aagauccccg ccauuccggu cguuccuugg aacacgggug 240

gcgguuugcg cgacuaugau gguggcggga uggggggcuu uguugaugug ggcguguuga 300

agaggccugu ccagcuuugg gaaggcgagg cgugugggcu gugucggauu ggugaucuug 360

cgggcuugug ugagauuguc ggcuguggcc ggcgcucugc aggcguugcg accgccgaga 420

ccgaaguccu ggugaccagu ugcguuaugg ucgccguuca aagggcagcu cuugcgcucg 480

cgccugauga cgcggaccuu ugggacacug ucccuguacg ugucaaugcu gggggcuauu 540

ccuucuugaa ggacaugucc cucgauuugg cggcggaagc agaggugauc accagcggug 600

cggagaaguu gcuugccgac uucuucaaga gcacggccga accucaucag gaggucguga 660

ucauggcgca agaugacgag gaggcgguca ucgaggcggg cgccgaucac gagguuggcu 720

gggguaaccu caccacacuc gcuccuugug ccgcagugga cggggccgau gacgacgugg 780

uguccauugu gucugguagg ggugaugacg uuggguuuga ggaagauguc ucaacaggug 840

acgggcuggg ggagcaccug gacgacuucc ucuuucugcg gggcgggacu gcgguggaga 900

agaguagguc uguugcugga uguuugcuug cgcuuuugcg gcgguugggu gacacggggg 960

cugauggaga ugggguugug uugguuuuug gggauucgcc ggguguggcg gcgcgugagc 1020

uugcccaggc gggguaucgu gugcucggca ucgaucgcga uccgaagcac gcggcgccgc 1080

cgggcuggcg ugacaaguau aggaccguug ucgcggaggu ggacgauggu cucacgcguu 1140

cggaagugga ugguugguug gcggagguga acugggcugg gcguccugug guggcugcgu 1200

uguuggacau cgaccagggg ggucggcguu caucagucgc agacacggcg cuuaaucgug 1260

aguugucgac gaugguguug aaugaauggg ggggagcguu cacuguggug cgcuaucggg 1320

guuugcccgu auugccuuuu ucggcauacg uguugcccac gcgcuuucac gaaccgcagg 1380

gugccgagau guacgcagua cauggccuug aggggccggc gcucagcgag guggccgcuu 1440

uccaccuguc caguuggcau gucgaaggca augucaauuu uggcgucacg cuucuuucua 1500

aagcguggcg ugauuauggc cggcggcgug gucuugguuu ugagggcggg gggaaggggg 1560

agaugucacc ugacggcggg gagcggcggg gguacacggg uaaguuccgg gugguuggag 1620

cggcggggua uuugucccug uuggguuugc ggaacggggu ggaggaguug cggcuggcag 1680

gcacgccuuu caugcgugcg gguaaggaug cacgggcuuu ugucgagcuu uugggccggc 1740

ugaagaccgu gauggguaaa guucggccug agcgcgcggc cgagcuuacu gcaaaauucc 1800

aacccgccga ucgugucuug uugcgccaug ucuccaacgc cacguugggg gugucgccua 1860

cgcuguugca ggcuaugcag uccagguacg auggauugcu uaaguacugc agcauggcug 1920

aacgucagga ccagaauccu gaccugggcg aucucacccg gcaucccggc uuuggcgcug 1980

uguuccacug gggcuuuucg agggugcgcg augaguuggg ggugguguuc cccuacacgc 2040

aguaugcgcg ugugcugccu uuggcagcca ugcccauuuu ggcgaguagg agcuggguca 2100

gaaugaucgc cugguugcug aaggcgcaug accggcuuau ggggaagccg cuccacacgu 2160

gggagcugca gggcuuguug uggagccugu cccacaucgg cacccaagag gagcgcgagg 2220

uguacuucug ggguaaacug cagggagcug cagacaugcu uuuggccucu aggcguagag 2280

gucaacgcac gcagggcgcc gccucggcgg accuaaaucg cauccuuaac gcgauggaag 2340

cguugggcug caagaagcuu cggcuuuccg ggcuugaacg ugccgccuuc gaugccgcuu 2400

uuggcgucuu gggccggggg cacuucaggc acgacgggga cuacagccgc aauccuccgg 2460

gguugcgccg ugcggagcgc guuccugagc gcccgccauu gucagcuggu agucccagcc 2520

aucaucgugc ucuuucuagc aguacgacag gaagucgcgg cguuuauacg ccgcgcagga 2580

ucggauagug uaucuuaagu cgaccacuag ccaucaucca uguuuuggau uugacguguu 2640

uuuuagaaug aagcgcauag cggcggggcc uccgcaauua cuguaggccc uugagucagu 2700

cgguugagcu cggcgguggg cgauacugau gcguggaaca gcaauuuuuu aaaaaaaaaa 2760

aaaaaaaaaa 2770

<210> 3

<211> 2567

<212> RNA

<213> 合成()

<400> 3

ugcggggggc uuaaagcaau cguaucacua gauacacaua agucuuugac cuugcgagag 60

auggcgacgu uuggaagugc ugaggcguau cgugcggcgc agcuugcugc gauugaguug 120

augacacgug gugauugggg ggauuucgga gguuugggug agacgagcga cguguucgcc 180

gagcacgagc gguucccuga ggacccguuc gaugcuccug aucacguuga uccgggaacg 240

gcuugggcgu caguugcgac uggcucugcc gaugaccuuu cgcgggaggu ggcgccgacu 300

gcuguggacu augucccgcg gucugaaccu uacuccgugc gagguguuga caucguggag 360

ccggucaccg cuuucuguuc gcccgcagau uugggaaugg ccaauuuucc gggcaaugug 420

uugaaggguu cggcgaccac ccuucggagg gccgggucug cugccgcuaa cgcgggugcc 480

auuuugggga cggacauguu gauggcaccc aaggcuagcg ugcaggccau cauggcgcgg 540

guuauugcag cccuggagau guugcaguca gguugggaug uuggaggacc gccugauguu 600

ggucuugacg ugcggcacgc cgcgcgugau gacuuugaug ucgcgagugc gcgacauccg 660

cagcaugcau ggcuguauau cccgucagau uggacggagg aggaaguggc ggcguugguc 720

ucgcugaugg uggagggugg gcccgcggcg uacagguggg guuacgccga cggcgauccu 780

gguggugacg agggagugaa cgguaauccg cucccccgcg auggggugau gcccgccggc 840

gcauugugga gauggccugg cgggugguca aacuaccugc ucauugguga gcgugaucgc 900

ggguggaaug uggccuuugg gggggacgcg cuuucagugu ccucacuauc ggccgugcug 960

cgucggaugg uggaggcgua cgggcagcgg gucuaucuag acgccgcgcg cgccgcugcu 1020

guugcgaauc gugcguacug cgcaccagcg uaucagggug gaggggguga gcgggauauc 1080

gggacggcuu ucacguccga uagggugagc guucgcaggg aggaugggac gucgggacgc 1140

uuggcugucc cggcgcgcaa uguggugaag gaccaccccg gcccgcugcc ggauccagca 1200

gcgggguaug acggcgguuu uggaggugug guuccgggcg gcugcggggg cagagucugg 1260

gcugcaccug uggugccuuc acccggcgau gcggacuugg ucggcgcgac guuggcgccg 1320

ggcauugaug auagggggcc cggcggcgcu gggcgggccc cuccgcauuu caggacugcg 1380

gaugcgagcc cugcgggguu guuggugguu ucuaaccacg ggcggcaguu guucgagugg 1440

gcgugggauc cccccgcgau ggagguggau gacccgaggg aggcguacgc uguugcgaac 1500

gcuuggguaa gguuggccuc uuguuuuuug aggcacggcg ggcaagugcg ugaggagaug 1560

cgcgauuaca gcgugcgcac ccgggcuggu gcgacgcgga ccguguaugg gacaguggcc 1620

cacgcaacga gccuuaucau gccgaggcuc aaccuugacg gaugguggcc ggcgcugauc 1680

ggcuugucag uucugcggca cgaucguauc gugccuaagc ucgaucggcg ccuccuccgu 1740

ccugccuuua ccaaguacgc ggcggacgug caccucuuga cucaucggac guuguaugag 1800

ucugggaauu ccuuggcgga ccugaaggau gcccuugucg gcgcuaaggu gguuucgcgu 1860

uuucccccgg ccuaucgggc cggggugugg ccgcacgugu uuuccgacac gugcaugccg 1920

uacgggaacu acgagugucu cgagagcggg guucuuuugg gcgggggcaa cgagaccgag 1980

ggcguggggu ucgguguuca ggguucgugg aagugggacg gcgcacagcg gagagcggcg 2040

guggauggag cgggggcgcc cgccguccgc cagagccugc gugcguugga uuccgucgcg 2100

aggaagguuu acuuccucgg gggcagcuuc cgccuugacg cgacucccga ccggcgaguu 2160

uauguugucc gcccuccugg uagccggcuc uaccauccau auuuuguucc uguucgggug 2220

cucgaggaug ggcuccccag cgaagugcgc uacacugcca ucggcaacgg cgcgcuucug 2280

uuagcaucgg gcagggcagc ugagguuggu agggcuucug gugucaucua auucuuuugu 2340

uugcuaguuc uuugcgcuga uaugcuuuuc gguuccuucu uuacgcgauu cgauuaaguc 2400

ugcaauuguc auccgcucuu agagugcgac guguuuaaua gaaugaagca uguagcgacg 2460

augccuccgc aauaccguua ggcauuugag ucaguguucu ugcuccggcg guggggcaag 2520

uucgcaugug gaacacccuu uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2567

<210> 4

<211> 1420

<212> RNA

<213> 合成()

<400> 4

cucuugauac acauaagucu uugcccuucc uuuguauguu uugcgauuuu gagccugauu 60

uuccugucuu uaucccuuuc uuguugcgga auguagaguc acgcguuuuc agugcacccg 120

cacugcucac cgcgcaggcu ucgggggguu ucgguggucc gaagaguguu cgcgugucua 180

ucgcgcacuu uccgcuggcu gcccccgaug ccgaagcccu cgaggaggag ucuuguucug 240

gcacugcagg acaggacguc uuccccguug gugucaaguc gacggugugg ugcgggggug 300

cugucugcuc ugguucuugu gguuucgacg guucuugcgg gauaucugac guggacgagc 360

guggugaggg uuacuucgcc aguacguccu ucaguuccuu gguuucgguu gcucuugcgg 420

agcuugguua ucuuggcgag cugugucgcg uccaacuuag cguuggcggc augcgcuugg 480

augcugauuu ccgcggugga gcgcguccuc agaccacugu uuuugacgcu uuugcggcag 540

aggcuuucuu cccuccuucu uuggaggagg ugguugucga ggaugucgcu ccugcuaagg 600

ugggagcgcc ugcagauauc ccggggucga ugccccuuga cuacgugguu ucgcuagccg 660

agacaauucu cccgccugcu uacguugagg cggccaaggc ugaugcgguu ucucucguuc 720

cgguuucucu uccuccuccu gccgauggac ccguccucgg cguggauccu ggcccugcca 780

uacccugcgu cgucaacgcu uuguuugacu gcgcggaggg gguggcgcaa agcaccccug 840

ggccugucuu cgcuggugau ugugauggug agaucgacgc gcgccuggcu guguugcaag 900

cuggagggac cuuaccucgc ggcugcuacu caauuguggg ugaucacaau ugguucaaua 960

uacugcgugg ccuugcucgu ugguuugcuu cgucuggggu uucugugcgu ggcgcaagga 1020

uggaucugcu ccuggggggu cugucuguag cuagggauga ccggcugcgu gcgcugcgcc 1080

uucuccgguu cuugggcuug gggagaggag gcgacgaggc ugggguuggu gaccgggugc 1140

uguuuccgcc uugcgcgcgu gccguuguug augcgcgccu ggcauaccug gucugggauu 1200

ggauuggagg cucuucugcu gcugauuaag ucaaagggcg agucaccggu cgcuugugac 1260

gaugcggcuc ggcgugaagg gaaccuuuuu agaaugaccg cguagacgac ggcggccucc 1320

gcacaaacuu uaggcuguuc uuugaaucug gaugaccgcg gcgguucggg aauccauugc 1380

ugcgcgcgaa caaaugucaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1420

<210> 5

<211> 1148

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 5

Met Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Phe Arg Asn Ala Gly

1 5 10 15

Trp Leu Arg Ala Gln Gly Glu His Pro Asp Leu Gly Ala Ile Pro Lys

20 25 30

Arg Ala Phe Val Pro Glu Pro Glu Glu Val Asp Ala Cys Leu Lys Gly

35 40 45

Ile Glu Asp Gly Trp Gly Asp Gly Ala Phe Trp Cys Pro Thr Val Ile

50 55 60

Gly Ser Ala Phe Pro Val Phe Phe Val Leu Ser Asn Glu Thr Arg Asn

65 70 75 80

Ala Phe Cys His Ser Phe Ser Ser Val Gly Gly Asp Val Asn Trp Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Leu Thr Asp Ala Arg Thr Leu Leu Tyr Arg Arg Pro Gln

100 105 110

Val Cys Val Val Ala Lys Pro Arg Pro Cys Val Ala Tyr His Arg Asp

115 120 125

Leu Ser Ser Ile Ala Arg Val Leu Arg Tyr Gly Val Leu Asn Ser Asp

130 135 140

His Lys Leu Cys Asp Ala Tyr Thr Asp Phe Val Arg Ser Pro Val Ala

145 150 155 160

Arg Thr Glu Glu Val Trp Gly Thr Leu Gly Ala Tyr Pro Trp Gly Asp

165 170 175

Leu Asp Thr Leu Val Gly Gln Ser Thr Arg Ala Glu Tyr Asp Ala Val

180 185 190

Lys Asp Ala Ala Val Val Gly Phe Leu Asp Arg Leu Trp Gly Lys Lys

195 200 205

Arg Gly Lys Gly Ala Pro Arg Asp Arg Lys Val Arg Ala Lys Ala Ala

210 215 220

Met Ala Trp Gly Asp Ala Arg Leu Trp Ser Arg Glu Val Ser Phe Lys

225 230 235 240

Arg Arg His Tyr Tyr Asp Val Ala Thr Phe Leu Cys Val Met Asp Glu

245 250 255

Val Trp Gly Ser Arg Asp Val Ala Leu Arg Gly Gly Ala Thr Asn Ala

260 265 270

Glu Ala Gly Leu Gln Val Gly Ser Phe Arg Lys Ala Val Arg Met Val

275 280 285

Leu Ser Glu Leu Val Met Gly Pro Ala Ser Tyr Glu Arg Leu Tyr Leu

290 295 300

Thr Ile Phe Trp Val Phe Ser Thr Arg Trp Trp Pro Ser Leu Val Pro

305 310 315 320

Val Leu Ile Arg Tyr Gly Thr Leu Gly Met Ser Asp Asp Glu Tyr Thr

325 330 335

Ala Ile His Lys Glu Ile Thr Ala Val Val Thr Ser Thr Trp Met Val

340 345 350

Pro Gly Thr Cys Arg Gln His Gln Phe Ser Ala Asn Phe Leu Asn Ala

355 360 365

Glu Asp Leu Thr Gly Trp Ser Asp Arg Asp Ser Leu Lys Gly Gly Val

370 375 380

Cys Thr Glu Ile Ile Lys Phe Ala Leu Ala Thr Phe Glu Tyr Arg Ala

385 390 395 400

Asp Val Arg Gly Gly Gly Gly Glu Arg Gly Met Pro Ile Ile Ala Lys

405 410 415

Glu Gly Ser Pro Ser Glu Tyr Leu Ser Arg Tyr Arg Ala Ala Met Asp

420 425 430

Gln Leu Leu Arg Pro Met Tyr Ala Lys Tyr Ser Ala Asn Met Thr Asp

435 440 445

Leu Arg Ser His Met Glu Lys Arg Met Ala Trp Met Ser Gly Gly Ala

450 455 460

Val Gly Arg Arg Ala Lys Glu Leu Leu Gly Pro Gly Ile Ala Pro Pro

465 470 475 480

Gly Ser Ser Lys Ala Tyr Val Ala Ser Arg Ala Asp Ala Asp Gln Leu

485 490 495

Thr Arg Asp Trp Gly Glu Met Arg Ile Glu Val Gly Gly Lys Gly Asn

500 505 510

Glu Arg Gly Ser Glu Arg Thr Leu Leu Ala Thr Asp Leu Arg Asp Gln

515 520 525

Val Ser Glu Ser Tyr Leu Leu His Ala Phe Lys Asn Arg Tyr Gly Leu

530 535 540

Ile Gly Val Asp Val Gly Glu Thr Pro Val Glu Met Phe Lys Arg His

545 550 555 560

Val Thr Val Ala Ser Ala Thr Asp Val Pro Met Ser Phe His Gly Arg

565 570 575

Glu Lys Lys Val Leu Ala Ala Trp Asp Tyr Ser Lys Trp Asp His His

580 585 590

Val Met Leu Ala Glu Arg Leu Leu Leu Val Gln Val Met Arg Asp Leu

595 600 605

Val Leu Glu Tyr Val Gln Arg Asp Asp Ile Arg Val Asp Met Leu Lys

610 615 620

Glu Leu Asp Val Leu Glu Ser Ser His Arg Val Ala Ile Tyr Arg Ser

625 630 635 640

Arg Ala Tyr Ala Asp Ala Arg Tyr Thr Asp Gln Val Asp Ala Leu Ile

645 650 655

Arg Asp Gly Val Lys Ala Gly Phe Lys Gly Gln Ala Val Arg Leu Ser

660 665 670

Ala Asp Gln Val Arg Ile Thr Asp Tyr Ala Gly Gln Gln Ser Gly Arg

675 680 685

Arg Ser Thr Leu Glu Ser Asn Thr Phe Tyr Ser Arg Ala Arg Leu Leu

690 695 700

Val Arg Asp Ala Glu Leu Ala Glu Gly Glu Arg Ser Val Tyr Leu Leu

705 710 715 720

Asn Arg Ala Asp Asp Val Leu Glu Val Tyr Arg Ala Trp Glu His Ala

725 730 735

Arg Asn Ala Ile Asp Val Met Leu Leu Gln Gly His Lys Ala Asn Lys

740 745 750

Lys Lys Gln Val Val Gln Val Arg Thr Gly Val Tyr Phe Arg Ile Leu

755 760 765

Tyr Ala Ala Gly Ser Met Arg Gly Phe Pro Pro Arg Ala Val Tyr Ala

770 775 780

Cys Ala Ser Ala Gly Pro Ser Met Ala Ala Ser Gly Gly Phe Asp Pro

785 790 795 800

Val Glu Arg Leu Ser Ser Leu Ser Gly Ala Leu Asp Arg Leu Ala Arg

805 810 815

Arg Gly Ser Gly Tyr Trp Val Ala Arg Ala Leu Tyr Leu Glu Ala Glu

820 825 830

Asp Tyr Tyr Arg Asp Val Arg Val Gln Leu Ala Val Lys Ala Asp Lys

835 840 845

Phe Thr Arg Phe Thr Ile Pro Arg Glu Val Leu Arg Ala Ser Pro Asp

850 855 860

Leu Gly Gly Cys Gly Val Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Asp Phe Asp Leu

865 870 875 880

Ser Ile Lys Cys Ser Glu Ile Val Gly Glu Asn Gly Arg Leu Trp Gln

885 890 895

Ala Val Arg Glu Arg Leu Glu Lys Arg His Lys Phe Arg Gly Leu Ala

900 905 910

Asp Leu Gln Gly Ser Ala Gly Arg Ala Phe Ser His Asp Val Pro Leu

915 920 925

Asp Val Pro Glu Lys Ala Trp Gln Gln Trp Gln Lys Arg Trp Arg Gly

930 935 940

Asp Arg Ala Ala Gln Asp Gly Arg Gly Glu Leu Leu Arg Ala Arg Leu

945 950 955 960

Met Gly Lys Leu Trp Arg Tyr Lys Arg Ser Trp His Arg Asp Arg Lys

965 970 975

Gly Asp Ala Trp Gly Leu Glu Gly Phe Gly His Leu Leu Ser Leu Pro

980 985 990

Val Asp Phe Phe Gln Leu Ser Trp Arg Ile Leu Arg Asp Cys Pro Gly

995 1000 1005

Ser Gly Glu Val Asp Arg Leu Met Lys Gly Val Gln Gly Pro Pro Ala

1010 1015 1020

Glu Gly Met Leu Ala Lys Leu Trp Tyr Gly Leu Gly Gln Asp Val Ile

1025 1030 1035 1040

Ser Val Leu Gly Arg Asp Val Leu Glu Val Ile Gln Ser Ala Ser Ala

1045 1050 1055

Pro Gly Arg Glu Phe Ala Ala Glu Trp Gly Trp Leu Pro Leu Asp Val

1060 1065 1070

Arg Glu Lys Phe Leu Arg Gly His Leu Gly Pro Ala Gly Ala Trp Met

1075 1080 1085

Asn Leu Met Pro Ala Ser Phe Ala Pro Trp Leu Asn Gln Ala Val Asn

1090 1095 1100

Phe Val Leu Phe Gln Ala Phe Ala Thr Gly Val Arg Tyr His Gly Ser

1105 1110 1115 1120

His Trp Leu Leu His Val Arg Gln Ala Leu Thr Gly Ala Ile Thr Arg

1125 1130 1135

Gln Phe Val Asp Ala Arg Pro Leu Val Val Leu His

1140 1145

<210> 6

<211> 842

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 6

Met Ser Phe Ser Val Ser Asp Phe Phe Val Cys Gly Gly Phe Glu Glu

1 5 10 15

Gly Trp Leu Glu Cys Gly Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ala Phe His Leu

20 25 30

Ala Ala His Val Gly Ser Asp Gly Ile Ile Asp Val Asn Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Pro Ala Ile Pro Val Val Pro Trp Asn Thr Gly Gly Gly Leu Arg

50 55 60

Asp Tyr Asp Gly Gly Gly Met Gly Gly Phe Val Asp Val Gly Val Leu

65 70 75 80

Lys Arg Pro Val Gln Leu Trp Glu Gly Glu Ala Cys Gly Leu Cys Arg

85 90 95

Ile Gly Asp Leu Ala Gly Leu Cys Glu Ile Val Gly Cys Gly Arg Arg

100 105 110

Ser Ala Gly Val Ala Thr Ala Glu Thr Glu Val Leu Val Thr Ser Cys

115 120 125

Val Met Val Ala Val Gln Arg Ala Ala Leu Ala Leu Ala Pro Asp Asp

130 135 140

Ala Asp Leu Trp Asp Thr Val Pro Val Arg Val Asn Ala Gly Gly Tyr

145 150 155 160

Ser Phe Leu Lys Asp Met Ser Leu Asp Leu Ala Ala Glu Ala Glu Val

165 170 175

Ile Thr Ser Gly Ala Glu Lys Leu Leu Ala Asp Phe Phe Lys Ser Thr

180 185 190

Ala Glu Pro His Gln Glu Val Val Ile Met Ala Gln Asp Asp Glu Glu

195 200 205

Ala Val Ile Glu Ala Gly Ala Asp His Glu Val Gly Trp Gly Asn Leu

210 215 220

Thr Thr Leu Ala Pro Cys Ala Ala Val Asp Gly Ala Asp Asp Asp Val

225 230 235 240

Val Ser Ile Val Ser Gly Arg Gly Asp Asp Val Gly Phe Glu Glu Asp

245 250 255

Val Ser Thr Gly Asp Gly Leu Gly Glu His Leu Asp Asp Phe Leu Phe

260 265 270

Leu Arg Gly Gly Thr Ala Val Glu Lys Ser Arg Ser Val Ala Gly Cys

275 280 285

Leu Leu Ala Leu Leu Arg Arg Leu Gly Asp Thr Gly Ala Asp Gly Asp

290 295 300

Gly Val Val Leu Val Phe Gly Asp Ser Pro Gly Val Ala Ala Arg Glu

305 310 315 320

Leu Ala Gln Ala Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Arg Asp Pro Lys

325 330 335

His Ala Ala Pro Pro Gly Trp Arg Asp Lys Tyr Arg Thr Val Val Ala

340 345 350

Glu Val Asp Asp Gly Leu Thr Arg Ser Glu Val Asp Gly Trp Leu Ala

355 360 365

Glu Val Asn Trp Ala Gly Arg Pro Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

370 375 380

Asp Gln Gly Gly Arg Arg Ser Ser Val Ala Asp Thr Ala Leu Asn Arg

385 390 395 400

Glu Leu Ser Thr Met Val Leu Asn Glu Trp Gly Gly Ala Phe Thr Val

405 410 415

Val Arg Tyr Arg Gly Leu Pro Val Leu Pro Phe Ser Ala Tyr Val Leu

420 425 430

Pro Thr Arg Phe His Glu Pro Gln Gly Ala Glu Met Tyr Ala Val His

435 440 445

Gly Leu Glu Gly Pro Ala Leu Ser Glu Val Ala Ala Phe His Leu Ser

450 455 460

Ser Trp His Val Glu Gly Asn Val Asn Phe Gly Val Thr Leu Leu Ser

465 470 475 480

Lys Ala Trp Arg Asp Tyr Gly Arg Arg Arg Gly Leu Gly Phe Glu Gly

485 490 495

Gly Gly Lys Gly Glu Met Ser Pro Asp Gly Gly Glu Arg Arg Gly Tyr

500 505 510

Thr Gly Lys Phe Arg Val Val Gly Ala Ala Gly Tyr Leu Ser Leu Leu

515 520 525

Gly Leu Arg Asn Gly Val Glu Glu Leu Arg Leu Ala Gly Thr Pro Phe

530 535 540

Met Arg Ala Gly Lys Asp Ala Arg Ala Phe Val Glu Leu Leu Gly Arg

545 550 555 560

Leu Lys Thr Val Met Gly Lys Val Arg Pro Glu Arg Ala Ala Glu Leu

565 570 575

Thr Ala Lys Phe Gln Pro Ala Asp Arg Val Leu Leu Arg His Val Ser

580 585 590

Asn Ala Thr Leu Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Gln Ala Met Gln Ser

595 600 605

Arg Tyr Asp Gly Leu Leu Lys Tyr Cys Ser Met Ala Glu Arg Gln Asp

610 615 620

Gln Asn Pro Asp Leu Gly Asp Leu Thr Arg His Pro Gly Phe Gly Ala

625 630 635 640

Val Phe His Trp Gly Phe Ser Arg Val Arg Asp Glu Leu Gly Val Val

645 650 655

Phe Pro Tyr Thr Gln Tyr Ala Arg Val Leu Pro Leu Ala Ala Met Pro

660 665 670

Ile Leu Ala Ser Arg Ser Trp Val Arg Met Ile Ala Trp Leu Leu Lys

675 680 685

Ala His Asp Arg Leu Met Gly Lys Pro Leu His Thr Trp Glu Leu Gln

690 695 700

Gly Leu Leu Trp Ser Leu Ser His Ile Gly Thr Gln Glu Glu Arg Glu

705 710 715 720

Val Tyr Phe Trp Gly Lys Leu Gln Gly Ala Ala Asp Met Leu Leu Ala

725 730 735

Ser Arg Arg Arg Gly Gln Arg Thr Gln Gly Ala Ala Ser Ala Asp Leu

740 745 750

Asn Arg Ile Leu Asn Ala Met Glu Ala Leu Gly Cys Lys Lys Leu Arg

755 760 765

Leu Ser Gly Leu Glu Arg Ala Ala Phe Asp Ala Ala Phe Gly Val Leu

770 775 780

Gly Arg Gly His Phe Arg His Asp Gly Asp Tyr Ser Arg Asn Pro Pro

785 790 795 800

Gly Leu Arg Arg Ala Glu Arg Val Pro Glu Arg Pro Pro Leu Ser Ala

805 810 815

Gly Ser Pro Ser His His Arg Ala Leu Ser Ser Ser Thr Thr Gly Ser

820 825 830

Arg Gly Val Tyr Thr Pro Arg Arg Ile Gly

835 840

<210> 7

<211> 756

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 7

Met Ala Thr Phe Gly Ser Ala Glu Ala Tyr Arg Ala Ala Gln Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ile Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Trp Gly Asp Phe Gly Gly Leu

20 25 30

Gly Glu Thr Ser Asp Val Phe Ala Glu His Glu Arg Phe Pro Glu Asp

35 40 45

Pro Phe Asp Ala Pro Asp His Val Asp Pro Gly Thr Ala Trp Ala Ser

50 55 60

Val Ala Thr Gly Ser Ala Asp Asp Leu Ser Arg Glu Val Ala Pro Thr

65 70 75 80

Ala Val Asp Tyr Val Pro Arg Ser Glu Pro Tyr Ser Val Arg Gly Val

85 90 95

Asp Ile Val Glu Pro Val Thr Ala Phe Cys Ser Pro Ala Asp Leu Gly

100 105 110

Met Ala Asn Phe Pro Gly Asn Val Leu Lys Gly Ser Ala Thr Thr Leu

115 120 125

Arg Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ala Asn Ala Gly Ala Ile Leu Gly Thr

130 135 140

Asp Met Leu Met Ala Pro Lys Ala Ser Val Gln Ala Ile Met Ala Arg

145 150 155 160

Val Ile Ala Ala Leu Glu Met Leu Gln Ser Gly Trp Asp Val Gly Gly

165 170 175

Pro Pro Asp Val Gly Leu Asp Val Arg His Ala Ala Arg Asp Asp Phe

180 185 190

Asp Val Ala Ser Ala Arg His Pro Gln His Ala Trp Leu Tyr Ile Pro

195 200 205

Ser Asp Trp Thr Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ser Leu Met Val

210 215 220

Glu Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Arg Trp Gly Tyr Ala Asp Gly Asp Pro

225 230 235 240

Gly Gly Asp Glu Gly Val Asn Gly Asn Pro Leu Pro Arg Asp Gly Val

245 250 255

Met Pro Ala Gly Ala Leu Trp Arg Trp Pro Gly Gly Trp Ser Asn Tyr

260 265 270

Leu Leu Ile Gly Glu Arg Asp Arg Gly Trp Asn Val Ala Phe Gly Gly

275 280 285

Asp Ala Leu Ser Val Ser Ser Leu Ser Ala Val Leu Arg Arg Met Val

290 295 300

Glu Ala Tyr Gly Gln Arg Val Tyr Leu Asp Ala Ala Arg Ala Ala Ala

305 310 315 320

Val Ala Asn Arg Ala Tyr Cys Ala Pro Ala Tyr Gln Gly Gly Gly Gly

325 330 335

Glu Arg Asp Ile Gly Thr Ala Phe Thr Ser Asp Arg Val Ser Val Arg

340 345 350

Arg Glu Asp Gly Thr Ser Gly Arg Leu Ala Val Pro Ala Arg Asn Val

355 360 365

Val Lys Asp His Pro Gly Pro Leu Pro Asp Pro Ala Ala Gly Tyr Asp

370 375 380

Gly Gly Phe Gly Gly Val Val Pro Gly Gly Cys Gly Gly Arg Val Trp

385 390 395 400

Ala Ala Pro Val Val Pro Ser Pro Gly Asp Ala Asp Leu Val Gly Ala

405 410 415

Thr Leu Ala Pro Gly Ile Asp Asp Arg Gly Pro Gly Gly Ala Gly Arg

420 425 430

Ala Pro Pro His Phe Arg Thr Ala Asp Ala Ser Pro Ala Gly Leu Leu

435 440 445

Val Val Ser Asn His Gly Arg Gln Leu Phe Glu Trp Ala Trp Asp Pro

450 455 460

Pro Ala Met Glu Val Asp Asp Pro Arg Glu Ala Tyr Ala Val Ala Asn

465 470 475 480

Ala Trp Val Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Arg His Gly Gly Gln Val

485 490 495

Arg Glu Glu Met Arg Asp Tyr Ser Val Arg Thr Arg Ala Gly Ala Thr

500 505 510

Arg Thr Val Tyr Gly Thr Val Ala His Ala Thr Ser Leu Ile Met Pro

515 520 525

Arg Leu Asn Leu Asp Gly Trp Trp Pro Ala Leu Ile Gly Leu Ser Val

530 535 540

Leu Arg His Asp Arg Ile Val Pro Lys Leu Asp Arg Arg Leu Leu Arg

545 550 555 560

Pro Ala Phe Thr Lys Tyr Ala Ala Asp Val His Leu Leu Thr His Arg

565 570 575

Thr Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Leu Lys Asp Ala Leu

580 585 590

Val Gly Ala Lys Val Val Ser Arg Phe Pro Pro Ala Tyr Arg Ala Gly

595 600 605

Val Trp Pro His Val Phe Ser Asp Thr Cys Met Pro Tyr Gly Asn Tyr

610 615 620

Glu Cys Leu Glu Ser Gly Val Leu Leu Gly Gly Gly Asn Glu Thr Glu

625 630 635 640

Gly Val Gly Phe Gly Val Gln Gly Ser Trp Lys Trp Asp Gly Ala Gln

645 650 655

Arg Arg Ala Ala Val Asp Gly Ala Gly Ala Pro Ala Val Arg Gln Ser

660 665 670

Leu Arg Ala Leu Asp Ser Val Ala Arg Lys Val Tyr Phe Leu Gly Gly

675 680 685

Ser Phe Arg Leu Asp Ala Thr Pro Asp Arg Arg Val Tyr Val Val Arg

690 695 700

Pro Pro Gly Ser Arg Leu Tyr His Pro Tyr Phe Val Pro Val Arg Val

705 710 715 720

Leu Glu Asp Gly Leu Pro Ser Glu Val Arg Tyr Thr Ala Ile Gly Asn

725 730 735

Gly Ala Leu Leu Leu Ala Ser Gly Arg Ala Ala Glu Val Gly Arg Ala

740 745 750

Ser Gly Val Ile

755

<210> 8

<211> 397

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 8

Met Phe Cys Asp Phe Glu Pro Asp Phe Pro Val Phe Ile Pro Phe Leu

1 5 10 15

Leu Arg Asn Val Glu Ser Arg Val Phe Ser Ala Pro Ala Leu Leu Thr

20 25 30

Ala Gln Ala Ser Gly Gly Phe Gly Gly Pro Lys Ser Val Arg Val Ser

35 40 45

Ile Ala His Phe Pro Leu Ala Ala Pro Asp Ala Glu Ala Leu Glu Glu

50 55 60

Glu Ser Cys Ser Gly Thr Ala Gly Gln Asp Val Phe Pro Val Gly Val

65 70 75 80

Lys Ser Thr Val Trp Cys Gly Gly Ala Val Cys Ser Gly Ser Cys Gly

85 90 95

Phe Asp Gly Ser Cys Gly Ile Ser Asp Val Asp Glu Arg Gly Glu Gly

100 105 110

Tyr Phe Ala Ser Thr Ser Phe Ser Ser Leu Val Ser Val Ala Leu Ala

115 120 125

Glu Leu Gly Tyr Leu Gly Glu Leu Cys Arg Val Gln Leu Ser Val Gly

130 135 140

Gly Met Arg Leu Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gly Ala Arg Pro Gln Thr

145 150 155 160

Thr Val Phe Asp Ala Phe Ala Ala Glu Ala Phe Phe Pro Pro Ser Leu

165 170 175

Glu Glu Val Val Val Glu Asp Val Ala Pro Ala Lys Val Gly Ala Pro

180 185 190

Ala Asp Ile Pro Gly Ser Met Pro Leu Asp Tyr Val Val Ser Leu Ala

195 200 205

Glu Thr Ile Leu Pro Pro Ala Tyr Val Glu Ala Ala Lys Ala Asp Ala

210 215 220

Val Ser Leu Val Pro Val Ser Leu Pro Pro Pro Ala Asp Gly Pro Val

225 230 235 240

Leu Gly Val Asp Pro Gly Pro Ala Ile Pro Cys Val Val Asn Ala Leu

245 250 255

Phe Asp Cys Ala Glu Gly Val Ala Gln Ser Thr Pro Gly Pro Val Phe

260 265 270

Ala Gly Asp Cys Asp Gly Glu Ile Asp Ala Arg Leu Ala Val Leu Gln

275 280 285

Ala Gly Gly Thr Leu Pro Arg Gly Cys Tyr Ser Ile Val Gly Asp His

290 295 300

Asn Trp Phe Asn Ile Leu Arg Gly Leu Ala Arg Trp Phe Ala Ser Ser

305 310 315 320

Gly Val Ser Val Arg Gly Ala Arg Met Asp Leu Leu Leu Gly Gly Leu

325 330 335

Ser Val Ala Arg Asp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Arg Leu Leu Arg Phe

340 345 350

Leu Gly Leu Gly Arg Gly Gly Asp Glu Ala Gly Val Gly Asp Arg Val

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Cys Ala Arg Ala Val Val Asp Ala Arg Leu Ala Tyr

370 375 380

Leu Val Trp Asp Trp Ile Gly Gly Ser Ser Ala Ala Asp

385 390 395

Claims

1.一种真菌病毒，其是从保藏号为CCTCC NO.M2020229的番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici)SlHN-03中分离获得，该真菌病毒具有4条双链RNA，该4条双链RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。

2.一种含有权利要求1所述真菌病毒的减毒菌株，其分类命名为番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici)SlHN-03，保藏号为CCTCC NO.M2020229。

3.权利要求1所述的真菌病毒或权利要求2所述的减毒菌株在抑制植物病原真菌致病力中的应用，其中，植物病原真菌是指囊状匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium)、番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici)或链格孢菌(Alternaria alternata)。

4.权利要求1所述的真菌病毒在细胞外感染植物病原真菌中的应用，其中，植物病原真菌是指囊状匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium)、番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici)或链格孢菌(Alternaria alternata)。

5.权利要求1所述的真菌病毒或权利要求2所述的减毒菌株在制备植物病原真菌引起的植物病害防治剂中的应用，其中，植物病原真菌是指囊状匍柄霉菌(Stemphyliumvesicarium)、番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici)或链格孢菌(Alternariaalternata)。

6.一种植物病原真菌减毒的方法，是利用权利要求1所述的真菌病毒体外感染植物病原真菌。

7.一种植物病害防治剂，其至少含有权利要求1所述的真菌病毒和/或权利要求2所述的减毒菌株。

8.一种植物病原真菌的防治方法，是将权利要求7所述的植物病害防治剂附加于植物。