CN115125260B

CN115125260B - 一种匍柄霉聚酮合成酶基因pks1及应用

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Publication number: CN115125260B
Application number: CN202210585706.3A
Authority: CN
Inventors: 周倩; 刘洪�; 王慧; 孙东辉
Original assignee: Institute Of Modern Agriculture Peking University; Hunan Agricultural University
Current assignee: Institute Of Modern Agriculture Peking University; Hunan Agricultural University
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-05-27
Also published as: CN115125260A

Abstract

本发明公开了一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1及应用，属于微生物领域。所述匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因是匍柄霉中Altersolanol A和FumigaclavineC合成的关键酶，通过在匍柄霉中超表达，可以显著提高Altersolanol A和FumigaclavineC产量。因此，本发明PKS1基因的发现和克隆为人工改造微生物，用于生物合成Altersolanol A和Fumigaclavine C提供了基础。

Description

一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1及应用。

背景技术

真菌是最具生物多样性的类群之一，也是一系列小分子活性化合物的重要来源，其代谢产物主要为生物碱，聚酮类化合物及其衍生物，萜类及多肽类等。在这些化合物当中，许多具备相当优异的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗高脂血症及抗炎等。如青霉素类来自Penicillium属、免疫抑制剂环孢菌素来自Trichoderma和Tolypocladium属、具治疗心血管疾病的洛伐他汀类药物来自Aspergillus属等。近年来，发现新结构、新活性的次生代谢产物超过50％来源于真菌。

Altersolanol A是一种四氢蒽醌类化合物，橙红色，最早从茄链格孢(Alternariasolani)的代谢物中分离得到，后相继在匍柄霉(Stemphylium spp.)和拟茎点霉(Phomopsis spp.)等真菌中被报道。Altersolanol A是一种激酶抑制剂，对多种肿瘤细胞、细菌、真菌及卵菌等都具有很强的抑制活性，尤其是它的抗癌活性备受关注。研究表明Altersolanol A对包括膀胱癌、中枢神经系统癌、结肠癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肾癌和子宫癌在内的34种人类肿瘤细胞都表现出细胞毒活性，其IC₅₀值在0.005μg/mL-0.024μg/mL之间，其平均IC₅₀为0.005μg/mL。有研究报道Altersolanol A不仅对癌细胞具有毒性，还能抑制癌细胞增殖和迁移，且不影响非癌细胞的生存能力。但目前Altersolanol A还未成为临床药物，且对其活性的研究也不够深入，尤其是作用机制方面的文献报道较少。推测可能是因为自然渠道Altersolanol A的获得量少，没有引起人们重视。

Fumigaclavine C是烟曲霉(A.fumigatus)等真菌产生的麦角类生物碱，具有诱导细胞凋亡、抑制脂肪细胞生成、预防心血管疾病、抗炎保肝和免疫抑制等多种活性，尤其是其良好的抗炎免疫抑制活性近年来越来越受到关注。有研究表明，Fumigaclavine C对部分炎症的抑制效果同临床一线用药环孢菌素A相当，同时其高度的选择性(对T淋巴细胞有显著的抑制作用，但对巨噬细胞释放NO和吞噬异物的功能没有显影响)、明确的作用靶点(抑制T淋巴细胞的活化和增殖)和较高的安全性(40mg/kg腹腔注射给药对动物的体重和脏器指数均无显著影响)，有望成为新型的免疫抑制剂，用于自身免疫性疾病的治疗。因此，研究微生物来源的Altersolanol A和Fumigaclavine C具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1在匍柄霉中超表达能够显著提高Altersolanol A和Fumigaclavine C的产量，这为开发微生物来源的Altersolanol A和Fumigaclavine C提供了新方向。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种分离的匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1，所述PKS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因序列不限于SEQ ID NO：1所示序列，还包括与该序列同源性达80％以上的基因序列。

本发明还提供一种所述的匍柄霉聚酮合成酶基因PSK1编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种所述的匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1，或者所述的蛋白在促进匍柄霉生产Altersolanol A和Fumigaclavine C中的应用。

优选的是，通过在所述匍柄霉中超表达所述PSK1基因，以提高所述AltersolanolA和Fumigaclavine C的产量。

本发明还提供一种利用所述的匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1生产Altersolanol A和Fumigaclavine C的方法，包括将所述匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1在匍柄霉中超表达的过程。

优选的是，所述匍柄霉包括番茄匍柄霉和囊状匍柄霉。

本发明还提供一种所述的匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1，或者所述的蛋白，或者所述的方法在防治马铃薯晚疫病中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过对感染真菌病毒Stemphylium lycopersici mycovirus 1(SlMV1)的匍柄霉菌株比较转录组测序，获得差异表达基因，在经过分析、筛选得到1种新的匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1，该基因是匍柄霉中Altersolanol A和Fumigaclavine C合成的关键酶，通过在匍柄霉中超表达，可以显著提高Altersolanol A和Fumigaclavine C产量。因此，本发明PKS1基因的发现和克隆为人工改造微生物，用于生物合成Altersolanol A和Fumigaclavine C提供了基础。

附图说明

图1为SlHN3菌株感染S1MV1前后Altersolanol A含量变化的液相色谱图；

图2为SlHN3菌株感染S1MV1前后Fumigaclavine C含量变化的液相色谱图；

图3为2组感染SlMV1前后的菌株(SlHN-10/SlHN-10-V和SvHN-02/SvHN-02-V)进行转录组测序比较筛选出的差异表达PKS基因；A：差异表达PKS基因编码蛋白结构示意图；B：差异表达PKS基因热图；

图4为SlHN-10(A)和SvHN-02(B)PKS1基因敲除/回补菌株表型；

图5为SlHN-10和SvHN-02菌株PKS1基因敲除/回补转化子中Altersolanol A的含量变化；

图6为SlHN-10和SvHN-02菌株PKS1基因敲除/回补转化子中Fumigaclavine C的含量变化；

图7为筛选获取的11个PKS1基因超表达转化子；

图8为PKS1基因超表达转化子提高Altersolanol A产量；

图9为PKS1基因超表达转化子提高Fumigaclavine C产量；

图10为OE-1、OE-2和OE-4发酵液对马铃薯晚疫病菌的抑菌效果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例所涉及的菌株：番茄匍柄霉菌株SlHN-03、番茄匍柄霉菌株SlHN-10和囊状匍柄霉菌株SvHN-02，均从患叶斑病的莴苣叶片上分离得到；其中SlHN-03是自然界中感染真菌病毒SlMV1的菌株，脱毒菌株SlHN-03-D是将SlHN-03通过原生质体+放线菌菌酮脱毒，获得的没有感染SlMV1病毒的菌株，其具体分离方法详见专利申请号202011153985.3；上述菌株均由北京大学现代农业研究院和湖南农业大学保存，并承诺自本发明申请日起20年内上述所有菌株均可向公众开放和提供。

实施例1感染真菌病毒Stemphylium lycopersici mycovirus 1(SlMV1)的番茄匍柄霉SlHN-03Altersolanol A和Fumigaclavine C合成显著下降

1.匍柄霉发酵液的制备

(1)将番茄匍柄霉菌株SlHN-03和脱毒菌株SlHN-03-D，于超净工作台上用灭菌的5mm打孔器，打4个菌饼，用灭菌的接种针挑取圆形菌饼接种于50mL PS液体培养基中，于28℃培养箱黑暗静置培养12天。

(2)用折叠四层的已经灭菌纱布，将静置培养12天的菌丝与菌液分离。所得发酵液-20℃保存备用。

2.高效液相色谱法(HPLC)测定Altersolanol A含量

(1)仪器及色谱条件

用岛津髙效液相色谱进行分析，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm2.1mm，1.7μm)，SPD-M20A PDA检测器；柱温37℃；流动相为30％甲醇和70％水；进样量10μL；流速1mL/min；波长220nm。

(2)标准品的配制及标准曲线的制备

Altersolanol A标准品购自Sigama。用精密天平精确称取Altersolanol A标准品，用甲醇溶解，配制成浓度为160μg/mL的标准品溶液，然后梯度稀释成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。以不同Altersolanol A浓度为横坐标，不同浓度对应的液相峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

(3)Altersolanol A含量的测定

吸取10mL过滤发酵液放入新的50mL离心管中加入10mL甲醇混匀，4℃过夜，然加入等体积的乙酸乙酯充分混匀后静置20min取上清，进行氮气吹干，直至出现橙红色结晶体。最后加入5mL甲醇，超声促溶后用0.22μm的细菌过滤器过滤后上机检测。

3.高效液相色谱法(HPLC)测定Fumigaclavine C含量

(1)仪器及色谱条件

用岛津髙效液相色谱进行分析，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，SPD-M20APDA检测器(100mm 2.1mm，1.7μm)；柱温37℃；流动相为35％乙睛和65％水(含0.1％三氟乙酸)；进样量10μL；流速1mL/min；波长227nm。

(2)标准品的配制及标准曲线的制备

Fumigaclavine C标准品购自Sigama。精确称取标准品，用甲醇溶解配制成160mg/L的标准品溶液，然后梯度稀释成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。以不同Altersolanol A浓度为横坐标，不同浓度对应的液相峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

(3)Fumigaclavine C含量的测定

向发酵液中加入等量体积乙酸乙酯并加入30颗玻璃珠，置于振荡摇床上，200rpm萃取30min，重复萃取3遍。合并上层乙酸乙醋，在45℃下进行旋转蒸发，所得浸膏加入5mL甲醇，超声促溶后用细菌过滤器过滤，所得溶液上机检测。

将感染SlMV1的番茄匍柄霉菌株SlHN-03与脱毒菌株SlHN-03-D的发酵液分别与Altersolanol A和Fumigaclavine C的标准品进行高效液相色谱分析，结果表明Altersolanol A和Fumigaclavine C的合成显著下降(图1和图2)。

实施例2匍柄霉Altersolanol A和Fumigaclavine C合成关键基因的候选与验证

将SlMV1分别感染高产Altersolanol A和Fumigaclavine C的番茄匍柄霉菌株SlHN-10和囊状匍柄霉菌株SvHN-02，得到Altersolanol A和Fumigaclavine C合成受阻的菌株SlHN-10-V和SvHN-02-V，然后分别将2组感染SlMV1前后的菌株(SlHN-10/SlHN-10-V和SvHN-02/SvHN-02-V)进行比较转录组测序，在差异表达的基因中筛选与Altersolanol A和Fumigaclavine C合成有关的基因。由于Altersolanol A是橙红色的四氢蒽醌类化合物，属于聚酮类化合物，因此在差异表达的基因中首先关注PKS基因。发现2组差异基因中有1个同源的PKS基因，其编码的蛋白序列相似度高达98.3％，且野生型菌株受到SlMV1感染后，该基因的表达量均显著降低(图3)，因此推测该基因与Altersolanol A和Fumigaclavine C合成有关。接着进行该PKS基因功能的验证，由于该PKS是匍柄霉中第一个被克隆的基因，因此命名为PKS1。具体操作如下：根据转录组测序结果设计引物，为了方便将基因克隆进表达载体，引物序列前加入了载体同源序列(斜体)，为了方便检验基因克隆进了表达载体，引物序列加入酶切位点(下划线)：

PKS1-F，

PKS1-R，

/>

PCR扩增PKS1基因，具体操作过程如下：

1.真菌DNA及RNA的提取

实验方法和步骤参照天根生化科技(北京)有限公司快速DNA提取检测试剂盒(KG203)和RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书。

2.PKS1基因PCR扩增

反应体系：DNA模板1μL，PKS1-F和PKS1-R引物(10μM)各1μL，Mix 12.5μL，灭菌ddH₂O 9.5μL混匀，按以下条件进行扩增：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物克隆至T载体，送测序公司测序验证。

结果显示：PKS1基因在SlHN-10菌株中全长为5640bp(SEQ ID NO：5)，在SvHN-02菌株中全长5649bp(SEQ ID NO：6)。PKS1基因CDS的RT-PCR扩增

RNA的反转录，参照天根生化科技(北京)有限公司Quant cDNA第一链合成试剂盒(KR103)。PCR反应体系参照PKS1基因PCR扩增体系。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，RT-PCR产物克隆至T载体，送测序公司测序验证。

结果显示：PKS1基因在SlHN-10菌株中CDS为5418bp；在SvHN-02菌株中CDS为5421bp(SEQ ID NO：3)，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.PKS1基因功能的验证

利用基因敲除载体pCX62和基因回补载体KSTNP分别构建SlHN-10和SvHN-02PKS1基因的敲除与回补载体，具体操作如下：

(1)基因敲除载体的目的片段获得

构建基因敲除载体的方法为在基因敲除载体pCX62潮霉素基因的两端分别插入PKS1基因的上、下游片段。根据NCBI数据库收录的番茄匍柄霉基因组信息，用Primer 5.0设计引物，添加合适的酶切位点(下划线)和保护碱基(斜体)。番茄匍柄霉上游同源臂扩增引物：SL-5’F，

SL-5’R，/>

番茄匍柄霉下游同源臂扩增引物：SL-3’F，

SL-3’R，/>

囊状匍柄霉上游同源臂扩增引物：Sv-5’F，/>

Sv-5’R，/>

囊状匍柄霉下游同源臂扩增引物：Sv-3’F，/>

Sv-3’R，/>

)，扩增PKS1的上游、下游各1,000bp左右的片段，其中，反应体系为：DNA模板1μL，引物(10μM)各1μL，Mix 12.5μL，灭菌ddH₂O 9.5μL混匀，按以下条件进行扩增：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最后72℃延伸10min。以番茄匍柄霉CS12菌株所提取的DNA为模板进行PCR扩增，获得带有相应酶切位点的目的片段。PCR产物分用1％凝胶电泳检测质量，并且将其送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列正确的片段回收，酶切回收-20℃备用。

(2)回补片段的获得

构建回补载体的方法为在KSTNP载体中插入PKS1基因及其上游1,500bp左右的启动子序列。根据NCBI数据库收录的番茄匍柄霉基因组信息用Primer 5.0设计引物，为了方便将基因克隆进载体，引物序列前加入了载体同源序列(斜体)，为了方便检验基因克隆进了载体，引物序列加入酶切位点(下划线)。番茄匍柄霉回补片段扩增引物：Sl-PKS1-F，

Sl-PKS1-R，

囊状匍柄霉回补片段扩增引物：Sv-PKS1-F，/>

Sv-PKS1-R，/>

以番茄匍柄霉CS12菌株所提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系：DNA模板1μL，引物(10μM)各1μL，Mix 12.5μL，灭菌ddH₂O 9.5μL混匀，按以下条件进行扩增：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，进行30个循环，最后72℃延伸10min。获得带有相应载体同源臂序列目的片段。PCR产物分用1％凝胶电泳检测质量，并且将其送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列正确的片段回收，酶切回收-20℃备用。

(3)载体的活化以及重组载体的构建

将用甘油保存的pCX62和KSTNP载体在LB平板上画线于37℃过夜培养，挑取单菌落于LB液体培养基中，在180rpm 37℃的摇床中培养12-16h后用于质粒的提取。质粒提取步骤参照天根生化科技(北京)有限公司高纯度质粒小提试剂盒(DP104)。载体用相应的酶切回收后与目的片段连接，然后转化大肠杆菌，PCR挑选阳性克隆，送上海生工测序验证。

(4)PEG介导的原生质体转化法

①取PDA平板上生长4-5天的SlHN-03菌落边缘菌饼2块，接种到50mL灭菌PD液体培养基中，28℃恒温培养箱中震荡培养2-3d；

②用灭菌的1mL枪头吸取短小的菌丝培养液，加到2层灭菌擦镜纸上过滤，收集幼嫩的菌丝体，并用灭菌的0.7M NaCl溶液洗涤3-4次；

③收集绿豆大小菌丝团与酶解液充分混合(注意，菌丝此时不能成团块，必须尽量均匀悬浮于酶解液中，可颠倒震荡混匀)，28℃，80r/min振荡培养2.5小时，取10μL酶解液镜检，如果没有酶解彻底，可适当延长酶解时间至3小时左右；

④用2层灭菌的擦镜纸过滤，用灭菌的0.7M NaCl溶液洗涤8-10次，每次1mL(注意枪头不要戳破擦镜纸)，收集滤液；

⑤将收集的滤液5000r/min，室温离心5min，弃上清(超净台操作)，收集沉淀，富集成1管，用灭菌的200μL STC(1M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM CaCl₂。)悬浮原生质体沉淀；

⑥取10μL STC悬浮液镜检，10×40倍镜头观察，每个视野10个以上原生质体细胞可用于PEG介导转化；

⑦200μL原生质体加入10-15g质粒，缓慢滴入灭菌的400μL PTC(PEG8000 40g，补STC溶液到100mL，在65℃水浴锅中加速溶解，0.22μm细菌过滤器过滤除菌)，轻轻颠倒混匀，冰上孵育10min；

⑧向上述液体加入灭菌的700μL PTC，室温孵育10min；

⑨将离心管中全部液体加到6mL灭菌的RM液体培养基中(无抗生素，10mL的离心管必须灭菌)，28℃，80rpm，孵育2-4h(至肉眼可见白色小颗粒)；

⑩将全部液体加入到100mL灭菌的RM培养基中(含所转化质粒相对应的抗生素)，混匀倒板(培养皿灭菌)。28℃培养箱，2-3天可长出转化子(每皿大约10-20个菌落左右)，然后在长出转化子的平板上覆盖含抗生素的培养基3次(注意，一定不能让单个菌落长到一起)。长出的单菌落挑到新的含抗生素的培养基上，再覆盖3次；

抗生素筛选出的转化子提取DNA检测，PCR检测阳性转化子(图4)。

然后以Altersolanol A和Fumigaclavine C标准品为对照，分别对野生型菌株、基因敲除及回补菌株的发酵液进行高效液相色谱分析(参照实施例1)。

结果显示，PKS1基因敲除菌株Altersolanol A和Fumigaclavine C合成抑制，而回补菌株合成恢复(图5和图6)，说明PKS1基因是Altersolanol A和Fumigaclavine C合成的关键基因。

实施例3番茄匍柄霉中超表达PKS1基因提高Altersolanol A和Fumigaclavine C产量

1.真菌RNA的提取参照实施例2。

2.PKS1超表达载体的构建

利用ExnaseⅢ酶将纯化回收后的PKS1基因CDS全长和KSTNP载体连接，热激转化E.coli DH5ɑ，构建得到PKS1基因超表达载体。

3.PKS1基因超表达载体遗传转化及检测参照实施例2。

将PKS1基因超表达载体转化番茄匍柄霉菌株CS12，获得11个PKS1基因超表达转化子(图7)，从培养性状观察来看Altersolanol A合成显著增加(Altersolanol A橙红色)。从PKS1基因超表达转化子中随机挑选菌株OE-11，测定其发酵液中Altersolanol A和Fumigaclavine C的含量，与SlHN-10相比超表达转化子合成Altersolanol A和Fumigaclavine C的能力显著增加(图8和图9)。

有文献报道Altersolanol A具有抗菌等多种活性，因此从11个转化子中随机选择3个超表达转化子OE-1、OE-2和OE-4测定了其发酵液对马铃薯晚疫病菌的抑菌效果，结果显示野生型番茄匍柄霉菌株CS12发酵液稀释10倍对晚疫病菌有100％抑制效果，而PKS1基因超表达菌株OE-1、OE-2和OE-4的发酵液稀释80倍对晚疫病菌仍有100％抑菌效果(图10)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 北京大学现代农业研究院湖南农业大学

<120> 一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccttctt caagttcctg ggacagtatg gaggacgcaa agccttctct cctctttttc 60

aacaatgatc tgcccagcga cgatatcaat caattgtacc gtgttcttca ccgccgcact 120

gctcaattga gctgtcctca gcttgcccac ttcatcaggt tatgcaacca agtaatcaca 180

gaagagattg ccaaattgcc gaaacaatgg caagagaaag tccccgactt cgtcaatgtt 240

ttgagcttgg tcaacgacag tgcttttcgc aaaggacctt tgggtggtgc tatggaaggc 300

gttttcctta atatcctcca gatcggcatg atcctcggcc accacgaggt cgaacaggta 360

ccgtatcaat tcgacccaag gactacaacg ttattcggtc taggagttgg cctcctttca 420

gctgctgctg cctccgtgtc cctcaatgtc gcagatctcg ctattgctgg tgctcacatc 480

gtgcgcgctt ccttccgact cggcattcat gtgtacaaca tctccgaaca gctggaggcc 540

ccagatgcgg acggtaaccc ctgggccttc gtcatccccg gtttgactgc agaggtcgtg 600

caggctgagt tagaccggta caatcatgac acggccaacc cgaatctttc acacatcttc 660

atcagtgcat ccgacaaaac ctcagtctct gtcagtggcc ccccctctcg cctacgacaa 720

tgtctgaaga gctccgatgt tctccgatac tccaacttcc tggcactacc tgtgcatcat 780

ggcctctgcc atgctcctca catatactcc gctgtagatg tacagaccat catcgaggat 840

atattagatg atgatcatac aaggatagct ggactcaaga cgtccttgcc attgttgtct 900

tccagcaccg gccgtccata tccggcgaaa gacttccgca gcttgatcga ccaggttctt 960

gcggagcttc tcatgaacaa aattcacatc gacaatgtcg tcgatggtat tatcgaggtt 1020

ctcgacctgc cctcagcgag tcaacaggag cggaatcttt tcgcgttccg caactccgtt 1080

atcctgagga cgatgatgaa gaatgtggga aacaaatgcg acgatcgcat tactttcaca 1140

caccgagatc tcatcgagtg gacgaaacgc gaggagagcg atggtgagac cccaatctca 1200

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gatctagagc tcttttggaa gctcatggcc gagaagcgcg atgtgcacac gacaattccc 1320

cctgatcgtt ttgacttgag tacccacttc gatccaacag gtcagatcga gaatacgaca 1380

caaacaccgt acatgaacca catcgagagt ccgggcttgt ttgacgctgg attcttcaac 1440

atctctccta aagaggcaga acagatggat cctatgcatc gccttgccct tgtcactgct 1500

tacgaagctc ttgagatgtc cggatactcc cccaaccgaa cgcgctccac ttcctcccct 1560

agggtcggca cctactatgg ccaagcgagc gatgattggc gtgaactcaa cgccagccaa 1620

aacattggaa cgtacgccgt ccccagtggc gagcgtggct tcgcgaacgg acggatcaac 1680

tacttcttta agttcagtgg acccagcttc aacatggaca ccgcctgttc tagcggcctt 1740

gccgcggtaa atgcagcatg ctcagctttg tgggctggag atgtagacac tgccatcgcg 1800

ggaggcttga atgtcatcac tgacccagac aatttctgtc agctcggaaa gggtcatttc 1860

ttgtctctca cgggacaatg caaagtttgg gacgaggccg ctgatggcta ctgtcgcgcc 1920

gatggcgttg gtagcgtagt catcaaacgt ctcgatgacg ccttggccga caacgacaag 1980

attttggcga caatcttagc ggccaacacg aaccattcgg ctgacgcgat ctcaataacc 2040

catccacatg ctccgacgca gtcgctgaac taccagagag tgatgtctca ggcaggcttc 2100

tcgccgctag atgtgagcta cgtggagctt catggaacgg gtacccaagc aggagatcgc 2160

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gaccgactga gactgggtgc tgtcaagtcc aacattgggc atggagaggc ggctgctggt 2280

atcgcttcgt ttatcaaagt gttgctcatg taccagaagt ctgctatccc gccccagatc 2340

ggcgtcaaga aactgaaccc tacacttcca caggacttgg aggagcgcaa catcggcctg 2400

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accggtcaag gagcgttcta tgtcggcatg ggttcacagc tctacgcaca ctgttccagt 2880

tttcgtgaag acgtccagcg gctcgatcgc ttggcactgt cattcaatct agggtttgac 2940

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ccagtcatct cccctctcct cgccgaatgt attttcgacg gtaagaccct caaccacaag 3540

tatctgcgtc gcgcaactag ggagcaagtc gacgttgtgg gtgccctaga tgctgtccag 3600

gaacttggta ttgctgacgc ggataccgtc tggattgaca ttggtcccca catgattgcc 3660

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gtcgtatgga acgaatactt ccgcgaacat gagcgcgctc atcaagcgtt acacttacct 3840

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agtggaatgg gatccaagtt gaagacatct acaattcacg gcattgtttc tgagtcggta 4020

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gccgtggagg gccaccggat gaacaatcac ggtgtcgcat catcctctat ctgggccgac 4140

atggccttta cagtgggtag atacctccat agtctcggct acccgaagga aaaggacttc 4200

catatgaact tgcatgatat ggagatcctc cacgcacagg ttgctaggtc ccgcaaggat 4260

ggcccgcaat tgatccaact tgaggcaact cttgacattc atgccaggag tgtggccatc 4320

ttcttataca acgtatccaa ggacggtgtc cgagacgctg aacattatgg ctcttgtaag 4380

gttcagttcg aagatgcggc cacctggagt aagaactgga agcgcctcga gcatctagtt 4440

ggacagcgca ttcaagcctt ggaccgtttg gccactgaag gcctcgccag caaaattaac 4500

cgaaacatgg cgtacacgct tttcaagaat gttgtcacct atgccgacca ctaccggggc 4560

atgcgatctg ttgtcctgaa agactacgaa gcttttgcag atgtcactct tcatccggaa 4620

gaacttggtt tatggcacac tccaccacat tggatcgaca gtctctgcca cttgggaggc 4680

ttcatcctca atggctctga tgcttccaac acggctgact tcttttatgt cactcctgga 4740

tgggagacgt ttcgtcttgc tcgcccaccg caggcaggtg cgagctatcg gagctatgtg 4800

caaatggtgc agagtgaaga agacccgaag ttctggaccg gagacgtgta tattctccag 4860

ggtgatacca tcatcggtat gatggggcag atgaagttcc ggcagatcaa ccggatcttg 4920

atggaccggt tcttctcgcc tagcgagggt cacggcacgg cccatgctag cgccagcagc 4980

aaggtgaaga cgatcgctcc agctgttgcc gcgccggtag ccaaggcgac agccccggca 5040

gttactcaac cggctcctgc agcagctcaa caagcgcacg ctatcgcgac gccttcctct 5100

gctccgtcca atccgcctgc ggtcaactcg gctccggctc cggcctctac ctcagcacca 5160

gcagagaagg cggagccagt aaacgaggag aatcctctca ttgcaggcgc gatcgattta 5220

atcgtcaacg agacgggtgt tgacgagtcg gaattaaagg atgacacaac cttcatgcag 5280

attggtgttg attctctcat gtcgctggtt ttggtggaaa agttcaagaa cattctcaag 5340

atggagatta agagctcact attcattgag tgtgagactg tcggtgtctt caaggaatgg 5400

ctggaagaga atcgatga 5418

<210> 2

<211> 1805

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Ser Ser Ser Ser Trp Asp Ser Met Glu Asp Ala Lys Pro Ser

1 5 10 15

Leu Leu Phe Phe Asn Asn Asp Leu Pro Ser Asp Asp Ile Asn Gln Leu

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Tyr Arg Val Leu His Arg Arg Thr Ala Gln Leu Ser Cys Pro Gln Leu

35 40 45

Ala His Phe Ile Arg Leu Cys Asn Gln Val Ile Thr Glu Glu Ile Ala

50 55 60

Lys Leu Pro Lys Gln Trp Gln Glu Lys Val Pro Asp Phe Val Asn Val

65 70 75 80

Leu Ser Leu Val Asn Asp Ser Ala Phe Arg Lys Gly Pro Leu Gly Gly

85 90 95

Ala Met Glu Gly Val Phe Leu Asn Ile Leu Gln Ile Gly Met Ile Leu

100 105 110

Gly His His Glu Val Glu Gln Val Pro Tyr Gln Phe Asp Pro Arg Thr

115 120 125

Thr Thr Leu Phe Gly Leu Gly Val Gly Leu Leu Ser Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Ser Val Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Ala Ile Ala Gly Ala His Ile

145 150 155 160

Val Arg Ala Ser Phe Arg Leu Gly Ile His Val Tyr Asn Ile Ser Glu

165 170 175

Gln Leu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Gly Asn Pro Trp Ala Phe Val Ile

180 185 190

Pro Gly Leu Thr Ala Glu Val Val Gln Ala Glu Leu Asp Arg Tyr Asn

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His Asp Thr Ala Asn Pro Asn Leu Ser His Ile Phe Ile Ser Ala Ser

210 215 220

Asp Lys Thr Ser Val Ser Val Ser Gly Pro Pro Ser Arg Leu Arg Gln

225 230 235 240

Cys Leu Lys Ser Ser Asp Val Leu Arg Tyr Ser Asn Phe Leu Ala Leu

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Pro Val His His Gly Leu Cys His Ala Pro His Ile Tyr Ser Ala Val

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Ala Glu Leu Leu Met Asn Lys Ile His Ile Asp Asn Val Val Asp Gly

325 330 335

Ile Ile Glu Val Leu Asp Leu Pro Ser Ala Ser Gln Gln Glu Arg Asn

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Leu Phe Ala Phe Arg Asn Ser Val Ile Leu Arg Thr Met Met Lys Asn

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370 375 380

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385 390 395 400

Pro Lys Arg Ser Lys Leu Ala Val Val Gly Met Ser Cys Arg Leu Pro

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Gly Gly Ala Asn Asp Leu Glu Leu Phe Trp Lys Leu Met Ala Glu Lys

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Met Asn His Ile Glu Ser Pro Gly Leu Phe Asp Ala Gly Phe Phe Asn

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Ile Ser Pro Lys Glu Ala Glu Gln Met Asp Pro Met His Arg Leu Ala

485 490 495

Leu Val Thr Ala Tyr Glu Ala Leu Glu Met Ser Gly Tyr Ser Pro Asn

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Arg Thr Arg Ser Thr Ser Ser Pro Arg Val Gly Thr Tyr Tyr Gly Gln

515 520 525

Ala Ser Asp Asp Trp Arg Glu Leu Asn Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr

530 535 540

Tyr Ala Val Pro Ser Gly Glu Arg Gly Phe Ala Asn Gly Arg Ile Asn

545 550 555 560

Tyr Phe Phe Lys Phe Ser Gly Pro Ser Phe Asn Met Asp Thr Ala Cys

565 570 575

Ser Ser Gly Leu Ala Ala Val Asn Ala Ala Cys Ser Ala Leu Trp Ala

580 585 590

Gly Asp Val Asp Thr Ala Ile Ala Gly Gly Leu Asn Val Ile Thr Asp

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Asp Gly Val Gly Ser Val Val Ile Lys Arg Leu Asp Asp Ala Leu Ala

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Asp Asn Asp Lys Ile Leu Ala Thr Ile Leu Ala Ala Asn Thr Asn His

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Ser Ala Asp Ala Ile Ser Ile Thr His Pro His Ala Pro Thr Gln Ser

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Val Ser Tyr Val Glu Leu His Gly Thr Gly Thr Gln Ala Gly Asp Arg

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Glu Glu Ala Lys Ser Val Ser Asp Val Phe Ala Pro Val Ala Pro Arg

725 730 735

Arg Lys Lys Lys Asp Arg Leu Arg Leu Gly Ala Val Lys Ser Asn Ile

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Gly His Gly Glu Ala Ala Ala Gly Ile Ala Ser Phe Ile Lys Val Leu

755 760 765

Leu Met Tyr Gln Lys Ser Ala Ile Pro Pro Gln Ile Gly Val Lys Lys

770 775 780

Leu Asn Pro Thr Leu Pro Gln Asp Leu Glu Glu Arg Asn Ile Gly Leu

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Asn Trp Glu Tyr Ala Glu Trp Pro Arg Pro Lys Thr Gly Ser Arg Leu

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Leu Ser Asp Ala Pro Met Arg Ser Pro Val Val Thr Asp Pro Arg Thr

835 840 845

Asn Phe Pro Ile Ser Val Ser Ala Arg Ser Lys Asn Ser Leu Lys Met

850 855 860

Asn Thr Glu Ala Met Leu Gln Tyr Leu Asn Asp His Glu Asp Thr Gln

865 870 875 880

Leu Gly Asp Leu Ser Tyr Thr Leu Thr Ala Arg Arg Ile His His Pro

885 890 895

Phe Arg Leu Ala Thr Ser Val Lys Asp Ile Ser Gln Ala Lys Lys Phe

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Leu Ser Thr Glu Ile Glu Lys Met Gln Gln Gln Gln Trp Val Ser Thr

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Ala Phe Tyr Val Gly Met Gly Ser Gln Leu Tyr Ala His Cys Ser Ser

945 950 955 960

Phe Arg Glu Asp Val Gln Arg Leu Asp Arg Leu Ala Leu Ser Phe Asn

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Leu Gly Phe Asp Ser Val Ile Pro Val Ile Asp Gly Ser Ala Gly Asp

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Ser Asp Lys Val Asp Pro Val Val Ser Gln Val Ala Ile Val Leu Ile

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1010 1015 1020

Met Val Met Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Ala Val Ala

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Gly Val Ile Ser Glu Leu Asp Ala Leu Tyr Leu Thr Ala Ala Arg Ala

1045 1050 1055

Lys Leu Met Ala Asp His Cys Gln Val Gly Thr His Asn Met Leu Ala

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Val Arg Cys Ser Ile Asp Arg Leu Glu Glu Leu Leu Val Gly Arg Glu

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Ser Gly Glu Gln Ala Lys Ile Gln Asp Leu Ala Asn Ile Leu Ala Ala

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Ala Gly Leu Lys Ser Thr Ala Leu Lys Val Pro Tyr Ala Phe His Ser

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Ala Gln Met Asp Pro Ile Leu Glu Ser Phe Ala Gln Leu Ala Glu Asn

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Val Thr Phe Lys Ala Pro Gln Ile Pro Val Ile Ser Pro Leu Leu Ala

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Glu Cys Ile Phe Asp Gly Lys Thr Leu Asn His Lys Tyr Leu Arg Arg

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Ala Thr Arg Glu Gln Val Asp Val Val Gly Ala Leu Asp Ala Val Gln

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Glu Leu Gly Ile Ala Asp Ala Asp Thr Val Trp Ile Asp Ile Gly Pro

1205 1210 1215

His Met Ile Ala Gly Gly Met Val Arg Asn Leu Leu Lys Pro Lys Thr

1220 1225 1230

Val Val Ala Ser Leu Lys Arg Asp Glu Asp Ser Phe Ser Thr Leu Val

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Ser Ser Leu Val Thr Leu His Arg Ala Gly Val Ser Val Val Trp Asn

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Glu Tyr Phe Arg Glu His Glu Arg Ala His Gln Ala Leu His Leu Pro

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Thr Tyr Arg Trp Asn Asp Lys Asn Tyr Trp Ile Pro Tyr Leu Gly Thr

1285 1290 1295

Trp Thr Leu Asp Lys Ala His Ile Lys Glu Asn Leu Glu Lys Ala Lys

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Gln Asn Glu Ala Leu Ser Gly Ile Ser Gly Met Gly Ser Lys Leu Lys

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Thr Ser Thr Ile His Gly Ile Val Ser Glu Ser Val Gly Glu Ser Thr

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Val Ser Leu Val Thr Leu Ser Asp Leu Leu Asp Pro Ala Phe Leu Glu

1345 1350 1355 1360

Ala Val Glu Gly His Arg Met Asn Asn His Gly Val Ala Ser Ser Ser

1365 1370 1375

Ile Trp Ala Asp Met Ala Phe Thr Val Gly Arg Tyr Leu His Ser Leu

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Gly Tyr Pro Lys Glu Lys Asp Phe His Met Asn Leu His Asp Met Glu

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Ile Leu His Ala Gln Val Ala Arg Ser Arg Lys Asp Gly Pro Gln Leu

1410 1415 1420

Ile Gln Leu Glu Ala Thr Leu Asp Ile His Ala Arg Ser Val Ala Ile

1425 1430 1435 1440

Phe Leu Tyr Asn Val Ser Lys Asp Gly Val Arg Asp Ala Glu His Tyr

1445 1450 1455

Gly Ser Cys Lys Val Gln Phe Glu Asp Ala Ala Thr Trp Ser Lys Asn

1460 1465 1470

Trp Lys Arg Leu Glu His Leu Val Gly Gln Arg Ile Gln Ala Leu Asp

1475 1480 1485

Arg Leu Ala Thr Glu Gly Leu Ala Ser Lys Ile Asn Arg Asn Met Ala

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Tyr Thr Leu Phe Lys Asn Val Val Thr Tyr Ala Asp His Tyr Arg Gly

1505 1510 1515 1520

Met Arg Ser Val Val Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Phe Ala Asp Val Thr

1525 1530 1535

Leu His Pro Glu Glu Leu Gly Leu Trp His Thr Pro Pro His Trp Ile

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Asp Ser Leu Cys His Leu Gly Gly Phe Ile Leu Asn Gly Ser Asp Ala

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Ser Asn Thr Ala Asp Phe Phe Tyr Val Thr Pro Gly Trp Glu Thr Phe

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Arg Leu Ala Arg Pro Pro Gln Ala Gly Ala Ser Tyr Arg Ser Tyr Val

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Gln Met Val Gln Ser Glu Glu Asp Pro Lys Phe Trp Thr Gly Asp Val

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Tyr Ile Leu Gln Gly Asp Thr Ile Ile Gly Met Met Gly Gln Met Lys

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Phe Arg Gln Ile Asn Arg Ile Leu Met Asp Arg Phe Phe Ser Pro Ser

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Glu Gly His Gly Thr Ala His Ala Ser Ala Ser Ser Lys Val Lys Thr

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Ile Ala Pro Ala Val Ala Ala Pro Val Ala Lys Ala Thr Ala Pro Ala

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Val Thr Gln Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Gln Ala His Ala Ile Ala

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Thr Pro Ser Ser Ala Pro Ser Asn Pro Pro Ala Val Asn Ser Ala Pro

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Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ala Pro Ala Glu Lys Ala Glu Pro Val Asn

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Glu Glu Asn Pro Leu Ile Ala Gly Ala Ile Asp Leu Ile Val Asn Glu

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Thr Gly Val Asp Glu Ser Glu Leu Lys Asp Asp Thr Thr Phe Met Gln

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Ile Gly Val Asp Ser Leu Met Ser Leu Val Leu Val Glu Lys Phe Lys

1765 1770 1775

Asn Ile Leu Lys Met Glu Ile Lys Ser Ser Leu Phe Ile Glu Cys Glu

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Thr Val Gly Val Phe Lys Glu Trp Leu Glu Glu Asn Arg

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<211> 5421

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaccgactga gactgggtgc tgtcaagtcc aacattgggc atggagaggc ggctgctggt 2280

atcgcttcgt ttatcaaagt gttgctcatg taccagaagt ctgccatccc gccccagatc 2340

ggcgtcaaga agctgaaccc tacacttcca caggatttgg aggagcgcaa catcggccta 2400

aactgggaat acgccgagtg gccaagaccg aagactggat cgcgccttgc catcgtgaac 2460

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ttaggcgatc tttcctacac tctcactgca cgacgcatgc atcacccatt ccgcctagct 2700

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aagcattgtc gagttggcac tcacactatg ttggctgtaa gatgtagcat cgatcgactg 3240

gaggagctat tggtaggccg cgaacaggac tacgagctcg cttgcatcaa cggcgaaagc 3300

gaccttgtca tcagtggaga gcaaaccaag attcaagacc tcgcgaatat cctagcgact 3360

gcaggcttga aatctacggc actcaaggtg ccatatgctt tccattctgc tcaaatggat 3420

ccaatcttgg aatcatttgc tcaactagcg gagaacgtca ccttcaaagc tccgcagatc 3480

ccagtcattt cccctctcct cgccgaatgt attttcgacg gtaagacgat caaccataag 3540

tatctgcgtc gcgcaactag ggagcaagtc gacgttgtgg gcgccctaga tgctgcccaa 3600

gaactcggta ttgctgacgc ggataccgtc tggattgata ttggtcccca catgattgcc 3660

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<212> PRT

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Lys Leu Pro Lys Gln Trp Gln Glu Lys Val Pro Asp Phe Val Asn Val

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Leu Ser Leu Val Asn Asp Asn Ala Phe Arg Lys Gly Pro Leu Gly Gly

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Ala Met Glu Gly Val Phe Leu Asn Ile Leu Gln Ile Gly Met Ile Leu

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Gly His His Glu Val Glu Gln Val Pro Tyr Gln Phe Asp Pro Lys Thr

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Thr Thr Leu Phe Gly Leu Gly Val Gly Leu Leu Ser Ala Ala Ala Ala

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Ser Val Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Ala Ile Ala Gly Ala His Ile

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Val Arg Ala Ser Phe Arg Leu Gly Ile His Val Tyr Asn Ile Ser Glu

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Val Val Ala Ser Leu Lys Arg Asp Glu Asp Asn Phe Ser Ala Leu Val

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Phe Leu Tyr Asn Val Ser Lys Asp Gly Val Arg Asp Ala Glu His Tyr

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Gly Ser Cys Lys Val Gln Phe Glu Asp Ala Ala Thr Trp Ser Lys Asn

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Trp Lys Arg Leu Glu His Leu Val Gly Gln Arg Ile Gln Ala Leu Asp

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Arg Ser Ala Thr Glu Gly Val Ala Ser Lys Ile Asn Arg Asn Met Ala

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Tyr Thr Leu Phe Lys Asn Val Val Thr Tyr Ala Asp His Tyr Arg Gly

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Met Arg Ser Val Val Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Phe Ala Asp Val Thr

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Leu His Pro Glu Glu Leu Gly Leu Trp His Thr Pro Pro His Trp Ile

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Gln Met Val Gln Ser Glu Glu Asp Pro Lys Phe Trp Thr Gly Asp Val

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Tyr Ile Leu Gln Gly Asp Thr Ile Ile Gly Met Met Gly Gln Met Lys

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Val Thr Gln Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Gln Thr His Ala Val Ala

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Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Asn Leu Pro Ala Val Asn Ser Ala Pro

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Asn Asp Glu Asn Pro Leu Ile Ala Gly Ala Ile Asp Leu Ile Val Asn

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atgtattttc gacggtaaga ccctcaacca caagtatctg cgtcgcgcaa ctagggagca 3780

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atctacaatt cacggcattg tttctgagtc ggtaggcgag tcaactgtta gcctcgtgac 4260

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gagtaagaac tggaagcgcc tcgagcatct agttggacag cgcattcaag ccttggaccg 4680

tttggccact gaaggcctcg ccagcaaaat taaccgaaac atggcgtaca cgcttttcaa 4740

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tgccgcgccg gtagccaagg cgacagcccc ggcagttact caaccggctc ctgcagcagc 5280

tcaacaagcg cacgctatcg cgacgccttc ctctgctccg tccaatccgc ctgcggtcaa 5340

ctcggctccg gctccggcct ctacctcagc accagcagag aaggcggagc cagtaaacga 5400

ggagaatcct ctcattgcag gcgcgatcga tttaatcgtc aacgagacgg gtgttgacga 5460

gtcggaatta aaggatgaca caaccttcat gcagattggt gttgattctc tcatgtcgct 5520

ggttttggtg gaaaagttca agaacattct caagatggag attaagagct cactattcat 5580

tgagtgtgag actgtcggtg tcttcaagga atggctggaa gagaatcgat gagcagatga 5640

<210> 6

<211> 5649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgccttctt caagttcctg ggacagtatg gaggatgcaa agccttctgt cctctttttc 60

aacaacgatc tgcccagcga cgatatcaat caattatacc gtgttcttca ccgccgcact 120

gctcagttga gctgtcctca gcttgcccac ttcatcaggt tatgcaatca agtaatcaca 180

gaagagattg ccaaattgcc gaaacaatgg caagagaaag tccccgactt tgtcaatgtc 240

ttgagcttgg tcaatgacaa tgcttttcgc aaaggacctt tgggtggtgc tatggagggc 300

gttttcctca atattctcca gatcggcatg atcctcgggt aagtcaaact gatgtgtgta 360

atatgagttg accatctgct aacgacccaa agccaccatg aggtcgaaca ggtaccgtat 420

cagttcgacc caaagaccac aacacttttc ggtttaggag ttggcctact ttcagccgct 480

gctgcttccg tgtcccttaa tgttgcagat ctcgccattg ctggtgctca cattgtgcgc 540

gcttccttcc gactcggcat ccatgtgtac aacatctccg aacagctgga ggccccagat 600

gcggacggta acccctgggc cttcgtcatc cccggtttga ctgcagaggt cgtgcaggct 660

gagttagacc ggtacaatcg tgatacggtt agtctccacc ctcatcctca tgtcgacgtg 720

gcccaactaa tatcatcaag gccaacccga ctctgtcaca catcttcatc agtgcatccg 780

acaagacctc cgtatctgtc agcggccccc cctctcgtct gagacaatgt ctgaagagct 840

ctgatgttct ccgatactcc aacttcttgg cactacctgt gcatcatggc ctctgccacg 900

ctcctcacat atactccgct gtagatgtac agaccatcat cgaagatata ttagatgatg 960

atcatacacg gatagctggg ctgaaaactt ccttgcccct cttgtcttct agcactggcc 1020

gcccgtatcc ggcgaaagac ttccgcagct tgatcgacca ggtccttgcg gagcttctca 1080

tgaacaagat tcacatcgat aatgtcgttg atggtattgt agaatttctc gatctaccgt 1140

cggcaagtca acaggagcgg aatcttttcg ctttccgaaa ctccgtgatc ctgaggacga 1200

tgatgaagaa tgtggaaagt aaatgcgacg gtcgcatcac tttcacacat caagatctca 1260

tcgactggac gaaacgcgaa gagagcgaag ctgagacccc catctcgccc aagagatcca 1320

agctggccgt tgtcggcatg tcttgccgcc ttcccggtgg ggccaacgat ctagagctct 1380

tttggaagct catggccgag aagcgcgacg tacacacgac gattcctcct gatcggttcg 1440

acttgagcac ccacttcgat ccgactggtc aaatcgagaa taccacacag acaccataca 1500

tgaaccatat cgagagtccg ggcttgtttg atgctgggtt cttcaacatt ttcagaacat 1560

tgggacgtcg cctaaagagg taagacgaca acataccaac catcacgaaa tctaaagctg 1620

acattcttca taggcagaac agatggatcc tatgcatcgc cttgccctcg tcactgccta 1680

cgaagccctt gagatgtccg gatactctcc taaccggacg cgctccactt cctctcccag 1740

ggtcggaact tactatggcc aagcgagcga tgactggcgt gaactcaatg ccagtcagaa 1800

cattgggacg tacgctgtcc ccagtggcga gcgaggcttc gcgaacggac ggattaacta 1860

cttcttcaag ttcagtggac ccagctttaa catggatacc gcctgtttgt ctccccttaa 1920

gcattgataa tcccatgcta atcgactggt tcaggttcta gcggtcttgc cgctgtaaat 1980

gcagcatgct cagctttgtg ggctggagat gtagacactg ccattgcggg aggcttgaat 2040

gttatcaccg acccagacaa tttctgtcag ctcggaaagg gtcatttcct gtctcttacg 2100

ggtcaatgca aagtctggga tgaggctgct gatggctact gtcgtgccga cggagttggt 2160

agcgtagtca tcaaacgtct cgatgacgcc ttggccgaca acgacaagat tctcgcgaca 2220

atcttggcgg ctaacacgaa ccattcggct gacgcgatct caataaccca tccacatgcc 2280

ccgacgcagt ctctcaacta ccagagggtg atgtctcagg caggattctc gccgctagat 2340

gtgagctacg tcgagcttca tggaacgggc acccaggccg gagatcgcga agaagctaag 2400

tcggtctcgg acgtctttgc tcctgtagcc ccgcgacgca agaagaagga ccgactgaga 2460

ctgggtgctg tcaagtccaa cattgggcat ggagaggcgg ctgctggtat cgcttcgttt 2520

atcaaagtgt tgctcatgta ccagaagtct gccatcccgc cccagatcgg cgtcaagaag 2580

ctgaacccta cacttccaca ggatttggag gagcgcaaca tcggcctaaa ctgggaatac 2640

gccgagtggc caagaccgaa gactggatcg cgccttgcca tcgtgaacag ctttggtgcg 2700

cacggaggaa acacaacagt cctgttgagt gacgccccta tgcggtcacc tgttgtcacg 2760

gatcctcgca ccagcttccc aatttctgtc tccgcccgga gcaagaactc gctgaagatg 2820

aacaccgaag ccttgttgca gtatctcaac gaccacgagg atgcccagtt aggcgatctt 2880

tcctacactc tcactgcacg acgcatgcat cacccattcc gcctagctac gtctgtcaag 2940

gatatgtccc aggcgaagaa attcttgtct gcggagattg aaaagatgca acaacagcaa 3000

tgggtctcga cagtaccgtt gaaggcaccg acggttgctt tcgctttcac gggtcaagga 3060

gcgttctatg tcggtatggg ttcacagctc tacacacact gttccaactt ccgtgaagat 3120

gtccagcggc tcgatcgctt ggcacagtca ttcaatctag gttttgactc ggtcatacct 3180

gtcattgatg gctctgccgg ggacagtgac aaggtcgatc ccatagtatc gcaattggct 3240

atcgttctca ttgagcttgc tctttctcac tactgggcta cactcggaat caagccgtct 3300

atggttatgg gtcacagctt gggagagttc gctgcactgg cagtcgctgg tgtaatatct 3360

gagcttgatg ctctttatct cacggctgca cgggcaaagc ttatggctaa gcattgtcga 3420

gttggcactc acactatgtt ggctgtaaga tgtagcatcg atcgactgga ggagctattg 3480

gtaggccgcg aacaggacta cgagctcgct tgcatcaacg gcgaaagcga ccttgtcatc 3540

agtggagagc aaaccaagat tcaagacctc gcgaatatcc tagcgactgc aggcttgaaa 3600

tctacggcac tcaaggtgcc atatgctttc cattctgctc aaatggatcc aatcttggaa 3660

tcatttgctc aactagcgga gaacgtcacc ttcaaagctc cgcagatccc agtcatttcc 3720

cctctcctcg ccgaatgtat tttcgacggt aagacgatca accataagta tctgcgtcgc 3780

gcaactaggg agcaagtcga cgttgtgggc gccctagatg ctgcccaaga actcggtatt 3840

gctgacgcgg ataccgtctg gattgatatt ggtccccaca tgattgccgg aggtatggtc 3900

cgcaacttac tgaagccaac cactgtcgtc gcatcactca agcgcgatga ggacaacttc 3960

tccgcgcttg tctcgtcgct tgttactttg catcgcgccg gagtgtcggt cgtctggaac 4020

gaatacttcc gcgaacacga gcgcgctcat caagcattgc acttacctac ctaccgctgg 4080

aacgacaaga actattggat tccctacctc ggaacttgga ctcttgacaa agcgcatatc 4140

aaggagaacc tcgagaaggc aaagcaaaac gaggcattgt caggtatcag tggaatggga 4200

tccaagttga agacctctac aatccacggc atcgtttctg agtcggtagg cgagtcaact 4260

gttagcctag tgactttgtc ggacctgctt gatcccgcat tcctcgaagc tgtggacggc 4320

catcggatga acaatcatgg tgttgcatcg tcttctatct gggccgacat ggcctttacc 4380

gtgggtagat acctccatgg ccttggctac cccaaggaaa aggacttcca tatgaacctg 4440

cacgatatgg agatcctcca tgcacaggtt gctaggtccc gcaaggatgg cccccaattg 4500

atccaacttg aggcaactct cgacatacat gccaggagtg tggccatctt cttgtacaac 4560

gtgtccaagg acggcgtgcg ggacgctgaa cattatggct cttgcaaggt tcagttcgaa 4620

gatgcggcta cctggagtaa gaactggaag cggctcgagc atctggtcgg acagcgcatc 4680

caagccctgg accgttcggc tactgaaggc gtcgcgagta aaatcaaccg aaacatggcg 4740

tatacgcttt tcaagaacgt tgtcacctat gccgaccact accggggcat gcgctcggtt 4800

gtcctgaaag actacgaggc ttttgcagac gtcactcttc atcctgaaga acttggtttg 4860

tggcacactc caccacattg gattgacagt ctctgccacc taggaggctt cattctcaat 4920

ggctctgatg cttccaacac tgctgacttc ttttacgtca ctcctggatg ggagacgttc 4980

cgtcttgctc gcccaccgca ggcaggtggg agctatcgca gctatgtgca aatggtgcag 5040

agcgaagaag atccgaagtt ctggaccgga gacgtgtaca ttctccaagg tgatacaatc 5100

atcggtatga tgggtcagat gaagttccgg cagatcaacc ggatcttgat ggaccggttc 5160

ttctcgccta gcgagggcca cggcacagcc catgccagcg ccagcagtaa ggtgaagacg 5220

atcgctccag ctgttgccgc gcctgtagcc aagacaacaa ccccggcggt tactcaaccc 5280

gctcctgcag cagctcaaca aacgcacgct gtcgcgacgc cttcccctgc tccatccaac 5340

ctgcctgcgg tcaactccgc tccggctcct ccggtccctg tctcagcacc agcagacaag 5400

gcagaaccag aaaatgacga gaatcctctc attgcaggcg cgatcgattt gatcgtcaat 5460

gagacgggtg tcgacgcgtc ggaattgaag gatgatacaa ccttcatgca gattggtgtc 5520

gactctctca tgtcgttggt tttggtggag aagttcaaga acattctcaa gatggaaatc 5580

aagagctcgc tgttcattga atgtgagact gttggtgtct tcaaggagtg gctggaagag 5640

aaccgatga 5649

Claims

1.一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1或者其编码的蛋白在促进匍柄霉生产Altersolanol A和Fumigaclavine C中的应用，其特征在于，所述PKS1的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在所述匍柄霉中超表达所述PSK1基因，以提高所述Altersolanol A和Fumigaclavine C的产量。

3.一种利用匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1生产Altersolanol A和Fumigaclavine C的方法，其特征在于，包括将所述匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1在匍柄霉中超表达的过程；所述PKS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述匍柄霉包括番茄匍柄霉和囊状匍柄霉。

5.一种匍柄霉聚酮合成酶基因PKS1或者其编码的蛋白在防治马铃薯晚疫病中的应用，其特征在于，所述PKS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。