CN105505847A - 一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用 - Google Patents

一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用。本发明利用枯草芽孢杆菌PB2-LC1生产的抗菌物质[△C1]Plipastatin：来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PB2-LC1，是一系列线性抗菌脂肽类化合物的总称，共有7种组分，经过LC-FTICR-MS鉴定分子量，分别为：980、994、1008、1022、1036、1050和1064Da。该抗菌脂肽类化合物对大肠杆菌、藤黄微球菌、点青霉和桃软腐病菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害。

Description

一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用
技术领域
本发明属于微生物发酵产新型抗菌脂肽，涉及一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用。
背景技术
食品发酵工业、农业生产以及医药工业长期面临以下一些问题：食品的微生物污染，植物病虫害，日益严重的致病菌抗药性。传统的解决方法(化学防腐剂、化学农药、抗生素)虽然可以暂时缓解矛盾，然而随着检测技术的进步以及环保意识的提高，人们开始注意到上述化学药剂的潜在危害。开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然防腐剂已经成为当前食品、医药、植物抗病基因工程领域的研究和应用热点，将具有更广阔的发展空间。
基于科技的进步，检测手段的完善以及人类对生态环境意识的提高，低毒、高效、选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂的研究和开发日益引起国内外专家学者的关注。微生物是地球上分布最为广泛的一大类生物，它无处不在，是一个丰富的资源宝库。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物，以其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养等优势，倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产，而且微生物分泌的抗菌物质抑菌谱较宽，热稳定性较好，适用pH范围广，使用过程不易产生抗性菌和交叉拮抗性，因此可以发挥更大的工业应用价值。
Fengycin家族的脂肽类化合物是由含有十个氨基酸的肽链与β-羟基脂肪酸链(通常C14-C18)交联形成的内酯环状结构，具有专一的抗真菌活性。研究证明Fengycin合成酶由NRPSsFen1-Fen5五个模块构成，分别由基因fenA-E编码。该复合酶由于分子量在十万至百万道尔顿之间，因此分离纯化有一定难度。此外，Steller纯化和鉴定了Plipastatin合成酶，其序列、结构和功能与fengycin合成酶十分相似。而且Plipastatin与fengycin合成酶基因开放阅读框序列高度同源，研究认为Plipastatin与fengycin为同一脂肽类物质
Plipastatin模块中都有A-,PCP-,andC-domains,modifyingdomains。通过这些模块和结构域的线性排列，合成出具有10个氨基酸和β-羟基脂肪酸链的环形抗菌脂肽。通过之前ClaudiaChiocchini(2006)的报道，NRPS系统中当COM即Linker结构域供体和受体不相容时，产物形成终止，通过COM结构域的交换实验，证实了COM结构域对NRPS中蛋白质与蛋白质之间的控制作用，去除COM结构域的选择障碍，可以合成不同的脂肽产品。
发明内容
本发明目的是针对上述技术问题提供利用温敏型质粒pKS2同源重组构建产抗菌脂肽[△C1]plipastatin的枯草芽孢杆菌PB2-LC1。
本发明另一个目的是提供新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin的发酵、分离纯化、结构鉴定以及生物活性检测的方法。
本发明的目的通过下列技术方案实现：
一株产抗菌脂肽[△C1]plipastatin的枯草芽孢杆菌PB2-LC1，该菌株通过以下步骤构建得到：
(1)PMD-19T-△C1重组质粒构建：以保藏编号为CGMCCNO.11723的枯草芽孢杆菌PB2-L基因组DNA为模板，以SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.3所示的3′ppsC-D-△C1–SOE-R为引物进行PlipastatinC和D亚基基因的上游同源臂PCR扩增；以SEQIDNO.4所示的5′ppsC-D-△C1–SOE-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R为引物进行下游同源臂PCR扩增；取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进行PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R，获得融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段；将上述获得的融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段与PMD-19T载体链接，连接产物转化EscherichiacoliDH5α，挑取单菌落，接种于含终浓度为100mg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，菌液经PCR扩增，筛选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，以及测序，得到含有PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂的PMD-19T-△C1质粒；
(2)将温敏型质粒pKS2和PMD-19T-△C1质粒分别用ClaI和KpnI双酶切，连接pKS2酶切后的大片段和PMD-19T-△C1质粒酶切后的小片段，连接产物转化EscherichiacoliDH5α，得到阳性转化子，成功构建融合质粒pKS2-△C1；
(3)将构建好的融合质粒pKS2-△C1转化保藏编号为CGMCCNO.11723的枯草芽孢杆菌PB2-L菌株，以SEQIDNO.6所示的5′PKS-1058-ERM-F和SEQIDNO.75′PKS-1058-ERM-R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方法整合到B.subtilisPB2-L菌株的基因组上获得产抗菌脂肽[△C1]plipastatin的枯草芽孢杆菌PB2-LC1。
本发明所述的枯草芽孢杆菌PB2-LC1在产抗菌脂肽[△C1]plipastatin中的应用。
利用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PB2-LC1菌株制备抗菌脂肽[△C1]plipastatin的方法，包括下列步骤：
a.将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PB2-LC1进行培养，得到抗菌物质发酵液；
b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，酸沉，将沉淀进行甲醇抽提，得抗菌提取物；
c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化[△C1]Plipastatin。
进一步，所述的方法优选包括下列步骤：
a.枯草芽孢杆菌PB2-LC1产[△C1]Plipastatin的发酵
将枯草芽孢杆菌PB2-LC1接种于试管斜面营养琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌PB2-LC1菌种接种于LB液体培养基，37℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌PB2-LC1种子液以3-5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在33℃和180rpm条件下培养72h，得到抗菌物质发酵液；
b.枯草芽孢杆菌PB2-LC1产[△C1]Plipastatin的分离
①取上述发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温过夜，5000r/min离心20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上低温搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为[△C1]Plipastatin粗提物；
②枯草芽孢杆菌PB2-LC1产抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC)：将[△C1]plipastatin提取物采用RP-C18柱(4.6mmФ×250mm)进行HPLC分离纯化[△C1]plipastatin；洗脱液为均含有1‰三氟乙酸的水(A)和乙腈(B)溶液(三氟乙酸和乙腈为MERK公司产品)，梯度洗脱条件为：0～10min，B5％；10～60min，B95％；流速为0.80ml/min；检测波长为214nm；[△C1]Plipastatin的HPLC洗脱保留时间分别约为31～35min；
c.枯草芽孢杆菌PB2-LC1产抗菌物质的鉴定
枯草芽孢杆菌PB2-LC1抗菌提取物经HPLC分离后，各抗菌组分再利用电喷雾电离、诱导碰撞解离质谱(Electrosprayionizationmassspectrometry/collision-induceddissociation,ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。
所述的方法，其中步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENT1100series，配备DVD检测器。
所述的方法，采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪(LC-FTICR-MS)测定样品的分子量进行分析，液相色谱条件中流动相成分和比例与HPLC中的相同，梯度洗脱条件为：0-20min，B5-95％；20-22min，B95-100％，流速为0.2ml/min；电喷雾源操作电压为5kV，操作温度为300℃，操作压力为20abr。
本发明利用枯草芽孢杆菌PB2-LC1生产的抗菌物质[△C1]Plipastatin：来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PB2-LC1，是一系列线性抗菌脂肽类化合物的总称，共有7种组分，经过LC-FTICR-MS鉴定分子量，分别为：980、994、1008、1022、1036、1050和1064Da。
本发明的有益效果：
[△C1]Plipastatin是一类新型Plipastatin类抗菌脂肽的总称，对大肠杆菌、藤黄微球菌、点青霉和桃软腐病菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害。此种抗菌脂肽是通过人工定向改造，产生的新型抗菌脂肽，在世界范围内还没有报道。
本发明采用的B.subtilis是被美国环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，并在农业领域已得到广泛的应用。枯草芽孢杆菌PB2-LC1抗菌脂肽[△C1]Plipastatin抗菌脂肽属于人工改造微生物天然抗菌肽，对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。
附图说明
图1重组质粒上游和下游同源臂重叠PCR连接产物连接pMD-19T载体，重组质粒的PCR验证图。
图2B.subtilisPB2-LC1产[△C1]Plipastatin抗菌脂肽(图2a)以及Plipastatin标样的ESI-MS图(图2b)。
图3B.subtilisPB2-LC1产[△C1]Plipastatin抗菌脂肽m/z1008.5870作为前导子的图谱及其分子结构与离子碎片分析图。
图4B.subtilisPB2-LC1产[△C1]Plipastatin抗菌脂肽化学结构式(图4a)及Plipastatin抗菌脂肽化学结构(图4b)。
图5B.subtilisPB2-LC1产[△C1]Plipastatin抗菌脂肽的抑菌图谱；
1：菌株B.subtilisPB2-L提取物，2：菌株B.subtilisPB2-LC1提取物；A：点青霉(PenicilliumnotatumAS3.4356)，B：桃软腐病菌(RhizopusstoloniferAS3.2336)，C：大肠杆菌(EscherichiacoliAS1.487)，D：金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusAS1.2465)。
生物材料保藏信息：
PB2-L，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月23日，保藏编号为CGMCCNO.11723。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：以枯草芽孢杆菌B.subtilisPB2-L为出发菌株的产新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin菌株B.subtilisPB2-LC1的构建。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒
EscherichiacoliDH5α购于Invirtogen公司，B.subtilisPB2-L菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保存号：CGMCCNO.11723，温敏型质粒pKS2全序列如SEQIDNO.1所示，源于以下参考文献：杨慧林,王坤,等.解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及缺陷株生长特性[J].华南理工大学学报,2012,40,95-100。
1.1.2主要试剂和仪器
限制性内切酶、T4DNA连接酶和PMD-19T载体购自TaKaRa公司；抗生素氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)和红霉素(Erm)购自北京普博欣生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和pfu高保真PCR酶购自生工(上海)生物科技有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自生工(上海)生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯.
1.1.3培养基及培养条件
LB培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，补水至1L；种子液体培养基：牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaC15.0g，葡萄糖10.0g，pH7.0，补水至1L。基础发酵培养基：葡萄糖40.0g，L-谷氨酸钠14.0g，MgSO40.5g，KCl0.5g，KH2PO41.0g，FeS04·7H2O0.15mg，MnSO45.0mg，CuS04·5H2O0.16mg，pH7.0，补水至1L。葡萄糖分别灭菌。大肠杆菌用LB培养基培养，除含有温敏型质粒的大肠杆菌要置于30℃下培养外，其它均于37℃下培养.
1.1.4引物
针对NCBI上关于PlipastatinC和D亚基公布的基因序列，利用PrimerPremier5软件进行引物设计，设计引物如下：
1.2方法
1.2.1B.subtilisPB2-L菌株总DNA的提取
用生工(上海)生物公司细菌基因组提取试剂盒提取。
1.2.2PMD-19T-△C1重组质粒的构建
以B.subtilisPB2-L基因组DNA为模板，以SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.3所示的3′ppsC-D-△C1–SOE-R为引物进行PlipastatinC和D亚基基因的上游同源臂PCR扩增；以SEQIDNO.4所示的5′ppsC-D-△C1–SOE-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R为引物进行下游同源臂PCR扩增，PCR扩增条件为：50μL体系，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，将获得的基因片段进行凝胶回收；取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进行PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R，获得融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段；将上述获得的融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段与PMD-19T载体链接，连接产物转化EscherichiacoliDH5α，挑取单菌落，接种于含终浓度为100mg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，菌液经PCR扩增，筛选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，以及测序，得到含有PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂的PMD-19T-△C1质粒；
1.2.3温敏型质粒pKS2重组载体的制备
将温敏型质粒pKS2用ClaI和KpnI双酶切，ClaI和KpnI双酶切PMD-19T-△C1质粒，用胶回收试剂盒纯化，以T4DNA连接酶连接，转化EscherichiacoliDH5α，得到阳性转化子，成功构建融合质粒pKS2-△C1。
1.2.4目的菌株的获得
将构建好的融合质粒pKS2-△C1转化B.subtilisPB2-L菌株，通过同源重组的方法整合到B.subtilisPB2-L菌株的基因组上，转化方法参照以下文献记载Zakataeva,NataliaPNikitina,OksanaVet.al.Asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationsintothechromosomeofnaturallynontransformableBacillusamyloliquefaciensstrains[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology.2010,85,1201-1209，以SEQIDNO.6所示的5′PKS-1058-ERM-F和SEQIDNO.7所示的5′PKS-1058-ERM-R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方法得到新的菌株B.subtilisPB2-LC1。
实施例2
1本发明枯草芽孢杆菌PB2-LC1产[△C1]Plipastatin的发酵和分离鉴定方法如下：
1.1产脂肽的发酵培养
将试管斜面B.subtilisPB2-LC1菌种接种于装有种子培养基(营养琼脂培养基去除琼脂)的三角瓶中，37℃、130-150r/min下培养24h，至对数生长期，制成浓度为108-109CFU/L的种子液。将上述制备的B.subtilisPB2-LC1种子液以3-5％浓度接种于Landy发酵培养基中，于33℃、180r/min下培养72h，得抗菌物质发酵液。
取上述制备的发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温过夜，5000r/min离心20min取沉淀用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上低温搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为含脂肽的提取物。
1.2产脂肽的高效液相色谱分析(HPLC)
[△C1]Plipastatin的高效液相色谱检测条件：色谱柱为AgilentC18柱，4.6mm×250mm×0.5μm；进样量20μL；柱温35℃；检测波长214nm；流速0.80ml/min；检测时间70min。溶剂：A相为含1‰三氟乙酸的纯净水，B相为含1‰三氟乙酸的乙腈；梯度变化条件如表1所示。HPLC结果显示：[△C1]Plipastatin的HPLC洗脱保留时间分别约为31～35min。
表1[△C1]Plipastatin检测时的流动相
1.3新型抗菌脂肽的LC-MS鉴定
液质联用(LC-MS)实验：质谱实验的基本原理是使所研究的物质形成离子，然后使所形成的离子按质荷比m/z(mass-chargeratio)进行分离。利用质谱与高效液相联用，可以定性、定量分析物质的组成。采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪(LC-FTICR-MS)测定样品的分子量，条件如下：
液相色谱条件
a)质谱柱：C18-MS-Ⅱ2.6mmФ×250mm，TSK；
b)柱温：25℃；
c)进样体积：5μl；
流动相为均含1‰三氟乙酸的水(A)和乙腈(B)，流速为0.2ml/min，梯度洗脱条件为：0-20min，B5-95％；20-22min，B95-100％，流速为0.2ml/min；
质谱条件
ESI离子源，采用正离子检测模式，喷雾电压3.5kV，毛细管温度275℃，鞘气(N2)流速35arb，辅助气(N2)流速10arb，扫尾气(N2)流速3arb，管状透镜：110V，碰撞能量35V，扫描范围：100～2000u，扫描方式：LTQ采用全扫描方式MS5扫描，且MS2采用数据相关扫描模式对m/z1008.5870进行碰撞，诱导解离(CID)全扫描，MS3～MS5则依次对上一级谱图中最强离子峰进行CID全扫描；FT采用全扫描方式MS2扫描，且MS2采用DataDependentScan模式对m/z1008.5870进行CID全扫描。
通过高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LC-FTICR-MS)的分析，可以确定通过敲除株B.subtilisPB2-LC1进行了新物质[△C1]Plipastatin的合成。[△C1]Plipastatin抗菌脂肽是一系列线性抗菌脂肽类化合物的总称，共有7种组分，分子量，分别为：980、994、1008、1022、1036、1050和1064Da(图2b)，其中一种[△C1]Plipastatin+[H+]的分子量为m/z1008.5870。原物质Plipastatin的结构图如图4b所示，通过二级MS鉴定，图3可以看到新物质[△C1]Plipastatin的断裂碎片，进而鉴定出新物质[△C1]Plipastatin的结构图(图4a)。1.4新型抗菌脂肽的抗菌谱鉴定
以点青霉(PenicilliumnotatumAS3.4356)，桃软腐病菌(RhizopusstoloniferAS3.2336)、大肠杆菌(EscherichiacoliAS1.487)和金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusAS1.2465)作为指示菌，将待测样品，用0.45μm细菌滤器过滤，采用牛津杯平板扩散法(双层营养琼脂：下层10ml，上层5ml)，在上层琼脂中混入0.2ml菌量为106浓度的指示菌，取滤液200μL加入牛津杯中，30℃培养48h，观察抑菌效果并记录抑菌圈直径大小，结果如图5所示，结果显示[△C1]Plipastatin对指示菌都具有抑菌活性。
由于B.subtilisPB2-LC1产[△C1]Plipastatin抗菌脂肽对多种食品和农作物病害菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱的特性，可开发成为新型的天然食品防腐剂及生防试剂，广泛应用于水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，对于延长食品保质期和减少农作物病虫害等具有十分重要的价值。

Claims (10)

1.一株产抗菌脂肽[△C1]plipastatin的枯草芽孢杆菌PB2-LC1，其特征在于该菌株通过以下步骤构建得到：
(1)PMD-19T-△C1重组质粒构建：以保藏编号为CGMCCNO.11723的枯草芽孢杆菌PB2-L基因组DNA为模板，以SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.3所示的3′ppsC-D-△C1–SOE-R为引物进行PlipastatinC和D亚基基因上游同源臂PCR扩增；以SEQIDNO.4所示的5′ppsC-D-△C1–SOE-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R为引物进行PlipastatinC和D亚基基因下游同源臂PCR扩增；取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进行PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQIDNO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQIDNO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R获得融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段；将上述获得的融合的PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂片段与PMD-19T载体链接，连接产物转化EscherichiacoliDH5α，挑取单菌落，接种于含终浓度为100mg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，菌液经PCR扩增，筛选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，以及测序，得到含有PlipastatinC和D亚基基因上游和下游同源臂的PMD-19T-△C1质粒；
(2)将温敏型质粒pKS2和PMD-19T-△C1质粒分别用ClaI和KpnI双酶切，连接pKS2酶切后的大片段和PMD-19T-△C1质粒酶切后的小片段，连接产物转化EscherichiacoliDH5α，得到阳性转化子，成功构建融合质粒pKS2-△C1；
(3)将构建好的融合质粒pKS2-△C1转化保藏编号为CGMCCNO.11723的枯草芽孢杆菌PB2-L菌株，以SEQIDNO.6所示的5′PKS-1058-ERM-F和SEQIDNO.75′PKS-1058-ERM-R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方法整合到枯草芽孢杆菌PB2-L菌株的基因组上获得产抗菌脂肽[△C1]plipastatin的枯草芽孢杆菌PB2-LC1。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PB2-LC1在产抗菌脂肽[△C1]plipastatin中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PB2-LC1制备抗菌脂肽[△C1]plipastatin的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将枯草芽孢杆菌PB2-LC1进行培养，得到抗菌物质发酵液；
b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，酸沉，将沉淀进行甲醇抽提并离心，离心所得上清液即为含抗菌脂肽[△C1]plipastatin的提取物；
c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化[△C1]plipastatin。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将枯草芽孢杆菌PB2-LC1进行培养，得到抗菌物质发酵液：
将枯草芽孢杆菌PB2-LC1接种于试管斜面营养琼脂培养基上活化；再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌PB2-LC1菌种接种于LB液体培养基，37℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌PB2-LC1种子液以3-5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在33℃和180rpm条件下培养72h，得到抗菌物质发酵液；
b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，酸沉，将沉淀进行甲醇抽提并离心，离心所得上清液即为含抗菌脂肽[△C1]plipastatin的提取物：
取上述发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温过夜，5000r/min离心20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上低温搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为[△C1]plipastatin提取物；
c.[△C1]plipastatin提取物通过HPLC分离纯化[△C1]plipastatin：将[△C1]plipastatin提取物采用RP-C18柱进行HPLC分离纯化[△C1]plipastatin；洗脱液分别为含1‰三氟乙酸的水(A)和含1‰三氟乙酸的乙腈(B)溶液，梯度洗脱条件为：0～10min，B5％；10～60min，B95％；流速为0.80ml/min；检测波长为214nm；[△C1]plipastatin的HPLC洗脱保留时间为31～35min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于还包括：
d.枯草芽孢杆菌PB2-LC1产抗菌物质的鉴定
枯草芽孢杆菌PB2-LC1抗菌提取物经HPLC分离后，31～35min保留时间对应的HPLC分离物再利用电喷雾电离、诱导碰撞解离质谱测定其分子量和鉴定其结构。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪测定枯草芽孢杆菌PB2-LC1产抗菌物质的分子量，液相色谱条件中流动相成分和比例与权利要求4中HPLC相同，梯度洗脱条件为：0-20min，B5-95％；20-22min，B95-100％，流速为0.2ml/min；电喷雾源操作电压为5kV，操作温度为300℃，操作压力为20abr。
7.按照权利要求3～6中任一项所述的方法制备的抗菌脂肽[△C1]plipastatin，或含有该抗菌脂肽[△C1]plipastatin的提取物。
8.根据权利要求7所述的抗菌脂肽[△C1]plipastatin，其特征在于包含分子量为980、994、1008、1022、1036、1050和1064Da的7种线性抗菌脂肽类化合物。
9.权利要求7所述的抗菌脂肽[△C1]plipastatin，或含有该抗菌脂肽[△C1]plipastatin的提取物在生物防治、食品加工和/或农产品贮藏保鲜中的应用。
10.权利要求7所述的抗菌脂肽[△C1]plipastatin，或含有该抗菌脂肽[△C1]plipastatin的提取物在制备抑制革兰氏阳性细菌的制剂中的应用。
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