CN108300677A - 一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂中的应用。白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC‑G‑5于2017年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO.60301。本发明的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC‑G‑5的发酵液能够制备tetramycins A(TMA)，如式(I)所示。本发明的代谢产物tetramycins A对导致食品腐烂的常见真菌具有强烈抑菌作用的，可作为一种潜在的生物防腐剂用于食品的防腐。

Description

一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂中的应用
技术领域：
本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂的应用。
背景技术：
食品在加工、运输、贮存的过程中不可避免的容易滋生各种微生物，主要可分为致腐微生物(霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌等)和致病微生物(单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等)，从而引起食品的安全问题。防腐剂作为食品配方中必不可少的组成成分，与人们的饮食健康密切相关。开发高效、安全、健康的天然防腐剂来代替如今广泛在食品中添加的传统化学合成类防腐剂(如苯甲酸钠、山梨酸钾)，是当今世界各国食品工业研究的重点方向，具有十分广阔的发展前景。
天然防腐剂，也称天然有机防腐剂，是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为食品防腐剂。根据其来源可分为：动物源防腐剂、植物源防腐剂和微生物源防腐剂。其中，微生物源防腐剂以其丰富的菌种资源，活性代谢产物易提取，更适于工业化大规模生产，经济成本容易控制，符合作为天然防腐剂高效、安全、健康的要求等一系列突出优点，成为未来食品工业中天然防腐剂发展最具前景的发展方向。
在微生物资源中，具有丰富的活性代谢菌株，尤其以放线菌为代表，是产生抗生素以及其它重要次级代谢产物最多的一类微生物资源，与人类的生产和生活具有密切的关系，已经在医疗、卫生、农业等领域得到广泛应用。近年来，拮抗性放线菌是国内外寻找高效安全食品生物防腐剂研究的热点。放线菌在土壤中分布广泛，大多数菌种可以产生抗菌活性物质，可以有效抑制有害细菌和真菌生长。广东地处我国大陆南方，土壤类型多样，濒临南海，海洋性气候特征比较显著，雨水、光热充足，是一个巨大的放线菌自然资源宝库。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5，该菌于2017年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO.60301。
白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5经过发酵后产生具有强烈的抗食源性腐败真菌活性代谢产物，该活性代谢产物经过分离纯化，通过高分辨质谱和核磁NMR确定为tetramycins A(TMA)，该活性代谢产物与目前已经广泛应用的食品防腐剂那他霉素同属四烯烃大环内脂化合物，对导致食品腐烂的各种真菌具有强烈抑菌作用的，可作为一种潜在的生物防腐剂用于食品的防腐保鲜。
因此，本发明的第二个目的是提供上述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5在制备微生物源防腐剂中的应用。
所述的微生物源防腐剂优选为抗食源性腐败真菌的微生物源防腐剂。
所述的食源性腐败真菌优选为黑曲霉、黄曲霉、桔青霉、蝇状青霉或高大毛霉。
本发明的第三个目的是提供上述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5在制备化合物tetramycins A中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种化合物tetramycins A的制备方法，所述的化合物tetramycins A是从上述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液中制备得到的。
具体包括以下步骤：
将白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液进行离心，获得发酵上清液，发酵上清液首先经D101大孔树脂柱层析，以乙醇-水为洗脱剂，从体积比10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10梯度洗脱，收集乙醇-水体积比50∶50、70∶30和90∶10洗脱的馏分，合并收集的馏分，再经Waters制备色谱，以水-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱的方法为：0-5min，体积分数50％甲醇水溶液；5-10min，体积分数60％甲醇水溶液；10-20min，体积分数70％甲醇水溶液；20-25min，体积分数90％甲醇水溶液；流速为15mL/min，紫外检测波长为304nm，收集保留时间为22.5min的分离组分，最后经高效液相色谱纯化后得到tetramycins A。
所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液是通过以下方法制备的：
将白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5接种于种子培养基中，发酵得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中，发酵得到发酵液，所述的种子培养基和发酵培养基均为：每升含有可溶性淀粉18g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g和琼脂20g，余量为水。
实验证明，本发明的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的无菌发酵液滤液中的抗菌活性物质tetramycins A(TMA)对食源性腐败微生物：黑曲霉、黄曲霉、桔青霉、高大毛霉和蝇状青霉都具有良好的抑菌作用，其最小抑菌浓度范围在1.50μg/mL到2.25μg/mL之间，与目前已经应用于食品防腐的微生物源防腐剂那他霉素相比较，其抗菌活性基本相当。此外，tetramycins A(TMA)与那他霉素同属四烯烃大环内酯化合物，其分子结构十分相似，导致其抗菌机理同样也一致。因此，白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5和用它制备的抗真菌化合物tetramycins A(TMA)具有潜在食品防腐功能。
本发明的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5于2017年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO.60301。
附图说明：
图1是白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5在高氏一号培养基上的培养情况。
图2是白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的扫描电镜观测情况。
图3是根据16S rDNA(如SEQ ID NO.1所示)建立的白色链霉菌(Streptomycesalbus)ZC-G-5分子进化树；其中Strain ZC-G-5即为白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5。
图4是白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5对食源性腐败微生物的抑菌效果；图中ZC-G-5为白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5，A为黑曲霉，B为桔青霉，C为蝇状青霉。
具体实施方式：
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实现本发明所采用的培养基如下所述：
1.白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的平板分离和斜面保存的高氏一号培养基：每升含有可溶性淀粉20g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g和琼脂20g，余量为水。
2.测定抑菌活性时，培养食源性腐败微生物：黑曲霉，采用PDA培养基：每升含有马铃薯200g、蔗糖10g和琼脂20g，余量为水，pH自然。
3.白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的种子培养基和发酵培养基：每升含有可溶性淀粉18g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g和琼脂20g，余量为水。
实施例1：白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的分离及鉴定
(1)菌株ZC-G-5的分离
菌株ZC-G-5，是从广州市白云山中采集的土壤样品中分离得到。具体方法如下：称取10g土壤样品，用100mL无菌生理盐水稀释成10-1g/mL的土壤悬液，再分别稀释成10-2、10-3、10-4、10-5g/mL等不同梯度土壤悬液，吸取各浓度稀释液0.1mL，在培养皿上涂布均匀，于28℃恒温培养箱中培养7d，挑取单菌落在平板上划线，纯化至可以进行下一步实验。采用琼脂块法，以黑曲霉、桔青霉、蝇状青霉等食源性腐败微生物为靶标指示菌，对不同分离菌株进行活性测定，通过测定透明圈的大小最终筛选出性状优良的活性菌株ZC-G-5。
(2)菌株ZC-G-5的形态特征
菌株ZC-G-5的营养菌丝体不断裂为杆状体，在高氏一号培养基上气生菌丝丰富，为浅灰褐色，且有小白斑(图1)。扫描电镜下观察菌株ZC-G-5，菌丝无横隔，不断裂；气丝上都有孢子形成；孢子浑圆至椭圆形，表面带细刺，孢子丝松敞长螺旋形(图2)。
(3)培养特性
菌株ZC-G-5在ISP系列培养基上生长良好，在不同培养基上的基内菌丝、气生菌丝、可溶性色素颜色如下表1所示。
表1菌株ZC-G-5的培养特性
注：ISP 1，蛋白胨酵母膏琼脂；ISP2，酵母膏-麦芽膏琼脂；ISP 3，燕麦琼脂
(4)生理生化特性
菌株ZC-G-5的生理生化特性如表2所示。
表2对比菌株ZC-G-5与相关近缘关系菌株的生理生化特性
注：-，阴性；+，阳性
(5)16S rDNA序列分析
菌株ZC-G-5的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。与GenBank中相关序列Blast进行比较，并建立相关分子进化树如图3所示。菌株ZC-G-5的16S rDNA的序列与目前发表的白色链霉菌的相关菌株的相似性达99.9％。
综合菌株ZC-G-5的形态学特性、培养特性、生理生化特性和16S rDNA序列分析的结果，将其鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albus)，命名为：白色链霉菌(Streptomycesalbus)ZC-G-5，于2017年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO.60301。
本发明的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5能够向培养基中产生大量的生物活性物质。利用琼脂块法试验表明其活性代谢产物对黑曲霉、桔青霉、蝇状青霉等食源性腐败微生物具有明显的抑制作用。其抑菌效果如图4所示。
实施例2：白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5菌种培养和抗食源性腐败真菌的生物防腐制剂样品制备
将白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5接种到上述高氏一号斜面培养基上，28℃培养7天，待其产生足够量的孢子，用接种环挑取接种于50mL的上述种子培养基置于250mL三角瓶中；在28℃，150rpm恒温振荡培养3天，得到种子液。在无菌环境下，以体积分数10％的接种量将种子液接种于发酵培养基中；在28℃，150rpm恒温振荡培养7天，得到发酵液。此时菌株已经在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物。
将以上步骤获得的发酵液6000rpm离心15min沉降菌丝体及固形物，收集发酵上清液(即无菌发酵滤液)。该白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的无菌发酵滤液即为抗食源性腐败真菌的生物防腐制剂样品，置于4℃贮存备用。
实施例3：白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5活性产物的分离及结构鉴定
采用实施例1制备的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5抗食源性腐败真菌的生物防腐制剂样品(无菌发酵滤液)，以黑曲霉为指示菌，进行活性追踪，无菌发酵滤液首先经D101大孔树脂柱层析，以乙醇-水为洗脱剂，从体积比10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10梯度洗脱，收集乙醇-水体积比50∶50、70∶30和90∶10洗脱的馏分，合并收集的馏分，再经Waters制备色谱，色谱柱的规格为：Waters C18column(19mm×100mm，5μm)，以水-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱的方法为：0-5min，体积分数50％甲醇水溶液；5-10min，体积分数60％甲醇水溶液；10-20min，体积分数70％甲醇水溶液；20-25min，体积分数90％甲醇水溶液；流速为15mL/min，紫外检测波长设置为304nm，收集保留时间为22.5min的分离组分，最后经半制备高效液相色谱(仪器：Shimadzu LC-20A，色谱柱：Waters C18 column(20mm×250mm，5μm))，以体积分数40％乙腈水溶液为流动相，流速为3mL/min，得到化合物A(tR＝12.5min)。通过高分辨质谱和NMR核磁测定(见表3)，确定化合物A为tetramycins A(TMA)，分子量为695.3533，淡黄色粉末，无固定熔沸点。分子结构如式(I)所示。
表3.化合物A的化学位移数据
注：1H-NMR和13C-NMR的数据(δinppm,J in Hz)分别在500MHz和125MHz被检测；所采用的溶剂为CD3OD
实施例4：菌株代谢产物抑菌活性测定
采用实施例2制备出的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的抗菌活性单体化合物tetramycins A(TMA)，以食源性腐败真菌：黑曲霉、黄曲霉、桔青霉、蝇状青霉和高大毛霉为靶标菌株；以目前常用的食品防腐剂：山梨酸钾和那他霉素作为对照组；对tetramycins A(TMA)进行最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)的测定。表4显示其结果。
表4.对比tetramycins A(TMA)和其他防腐剂的MIC和MFC
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 白色链霉菌ZC-G-5 (Streptomyces albus ZC-G-5)
<400> 1
accttcgacg attccctccc acaaggggtt gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt 60
cgtgacgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat 120
ctgcgattac tagcaactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga 180
gaccggcttt ttgagattcg ctccacctcg cggtatcgca gctcattgta ccggccattg 240
tagcacgtgt gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc 300
tccgagttga ccccggcagt ctcctgtgag tccccatcac cccgaaaggc atgctggcaa 360
cacagaacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
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gcggggaact taatgcgtta gctgcggcac ggacgacgtg gaatgtcgcc cacacctagt 660
tcccaacgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720
gctcctcagc gtcagtatcg gcccagagat ccgccttcgc caccggtgtt cctcctgata 780
tctgcgcatt tcaccgctac accaggaatt ccgatctccc ctaccgaact ctagcctgcc 840
cgtatcgaat gcagacccgg ggttaagccc cgggctttca catccgacgt gacaagccgc 900
ctacgagctc tttacgccca ataattccgg acaacgctcg cgccctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc ggcgcttctt ctgcaggtac cgtcactctc gcttcttccc 1020
tgctgaaaga ggtttacaac ccgaaggccg tcatccctca cgcggcgtcg ctgcatcagg 1080
ctttcgccca ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140
cagtcccagt gtggccggtc gccctctcag gccggctacc cgtcgtcgcc ttggtgagcc 1200
actacctcac caacaagctg ataggccgcg ggctcatcct tcaccgccgg agctttccac 1260
acggagatca tgcgaccccg tgtcatatcc ggtattagac cccgtttcca gggcttgtcc 1320
cagagtgaag ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat cccctcccga 1380
aggaggttca tcgttcgact gcatggtaag 1410

Claims (8)

1.白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5，保藏编号为：GDMCC NO.60301。
2.权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5在制备微生物源防腐剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的微生物源防腐剂为抗食源性腐败真菌的微生物源防腐剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的食源性腐败真菌为黑曲霉、黄曲霉、桔青霉、蝇状青霉或高大毛霉。
5.权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5在制备化合物tetramycinsA中的应用。
6.一种化合物tetramycinsA的制备方法，其特征在于，所述的化合物tetramycins A是从权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液中制备得到的。
7.根据权利要求6所述的化合物tetramycinsA的制备方法，其特征在于，所述的化合物tetramycinsA是从权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液中制备得到的，具体包括以下步骤：
将白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液进行离心，获得发酵上清液，发酵上清液首先经D101大孔树脂柱层析，以乙醇-水为洗脱剂，从体积比10∶90、30∶70、50∶50、70∶30和90∶10梯度洗脱，收集乙醇-水体积比50∶50、70∶30和90∶10洗脱的馏分，合并收集的馏分，再经Waters制备色谱，以水-甲醇为洗脱剂，梯度洗脱的方法为：0-5min，体积分数50％甲醇水溶液；5-10min，体积分数60％甲醇水溶液；10-20min，体积分数70％甲醇水溶液；20-25min，体积分数90％甲醇水溶液；流速为15mL/min，紫外检测波长为304nm，收集保留时间为22.5min的分离组分，最后经高效液相色谱纯化后得到tetramycinsA。
8.根据权利要求7所述的化合物tetramycinsA的制备方法，其特征在于，所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5的发酵液是通过以下方法制备的：
将白色链霉菌(Streptomyces albus)ZC-G-5接种于种子培养基中，发酵得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中，发酵得到发酵液，所述的种子培养基和发酵培养基均为：每升含有可溶性淀粉18g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g和琼脂20g，余量为水。
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