CN104480134A - 高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。本发明所提供的高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用中，构建重组利迪链霉菌的方法，包括将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到重组利迪链霉菌的步骤；血红蛋白是A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质，或A2)具有血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质：纳他霉素生物合成正调控因子为B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质，或B2)具有纳他霉素生物合成正调控因子功能的由B1)衍生的蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。
背景技术
随着世界人口的增多和耕地面积的下降，粮食供应日益严峻，然而农作物病虫害的常年发生给世界经济带来了巨大损失(陈军等，2010)。我国是以种植业为基础的农业大国，通过使用农药每年可减少经济损失达300亿元左右。其中，化学农药施用量占农药用量的80％以上，这造成严重的环境污染、农药残留等问题，严重威胁着人类的健康和生态环境。因此亟待开发新的、环境友好型的高效微生物农药。其中链霉菌由于次生代谢产物丰富而广泛应用于农业生物防治中，已经产生了巨大的经济效益、社会效益和生态效益，已成为近年病害生防领域的一大热点。
纳他霉素(natamycin)作为一种多烯大环内酯类抗生素，对几乎所有的酵母菌、霉菌具有抗性，是一种极具有潜力的广谱抗菌剂，能够显著抑制甘蓝枯萎病菌(F.oxysporum f.s.conglutinans)、小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)、番茄早疫病菌(Alternayia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、苹果轮斑病菌(A.mali)、辣椒灰霉病菌(B.cinerea)、茄子早疫病菌(A.solani)、桃褐腐病菌(M.fructicola)、李子褐腐病菌(M.fructicola)等病原菌的生长，并且不易产生抗药性，在防治植物真菌病害方面显示了良好的应用前景(te Welscher et al.,2008；Duet al.,2009；隋勤等，2007)。此外，natamycin作为食品防腐剂是我国批准使用仅有的2种食品生物防腐剂之一(另一个是乳酸链球菌素，Nisin)，还被应用于临床医疗，用于治疗真菌引起的皮肤和粘膜感染等(Davidson and Doan,1993；程良英，2010)。
目前报道的纳他霉素(natamycin)合成菌株有纳塔尔链霉菌(S.natalensis)、褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)、恰塔努加链霉菌(S.chattanoogensis)以及北京市农林科学院筛选得到的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02，国内外对于natamycin的生产研究主要集中在诱变育种、发酵工艺、提取工艺、分析检测等方面。目前通过基因工程改良得到纳他霉素(natamycin)高产突变株，产量在摇瓶发酵水平上最高仅达到2.14g/L左右，距离产业化生产纳他霉素较远。因此需要进一步选育纳他霉素高产菌株，为开发新型生防制剂提供保障。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何提高利迪链霉菌的那他霉素产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建高效生防重组利迪链霉菌的方法。
本发明所提供的构建高效生防重组利迪链霉菌的方法，包括将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中得到重组利迪链霉菌的步骤；
所述血红蛋白是如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.3中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有所述血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质；
所述纳他霉素生物合成正调控因子是如下B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.4中的一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且具有所述纳他霉素生物合成正调控因子功能的由B1)衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID No.3由146个氨基酸残基组成，SEQ ID No.4由192个氨基酸残基组成。
上述A2)和B2)中的蛋白质均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第789-1229位核苷酸或SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到；上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第7-585位核苷酸或SEQ ID No.2的第653-1231位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述血红蛋白的编码基因为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：
A11)编码序列为序列表中SEQ ID No.1的第789-1229位核苷酸或SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸的cDNA分子或基因组DNA；
A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因为下述B11)-B13)中的任一种DNA分子：
B11)编码序列为序列表中SEQ ID No.1的第7-585位核苷酸或SEQ ID No.2的第653-1231位核苷酸cDNA分子或基因组DNA；
B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述纳他霉素生物合成正调控因子的cDNA分子或基因组DNA；
B13)与B11)或B12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述纳他霉素生物合成正调控因子的cDNA分子或基因组DNA。
其中，SEQ ID No.1由1237个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1-6位核苷酸为NdeI的识别位点，SEQ ID No.1的第7-585位核苷酸为所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因，SEQ ID No.1的第586-591位核苷酸为Xba I的识别位点，SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸为红霉素抗性基因启动子，SEQ ID No.1的第789-1229位核苷酸为所述血红蛋白的编码基因，SEQ ID No.1的第1232-1237位核苷酸为EcoR I的识别位点。
SEQ ID No.2由1237个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1-6位核苷酸为Nde I的识别位点，SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸为所述血红蛋白的编码基因，SEQ ID No.2的第450-455位核苷酸为Xba I的识别位点，SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸为红霉素抗性基因启动子，SEQ ID No.2的第653-1231位核苷酸为所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因，SEQ ID No.2的第1232-1237位核苷酸为EcoR I的识别位点。
SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列相同；SEQID No.1和SEQ ID No.2中的血红蛋白编码基因的核苷酸序列相同；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的纳他霉素生物合成正调控因子编码基因的核苷酸序列相同。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。A13)中所述“75％以上的同一性”包括与本发明的编码血红蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高，或97％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。B13)中所述“75％以上的同一性”包括与本发明的编码纳他霉素生物合成正调控因子的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高，或97％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌为将包含所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因的表达载体(即血红蛋白基因和纳他霉素生物合成正调控因子基因共表达载体)导入所述利迪链霉菌。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述共表达载体中所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因均由红霉素抗性基因启动子启动；
所述红霉素抗性基因启动子为SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸或SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸所示的DNA分子。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述共表达载体中所述红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因可通过串联的方式存在于所述共表达载体中。
在本发明的实施例中，所述共表达载体的构建步骤包括下述M1)或M2)：
M1)用序列表中SEQ ID No.1的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段(即序列表中SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸替换pIB139中的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段，其它序列不变，得到含有纳他霉素生物合成正调控因子基因、红霉素抗性基因启动子、血红蛋白基因的重组载体，将该重组载体命名为pIB139-SlnM-vhb；该重组载体中，纳他霉素生物合成正调控因子基因的表达由pIB139载体骨架中红霉素抗性基因启动子启动，血红蛋白基因的表达由插入到pIB139载体Nde I和EcoR I识别位点间的SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸所示的红霉素抗性基因启动子启动；
M2)用序列表中SEQ ID No.2的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段(即序列表中SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸替换pIB139中的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段，其它序列不变，得到含有血红蛋白基因、红霉素抗性基因启动子、纳他霉素生物合成正调控因子基因的重组载体，将该重组载体命名为pIB139-vhb-SlnM；该重组载体中，血红蛋白基因的表达由pIB139载体骨架中红霉素抗性基因启动子启动，纳他霉素生物合成正调控因子基因的表达由插入到pIB139载体Nde I和EcoR I识别位点间的SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸所示的红霉素抗性基因启动子启动。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述共表达载体为a1或b1：
a1、从上游至下游的方向(即转录方向)含有红霉素抗性基因启动子、所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因、所述红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因的共表达载体；
b1、从上游至下游的方向(即转录方向)含有红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因、所述红霉素抗性基因启动子、所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因的共表达载体。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述a1具体可为含有核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的共表达载体，即所述pIB139-SlnM-vhb；
所述b1具体可为含有核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的共表达载体，即所述pIB139-vhb-SlnM。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤：将所述共表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得重组利迪链霉菌。
上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中，所述作为宿主菌的利迪链霉菌可为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654(CN 100467588C)；所述大肠杆菌可为去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了P1或P2或P3的产品：
P1、由上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法得到的重组利迪链霉菌；
P2、由上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法得到的重组利迪链霉菌的代谢物；
P3、上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法中的表达载体。
本发明提供的产品中的重组利迪链霉菌，为高效生防重组利迪链霉菌，具有较高的产那他霉素的能力。
上述产品中，所述重组利迪链霉菌可为重组利迪链霉菌甲或重组利迪链霉菌乙；所述重组利迪链霉菌甲可为含有SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的重组利迪链霉菌，也可为含有上述a1所述共表达载体的重组利迪链霉菌；所述重组利迪链霉菌乙可为含有SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的重组利迪链霉菌，也可为含有上述b1所述共表达载体的重组利迪链霉菌。
上述产品中，所述重组利迪链霉菌甲具体可为含有所述pIB139-SlnM-vhb的重组利迪链霉菌；所述重组利迪链霉菌乙具体可为含有所述pIB139-vhb-SlnM的重组利迪链霉菌。
上述产品中，所述重组利迪链霉菌甲具体可为菌株号为AMV02的重组利迪链霉菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9292；所述重组利迪链霉菌乙的菌株号为AVM02。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了C1或C2的组合物：
C1、由所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因组成的组合物；
C2、由所述血红蛋白和所述纳他霉素生物合成正调控因子组成的组合物。
本发明所要解决另一个的技术问题是如何提高利迪链霉菌对植物病原真菌的抗菌活性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：
1)上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在抑制植物病原真菌中的应用；
2)上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在制备植物病原真菌抑制剂中的应用；
3)上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在制备植物真菌病害抑制剂中的应用；
4)上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在抑制植物真菌病害中的应用；
5)上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在生产那他霉素中的应用。
上述应用中，5)所述的上述构建高效生防重组利迪链霉菌的方法、所述产品或所述组合物在生产那他霉素中的应用包括从所述重组利迪链霉菌的发酵液中得到那他霉素的步骤。
上述应用中，所述植物病原真菌为下述至少一种：甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)；
所述植物真菌病害为下述至少一种：由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)引起的病害。
实验证明，本申请的高效生防重组利迪链霉菌——利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AMV02 CGMCC No.9292和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02具有较高的产那他霉素的能力，二者之间产纳他霉素的能力没有显著差异，与利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654(CN 100467588C)相比，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02 CGMCC No.9292和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的纳他霉素产量均显著升高：在发酵72小时，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02 CGMCCNo.9292的纳他霉素产量约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的2.46倍，约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815的1.17倍，约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02 CGMCC No.6815的1.17倍，约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的1倍；利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AVM02的纳他霉素产量约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的2.47倍，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的纳他霉素产量约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815的1.18倍，约为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02 CGMCC No.6815的1.17倍。
本申请的高效生防重组利迪链霉菌——利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02 CGMCC No.9292和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的代谢产物均具有较高的抑菌活性，且二者之间的抑菌活性无显著差异,与利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815相比，利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AMV02 CGMCC No.9292和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的代谢产物均有较高的抑菌活性：利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02 CGMCCNo.9292的代谢产物对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的抑菌活性分别为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的2.50倍、2.16倍，为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815的1.4倍、1.4倍，为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的1倍、1倍；利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的代谢产物对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的抑菌活性分别为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的2.50倍、2.16倍，为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AM02 CGMCC No.6815的1.4倍、1.4倍。
本申请的高效生防重组利迪链霉菌——利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02 CGMCC No.9292和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02，增强了菌株自身产纳他霉素的能力，进而提高其抑菌能力，由于纳他霉素可以作为食品保鲜剂及饲料添加剂，因此，本发明的重组利迪链霉菌可以应用于食品、生物能源、饲料添加等方面。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)
生物材料的菌株编号：AMV02
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2014年6月12日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9292
附图说明
图1为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AVM02的纳他霉素产量。
图2为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02、利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AVM02和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02的抑菌活性。
其中，图A为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的抑菌圈，图B为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AMV02、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的抑菌圈。
图3为利迪链霉菌活性产物的HPLC第一次分离谱图。
图4为利迪链霉菌活性产物的HPLC第三次分离谱图。
图5为纳他霉素样品的紫外扫描图谱。
图6为纳他霉素样品的红外吸收光谱。
图7为纳他霉素样品的高分辨质谱图(负离子)。
图8为纳他霉素样品的高分辨质谱图(正离子)。
图9为纳他霉素样品的核磁共振碳谱(500MHz)。
图10为纳他霉素样品的核磁共振氢谱(500MHz)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的链霉菌表达载体pIB139(Christopher J.Wilkinson，et al.,Increasing the Efficiency of Heterologous Promoters in Actinomycetes,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2002)4(4):417–426.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)(Paget MSB,Chamberlin L,Atrih A,Foster SJ,Buttner MJ.Evidence that the extracytoplasmic functionsigma factor sigma(E)is required for normal cell wall structure inStreptomyces coelicolor A3(2).J Bacteriol.(1999)181:204–211)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的甘蓝枯萎病菌均为为甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)(隋勤,刘伟成,裘季燕,刘霆,潘争艳,刘学敏.利迪链霉菌A02的抑菌谱及其抑菌活性的稳定性.植物保护,2007,33(5)67-71.；卢彩鸽，刘伟成，刘霆，董丹，张涛涛，刘德文.利迪链霉菌A01活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理.中国农业科学2012,45(18):3764-3772.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的小麦纹枯病菌均为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)(隋勤,刘伟成,裘季燕,刘霆,潘争艳,刘学敏.利迪链霉菌A02的抑菌谱及其抑菌活性的稳定性.植物保护,2007,33(5)67-71；卢彩鸽，刘伟成，刘霆，董丹，张涛涛，刘德文.利迪链霉菌A01活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理.中国农业科学2012,45(18):3764-3772)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的A02均为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654(CN 100467588C)。
下述实施例中的AM02均为迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02 CGMCC No.6815(专利公开号为CN 103060364 A)。
下述实施例中的发酵培养基甲(YSG培养基)的配制方法为：分别将28g大豆粉、7g酵母提取物、60g葡萄糖，加蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌。
下述实施例中的发酵培养基乙的配制方法为：将黄豆滤液(将15g黄豆加蒸馏水煮沸0.5-1h，过滤，得到黄豆滤液)、5g蛋白胨、2.5g硫酸铵、10g蔗糖、10g淀粉、0.25g硫酸镁、0.2g磷酸二氢钾和5g氯化钠分别溶于蒸馏水，配成水溶液，将pH调至7-8后，再加入1g碳酸钙，而后加水定容至1000ml，121℃灭菌。
下述实施例中的高氏一号斜面培养基的配制方法为：分别将K2HPO4 0.5g、NaCl0.5g、KNO3 1.0g、FeSO4·7H2O 0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g、可溶性淀粉20g、琼脂20g溶于800mL蒸馏水，调pH至7.2-7.4，并用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌。
下述实施例中的种子培养基的配制方法为：将黄豆滤液(将15g黄豆加蒸馏水煮沸0.5-1h，过滤，得到黄豆滤液)、5g蛋白胨、2.5g硫酸铵、20g葡萄糖、10g淀粉、0.25g硫酸镁、0.2g磷酸二氢钾、5g氯化钠，分别溶于蒸馏水，配成水溶液，调pH至7-8后，再加入1g碳酸钙，而后加水定容至1000ml，121℃灭菌。
实施例1、构建重组利迪链霉菌
1、DNA片段的制备
合成核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的DNA片段。其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段，其名称为P-SlnM-vhb，该DNA片段从5’端至3’端依次为：Nde I的识别位点、纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因、Xba I的识别位点、红霉素抗性基因启动子、血红蛋白的编码基因和EcoR I的识别位点。SEQ ID No.1由1237个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1-6位核苷酸为Nde I的识别位点，SEQ ID No.1的第7-585位核苷酸为纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因，SEQ ID No.1的第586-591位核苷酸为Xba I的识别位点，SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸为红霉素抗性基因启动子，SEQ ID No.1的第789-1229位核苷酸为血红蛋白的编码基因，SEQ ID No.1的第1232-1237位核苷酸为EcoR I的识别位点。
合成核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA片段。其中，SEQ ID No.2所示的DNA片段，其名称为P-vhb-SlnM，该DNA片段从5’端至3’端依次为：Nde I的识别位点、血红蛋白的编码基因、Xba I的识别位点、红霉素抗性基因启动子、纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因和EcoR I的识别位点。SEQ ID No.2由1237个核苷酸组成，SEQ ID No.2的第1-6位核苷酸为Nde I的识别位点，SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸为血红蛋白的编码基因，SEQ ID No.2的第450-455位核苷酸为Xba I的识别位点，SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸为红霉素抗性基因启动子，SEQ ID No.2的第653-1231位核苷酸为纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因，SEQ ID No.2的第1232-1237位核苷酸为EcoR I的识别位点。
SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列相同；SEQID No.1和SEQ ID No.2中的血红蛋白编码基因的核苷酸序列相同；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的纳他霉素生物合成正调控因子编码基因的核苷酸序列相同。
2、重组载体的构建
用序列表中SEQ ID No.1的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段(即序列表中SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段)替换pIB139中的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段，pIB139的其它序列不变，得到含有纳他霉素生物合成正调控因子基因、红霉素抗性基因启动子、血红蛋白基因的重组载体，将该重组载体命名为pIB139-SlnM-vhb。pIB139-SlnM-vhb表达SEQ ID No.3的血红蛋白(名称为vhb)和SEQ ID No.4的纳他霉素生物合成正调控因子(名称为SlnM)。该重组载体pIB139-SlnM-vhb中，纳他霉素生物合成正调控因子基因的表达由pIB139载体骨架中红霉素抗性基因启动子启动，血红蛋白基因的表达由插入到pIB139载体Nde I和EcoR I识别位点间的SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸所示的红霉素抗性基因启动子启动。
用序列表中SEQ ID No.2的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段(即序列表中SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段)替换pIB139中的Nde I和EcoR I识别位点间的DNA片段，pIB139的其它序列不变，得到含有血红蛋白基因、红霉素抗性基因启动子、纳他霉素生物合成正调控因子基因的重组载体，将该重组载体命名为pIB139-vhb-SlnM。pIB139-vhb-SlnM表达SEQ ID No.3的血红蛋白(名称为vhb)和SEQ ID No.4的纳他霉素生物合成正调控因子(名称为SlnM)。该重组载体pIB139-vhb-SlnM中，血红蛋白基因的表达由pIB139载体骨架中红霉素抗性基因启动子启动，纳他霉素生物合成正调控因子基因的表达由插入到pIB139载体Nde I和EcoR I识别位点间的SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸所示的红霉素抗性基因启动子启动。
3、重组利迪链霉菌的构建
3.1重组大肠杆菌的构建
3.1.1将重组载体pIB139-SlnM-vhb通过热激法转化去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)并经过100μg/ml阿泊拉霉素抗性筛选,得到导入重组载体pIB139-SlnM-vhb的重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-SlnM-vhb。
3.1.2按照上述方法，将重组载体pIB139-SlnM-vhb替换为重组载体pIB139-vhb-SlnM，其他方法不变，得到导入重组载体pIB139-vhb-SlnM的重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-vhb-SlnM。
3.2两亲接合构建抗植物病原真菌的重组利迪链霉菌
3.2.1利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02的构建
参考文献(Bierman M et al.1992)进行两亲接合，具体方法如下：
(1)将重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-SlnM-vhb接种到含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，震荡培养过夜，次日早晨按1％的接种量接到新鲜LB培养基中培养至OD600＝0.4-0.6，收集菌液，于4℃、4000rpm下，离心2min，弃上清，用20mL冰冷的纯的LB液体培养基重悬沉淀，于4℃、4000rpm下，离心2min，弃上清，用2mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀，得到重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-SlnM-vhb菌液。
(2)将在PDA斜面生长2周的A02孢子用无菌双蒸水洗脱下来，并用加样器吹打均匀，得到孢子悬浮液。向250μL孢子悬液中加入500μL 2×YT培养液(请指明出售公司与货号)，轻轻混匀后，于50℃下热击10min，得到活化的利迪链霉菌孢子悬液。
(3)将上述500μL重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-SlnM-vhb菌液与500μL活化的利迪链霉菌孢子悬液轻轻混匀，并于4000rpm下，室温离心3min，去上清，将沉淀混匀后涂布于含10mM/L MgCl2的MS培养基上，28℃下倒置培养18h，之后在该平板上涂1000μL浓度为0.5mg/mL的萘啶酮酸和1μL浓度为100mg/mL的阿泊拉霉素。2-3天后挑取单菌落到新的含有1000μL浓度为0.5mg/mL的萘啶酮酸和1μL浓度为100mg/mL的阿泊拉霉素的MS平板上。挑取在该MS平板上的菌落进行PCR筛选，将得到的含有序列表中SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的重组菌命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AMV02。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AMV02已于2014年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9292，该菌在下文中简称为AMV02。
AMV02菌体的形态特征如下：革兰氏染色阳性；在不加蔗糖的YEME琼脂培养基(不加蔗糖的YEME琼脂培养基由水、麦芽抽提物、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖和琼脂组成，其中麦芽抽提物的含量为0.3g/100mL，蛋白胨的含量为0.5g/100mL，酵母粉的含量为0.3g/100mL，葡萄糖的含量为4g/100mL，琼脂的含量为1.5g/100mL)上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝柔曲或弯曲，孢子椭圆形。由于有血红蛋白合成，发酵液成红褐色。
3.2.2利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02的构建
按照上述3.2.1中的方法，将重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-SlnM-vhb替换为重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-vhb-SlnM，其他方法不变，得到含有序列表中SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的重组菌，将其命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AVM02，该菌在下文中简称为AVM02。
AVM02菌体的形态特征同AMV02菌体的形态特征。
4、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02的构建
构建利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02作为对照菌株，该菌株的构建方法如下：
将SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸(血红蛋白的编码序列)替换pIB139中的NdeI和XbaI识别位点间的DNA片段，其它序列不变，得到含有血红蛋白基因的重组载体，将该重组载体命名为pIB139-vhb。该重组载体pIB139-vhb中，血红蛋白基因的表达由pIB139载体骨架中红霉素抗性基因启动子启动。
按照步骤3.1.1的方法，将重组载体pIB139-vhb-glu替换为重组载体pIB139-vhb，其他方法不变，得到导入重组载体pIB139-vhb的重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-vhb。
按照步骤3.2.1的方法，将重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-vhb-glu替换为重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-vhb，其他方法不变，得到含有序列表中SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸所示的DNA片段(血红蛋白的编码序列)的重组菌，将其命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AV02，该菌在下文中简称为AV02。
实施例2、AMV02和AVM02产纳他霉素的能力
一、纳他霉素发酵液的制备
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将实施例1中的AMV02接种到高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2-3环接种于250ml三角瓶内的50ml种子培养基内，置可控温摇床上，在28℃、200rpm(旋转半径13mm)的条件下，恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其接种于60个500ml三角瓶内的发酵培养基甲(YSG培养基)内(每瓶装液量为100ml)，每瓶接种后OD600值均为0.1；接种后的摇瓶在31℃条件下，以240rpm(旋转半径13mm)的转速振荡培养0、24、48、72、96、120h，分别得到AMV02-0小时发酵液、AMV02-24小时发酵液、AMV02-48小时发酵液、AMV02-72小时发酵液、AMV02-96小时发酵液和AMV02-120小时发酵液。
按照上述方法，将实施例1中的AMV02分别替换为A02、实施例1中的AV02、AM02和实施例1中的AVM02，其他方法不变，分别得到A02-0小时发酵液、A02-24小时发酵液、A02-48小时发酵液、A02-72小时发酵液、A02-96小时发酵液、A02-120小时发酵液、AV02-0小时发酵液、AV02-24小时发酵液、AV02-48小时发酵液、AV02-72小时发酵液、AV02-96小时发酵液、AV02-120小时发酵液、AM02-0小时发酵液、AM02-24小时发酵液、AM02-48小时发酵液、AM02-72小时发酵液、AM02-96小时发酵液、AM02-120小时发酵液、AVM02-0小时发酵液、AVM02-24小时发酵液、AVM02-48小时发酵液、AVM02-72小时发酵液、AVM02-96小时发酵液和AVM02-120小时发酵液。
二、纳他霉素发酵液中纳他霉素产量分析
向1mL上述步骤1得到的AMV02-0小时发酵液中加入9mL甲醇,充分振荡后,进行30min超声波提取，而后于5000rpm下离心10-15min(沉降菌丝体及固形物)，弃沉淀，得到AMV02-0小时上清液，将AMV02-0小时上清液用甲醇稀释10倍并用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，得到AMV02-0小时待测液。
按照上述方法，将AMV02-0小时发酵液分别替换为AMV02-24小时发酵液、AMV02-48小时发酵液、AMV02-72小时发酵液、AMV02-96小时发酵液、AMV02-120小时发酵液、A02-0小时发酵液、A02-24小时发酵液、A02-48小时发酵液、A02-72小时发酵液、A02-96小时发酵液、A02-120小时发酵液、AV02-0小时发酵液、AV02-24小时发酵液、AV02-48小时发酵液、AV02-72小时发酵液、AV02-96小时发酵液、AV02-120小时发酵液、AM02-0小时发酵液、AM02-24小时发酵液、AM02-48小时发酵液、AM02-72小时发酵液、AM02-96小时发酵液、AM02-120小时发酵液、AVM02-0小时发酵液、AVM02-24小时发酵液、AVM02-48小时发酵液、AVM02-72小时发酵液、AVM02-96小时发酵液和AVM02-120小时发酵液，其他方法不变，分别得到AMV02-24小时待测液、AMV02-48小时待测液、AMV02-72小时待测液、AMV02-96小时待测液、AMV02-120小时待测液、A02-0小时待测液、A02-24小时待测液、A02-48小时待测液、A02-72小时待测液、A02-96小时待测液、A02-120小时待测液、AV02-0小时待测液、AV02-24小时待测液、AV02-48小时待测液、AV02-72小时待测液、AV02-96小时待测液、AV02-120小时待测液、AM02-0小时待测液、AM02-24小时待测液、AM02-48小时待测液、AM02-72小时待测液、AM02-96小时待测液、AM02-120小时待测液、AVM02-0小时待测液、AVM02-24小时待测液、AVM02-48小时待测液、AVM02-72小时待测液、AVM02-96小时待测液和AVM02-120小时待测液。
分别将上述AMV02-0小时待测液、AMV02-24小时待测液、AMV02-48小时待测液、AMV02-72小时待测液、AMV02-96小时待测液、AMV02-120小时待测液、A02-0小时待测液、A02-24小时待测液、A02-48小时待测液、A02-72小时待测液、A02-96小时待测液、A02-120小时待测液、AV02-0小时待测液、AV02-24小时待测液、AV02-48小时待测液、AV02-72小时待测液、AV02-96小时待测液、AV02-120小时待测液、AM02-0小时待测液、AM02-24小时待测液、AM02-48小时待测液、AM02-72小时待测液、AM02-96小时待测液、AM02-120小时待测液、AVM02-0小时待测液、AVM02-24小时待测液、AVM02-48小时待测液、AVM02-72小时待测液、AVM02-96小时待测液和AVM02-120小时待测液进行HPLC检测，以纳他霉素(sigma，P9703)为标准品，并根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)定量分析上述待测液中的纳他霉素含量。
HPLC检测的方法如下：色谱柱为C18柱(5μm，4.6mm×200mm)；检测波长为303nm；流动相为甲醇水溶液，甲醇水溶液的中甲醇与水的体积比为65∶35，流速为1.00mL/min；进样量为10μL；检测柱温为30℃。
实验结果表明，AVG02、A02、AV02、AG02和AGV02均在发酵72h时那他霉素产量最高，在发酵72小时，AMV02的纳他霉素产量为6.25g/L培养基，AVM02的纳他霉素产量为6.28g/L培养基，AV02的纳他霉素产量为5.36g/L培养基，AM02的纳他霉素产量为5.34g/L培养基，A02的纳他霉素产量为2.54g/L培养基，结果见图1。AMV02的纳他霉素产量为A02的2.46倍，为AV02的1.17倍，为AM02的1.17倍，约为AVM02的1倍，AVM02的纳他霉素产量约为A02的2.47倍，为AV02的1.17倍，为AM02的1.18倍。结果表明，AMV02的纳他霉素产量与AV02、AVM02没有显著差异；与AM02和A02相比，AMV02和AVM02的纳他霉素产量均显著升高。
三、纳他霉素发酵液中纳他霉素的鉴定
上述纳他霉素发酵液中纳他霉素的鉴定方法如下：
一)发酵液中纳他霉素的粗提
将上述利迪链霉菌的发酵液分别用3倍体积的无水乙醇预处理，4℃静置2h，以沉淀菌体、固形颗粒、可溶性粘胶状物、核酸和杂蛋白质以及中间代谢产物等，上清液用2层滤纸以布氏漏斗真空抽滤，滤液经旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，浓缩液即为纳他霉素粗提物，4℃保存备用。
二)、纳他霉素粗提物的分离纯化
通过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和高效液相色谱仪HPLC进行逐步分离纯化。
1、大孔树脂吸附柱层析
选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，X-5大孔树脂(天津南开大学化工厂)。大孔树脂按厂家说明预处理后用适量去离子水调匀，缓慢加入装有1/3体积去离子水的层析柱中，并从柱底部以匀速缓慢放出蒸馏水，使柱中液面始终保持在树脂层上面。装至约3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡后的装柱体积为150ml。
取纳他霉素粗提物与树脂按1﹕1的体积比进行动态吸附。洗脱过程为：2倍柱体积的无离子水洗脱除去部分色素和大量水溶性杂质；2倍柱体积的30％(体积百分含量)甲醇洗脱去色素；最后用2倍柱体积的70％(体积百分含量)乙醇洗脱活性成分。分管收集洗脱液，每管15ml，滤纸片法进行活性测定。
结果表明活性洗脱液集中在第48～56管(即自4.8倍柱体积至5.6倍柱体积之间的洗脱液)。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。
2、硅胶吸附柱层析
选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，100目～200目硅胶，以体积比为8﹕1﹕1的乙醇、氨水和水的混合液为洗脱液；取约150g硅胶用去离子水浸泡3h，倾去细小颗粒，布氏漏斗真空抽滤除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，真空抽干；用无水乙醇浸泡过夜，真空抽干；临用前在120℃下活化2h，干燥至恒重；层析柱中装入1/3柱体积的洗脱液，然后缓慢加入用洗脱液混合均匀的硅胶，约至3/4柱高时停止加入，静置6～10h，使硅胶缓慢沉降。然后用2～3倍体积的洗脱液以1mL/min的流速冲洗柱体，使之平衡。平衡后的柱体积为150ml。取步骤1的大孔树脂活性洗脱浓缩液10ml上柱进行动态吸附，用2～3倍柱体积的洗脱液按0.5ml/min的流速进行洗脱，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管5ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。结果表明：其洗脱液中的活性组分集中在第7～36管(即自0.23倍柱体积至1.2倍柱体积之间的洗脱液)。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。
3、制备型HPLC分离纯化
采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱。
取步骤2的硅胶柱层析后的活性洗脱浓缩液，用0.45μm微孔滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量6ml；以甲醇：水(体积比为7：3)为流动相进行分离，利用UV检测器在波长305nm处检测并自动形成分离图谱；利用馏分收集器分别收集图谱中各曲线峰所对应的洗脱液；以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。以2ml/min的泵流速进行第一次分离后，再以3ml/min的泵流速相继分离2次。
实验结果表明，第一次HPLC分离共检测到30个峰，其中保留时间为57.866min的强吸收峰为活性峰(图3)，其相对峰面积为35.121％；对其进行的第二次分离检测到6个峰，其中保留时间为41.699min的峰为活性峰，其相对峰面积为97.020％；第三次分离检测到保留时间为39.766min的峰为活性峰(图4)，通过峰面积计算其纯度为99.845％。
将第三次分离得到的活性峰样品进行真空浓缩，干燥后呈白色或奶油色粉末，该样品即为纳他霉素样品。利用岛津分析型HPLC采用下述方法对其进行纯度验证：取少量样品溶于70％甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：C18反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10μl，以1ml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下：
结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。
三)、纯化样品化学结构的解析鉴定
1、紫外吸收光谱(UV)
将上述步骤三纯化的纳他霉素样品极微量溶于超纯水中，用日立UV─VIS 3010紫外可见分光光度计在190nm～400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱。
由紫外扫描图谱可见，纳他霉素样品表现出典型的四烯类抗生素谱型，即在波长281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共轭四烯发色基团的吸收峰，其中波长305nm处吸收值最大，281nm处吸收值最小(图5)，说明该物质属于多烯类中的四烯抗生素。
2、红外吸收光谱(IR)
采用KBr压片法，用德国BRUKER公司TENSOR 27傅立叶红外光谱仪进行400cm-1-4000cm-1区域内扫描。
纳他霉素样品的红外光谱如图6所示，其中νmax 3416.78cm-1为-OH的特征吸收峰；νmax 3288.23cm-1为N-H的伸缩振动特征吸收峰；νmax 2940.44和2980.27cm-1是-CH3的特征吸收峰；νmax 3017.23cm-1是-CH2的特征吸收峰；νmax1715.38cm-1表现典型的羰基强吸收峰；νmax1571.44cm-1表现-C＝C-的强吸收峰；νmax 1634.40cm-1表现-C＝C-的弱吸收峰。
3、高分辨质谱
采用德国BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四级杆傅立叶串联质谱仪(9.4TQ-FT-MS)；条件：capillary 4000，Dry Gas：4.0 l/s，源温：180℃，scan range：300～2000，syringe pump：1.5ml/min，数据分析软件为Bruker DaltonicsDataAnalysis 3.4。
结果表明，纳他霉素样品进行分析的图谱中，采用正离子检测方式检测到加合离子[M+Na]+为m/z688.2937(图8)；采用负离子检测方式检测到准分子离子[M-H]+为m/z664.2975的化合物(图7)；采用正、负离子检测方式对纳他霉素样品进行检测分析，确定664.2975为分子离子峰。
综上所述，纳他霉素样品的主要活性组分的分子式均为C33H47NO13，分子量为665；由公式：不饱和度(n)＝1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc：碳原子数；Nn：氮原子数；Nh：氢原子数)计算其分子式的不饱和度为11，表明其分子结构中含有多个不饱和键与环等。
4、核磁共振谱(NMR)
以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，以四甲基硅烷(TMS)为内标，室温下测定。
采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振谱仪(德国Bruker光谱仪器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，进行氢谱(1HNMR)和碳谱(13CNMR)的测定；前者共振频率为500.1325156MHZ，采样次数32768次；后者共振频率125.7577612MHZ，采样次数为65536次。
实验结果表明，纳他霉素样品的核磁共振13C图谱(图9)中可以看出，分子中有一个羧基碳原子的化学位移(δ165.217)；一个羰基碳原子的化学位移(δ178.603)；一组共轭四烯碳原子的化学位移(δ125.089～145.447)；一组与羟基相连的碳原子的化学位移(δ66.102～70.326)；糖环上五个碳原子共振峰(δ71.194～97.894)；甲基碳原子共振峰(δ18.062，δ20.360)。500兆赫的核磁共振1H图谱(图10)中可以看出，多烯环上和四个双键相连的质子氢(-CH＝CH-)的化学位移(δ5.686～6.625ppm)；五个羟基中的质子氢的化学位移值(δ4.187～4.741ppm)；五个亚甲基和两个甲基中的质子氢的化学位移(δ1.274～2.439ppm)。
综合分析上述实验数据，纳他霉素样品的主要活性组分为纳他霉素，其化学结构式为：
实施例3、AMV02和AVM02的抑菌活性
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
1、植物真菌病害抑制剂的制备
将实施例1的AMV02接种到高氏一号斜面培养基上，于28℃下培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2－3环接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶内，在28℃、200rpm(旋转半径13mm)的条件下恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其分接于10个装液量为100ml的500ml三角瓶内的发酵培养基乙内，每瓶接种后OD600值都为0.1；接种后的摇瓶在31℃、240rpm(旋转半径13mm)的条件下振荡培养96h，得到AMV02发酵液，该发酵液中含有AMV02产生的高浓度的抑菌活性代谢产物。
将获得的AMV02发酵液于5000rpm下离心10-15min沉降菌丝体及固形物，弃沉淀，得到的上清液用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，于4℃贮存备用，该滤液即为AMV02植物真菌病害抑制剂样品。
按照上述方法，将实施例1的AMV02分别替换为AM02、A02和实施例1的AVM02，其他方法不变，分别得到AM02植物真菌病害抑制剂样品、A02植物真菌病害抑制剂样品和AVM02植物真菌病害抑制剂样品。
2、AMV02和AVM02的抑菌活性
供试靶标病原菌为甘蓝枯萎病菌和小麦纹枯病菌。
刮取PDA平板上培养产生的甘蓝枯萎病菌的分生孢子，用无菌水制成菌悬液，均匀地涂于新制备的PDA平板上，置超净工作台内吹干，得到甘蓝枯萎病菌PDA平板；用直径7mm的无菌打孔器在平板四周对称位置打孔，然后分别在每孔中注入AMV02植物真菌病害抑制剂样品、AM02植物真菌病害抑制剂样品、A02植物真菌病害抑制剂样品和AVM02植物真菌病害抑制剂样品各50μl，以未接种利迪链霉菌的甘蓝枯萎病菌PDA平板为对照，28℃下培养3天，十字交叉法测量抑菌圈的直径，结果见图2中B。
按照上述方法，将甘蓝枯萎病菌替换为小麦纹枯病菌，其他方法不变，得到AMV02植物真菌病害抑制剂样品、AM02植物真菌病害抑制剂样品、A02植物真菌病害抑制剂样品和AVM02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌的抑菌结果，结果见图2中A。
实验结果表明，A02植物真菌病害抑制剂样品和AMV02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌均产生明显的抑菌圈，AMV02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌圈直径分别为40.21±1.1mm和47.71±1.2mm，AVM02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌圈直径分别为41.36±1.2mm和47.37±1.2mm，AM02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌圈直径分别为27.68±1.2mm和29.12±1.2mm，A02植物真菌病害抑制剂样品对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌圈直径分别为14.2±1.2mm、16.1±1.4mm。AMV02对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌活性分别为A02的2.8倍、3.0倍，为AM02的1.5倍、1.6倍，为AVM02的1倍、1倍；AVM02对小麦纹枯病菌和甘蓝枯萎病菌的抑菌活性分别为A02的2.9倍、2.9倍，为AM02的1.5倍、1.6倍。
结果表明，AMV02的代谢产物的抑菌活性与AVM02的代谢产物的抑菌活性没有显著差异；与A02和AG02相比，AMV02和AVM02的代谢产物均对甘蓝枯萎病菌和小麦纹枯病菌有较高的抑制作用。
Claims (10)
1.构建重组利迪链霉菌的方法，包括将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中得到重组利迪链霉菌的步骤；
所述血红蛋白是如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.3中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质；
所述纳他霉素生物合成正调控因子是如下B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.4中的一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且具有纳他霉素生物合成正调控因子功能的由B1)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血红蛋白的编码基因为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：
A11)编码序列为序列表中SEQ ID No.1的第789-1229位核苷酸或SEQ ID No.2的第7-447位核苷酸的cDNA分子或基因组DNA；
A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因为下述B11)-B13)中的任一种DNA分子：
B11)编码序列为序列表中SEQ ID No.1的第7-585位核苷酸或SEQ ID No.2的第653-1231位核苷酸cDNA分子或基因组DNA；
B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述纳他霉素生物合成正调控因子的cDNA分子或基因组DNA；
B13)与B11)或B12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述纳他霉素生物合成正调控因子的cDNA分子或基因组DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌为将包含所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因的表达载体导入所述利迪链霉菌。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述表达载体中所述血红蛋白的编码基因和所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因均由红霉素抗性基因启动子启动；
所述红霉素抗性基因启动子为SEQ ID No.1的第598-788位核苷酸或SEQ ID No.2的第462-652位核苷酸所示的DNA分子；
所述表达载体为a1或b1：
a1、从上游至下游的方向含有红霉素抗性基因启动子、所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因、所述红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因的表达载体；
b1、从上游至下游的方向含有红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因、所述红霉素抗性基因启动子、所述纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述表达载体为a2或b2：
a2、含有核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的表达载体；
b2、含有核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2的第7-1231位核苷酸所示的DNA片段的表达载体。
6.P1或P2或P3的产品：
P1、由权利要求1-5中任一所述方法得到的重组利迪链霉菌；
P2、由权利要求1-5中任一所述方法得到的重组利迪链霉菌的代谢物；
P3、权利要求3-5中任一所述表达载体。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述重组利迪链霉菌的菌株号为AMV02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9292。
8.C1或C2的组合物：
C1、由权利要求1或2所述的血红蛋白的编码基因和权利要求1或2所述的纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因组成的组合物；
C2、由权利要求1或2所述的血红蛋白和权利要求1或2所述的纳他霉素生物合成正调控因子组成的组合物。
9.下述任一应用：
1)权利要求1-5中任一所述的方法、权利要求6或7所述的产品或权利要求8所述的组合物在抑制植物病原真菌中的应用；
2)权利要求1-5中任一所述的方法、权利要求6或7所述的产品或权利要求8所述的组合物在制备植物病原真菌抑制剂中的应用；
3)权利要求1-5中任一所述的方法、权利要求6或7所述的产品或权利要求8所述的组合物在制备植物真菌病害抑制剂中的应用；
4)权利要求1-5中任一所述的方法、权利要求6或7所述的产品或权利要求8所述的组合物在抑制植物真菌病害中的应用；
5)权利要求1-5中任一所述的方法、权利要求6或7所述的产品或权利要求8所述的组合物在生产那他霉素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物病原真菌为下述至少一种：甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)；
所述植物真菌病害为下述至少一种：由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)引起的病害。
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