CN101153287A - 一种链霉菌抗菌产物及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种链霉菌抗菌产物及其生产方法，属于生物技术领域。用链霉菌GB－2种子扩大培养后，接种，28℃进行液体深层发酵144－168h，发酵液过滤，用正己烷和乙酸乙酯抽提二次除脂溶性杂质后，再用Millipore超滤膜截留分子量1000以内的生物分子，将滤出液经过1－2nm的纳滤膜，获得抗菌代谢产物。试验证明，抗菌物质对细菌、真菌具有广谱的抗菌活性，对多株致病菌和腐败菌有显著的抗菌活性，由于本发明提供的抗菌产物对多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，方法简便，成本低。在食品防腐剂、化妆品防腐剂、饲料添加剂及医药方面有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种链霉菌抗菌产物及其生产方法，属于生物技术领域。可用于食品防腐剂、化妆品防腐剂、饲料添加剂等。
二、技术背景
近年来，由于药物的滥用、药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，从而引发了人们对食品安全和用药安全的关注。寻找新型的更有效的抗菌物质刻不容缓，成为全世界的研究热点。
在过去的半个多世纪里，人们主要从寒带、温带、热带、火山口和冰川等不同环境的陆地以及不同地域所生长的动物及植物表面开发和获得新型的抗菌物质。但是，随着研究的不断深入和新型有效抗生素需要的迫切性增加，从陆地生物开发新的抗菌物质的机会大大减小，满足不了人们的需要，因此，科学工作者们将眼光投向占地球表面积3/4的资源丰富的海洋。
海洋环境是一个十分独特的生态环境，包罗了高盐、高压、低温(尤其是深海)、低光照、寡营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境，其中分布着数量极其庞大、种类繁多的微生物。最近美国科学家发现在一些地方，每平方英尺的海泥上能找到十多种尚未能认识的新生物。相对于陆地微生物而言，海洋微生物大部分都是适应了极端环境的极端微生物，它们能够耐受海洋特有的高盐、高压、低营养、低光照等极端条件，代谢途径不同于陆地微生物，可产生完全不同于陆地微生物的新颖生物活性物质。日本海洋生物技术研究所对海洋微生物进行广泛的研究，发现27％种属的海洋微生物具有抗菌活性。目前，已从海洋微生物及海洋动物的共生微生物的代谢产物中分离到许多新的生物活性物质，其中相当一部分是陆地生物所没有的。因此海洋生物资源为新活性物质的开发提供了可能，是一个十分巨大的有待深入开发的生物资源。世界各国和组织纷纷把研究开发的重点转向了前景更为广大的海洋微生物资源，这成为海洋生物技术开发的主要内容。
放线菌目及其相关的微生物是革兰氏阳性菌中形态发生最为多样化的组群，具有代谢多样性并能产生多种生物活性物质，这一特性在微生物界中少有匹敌。目前的天然抗生素大约有三分之二是来自放线菌，因此海洋放线菌是工业微生物中生理性状独特的新资源。在已有的报道中，链霉菌在已知的产抗菌物质的海洋微生物中占的比例最大，这和陆地微生物的情况相似。在防腐剂方面，目前我国食品添加剂标准(GB2760)允许使用的天然防腐剂仅乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种，其中Natamycin就来自于放线菌中的纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)，为多烯烃大环内酯化合物，是一种高效真菌抑制剂，能有效杀死霉菌、酵母菌和丝状真菌，但对细菌和病毒无效。在抗生素方面，土霉素、天神霉素、红霉素、泰乐霉素等多种应用多年的医用、农用、兽用抗生素都有从海洋放线菌中找到产生菌株的报道。找到新型抗菌物质的报道则更多。福建海洋研究所的方金瑞教授等从海洋耐盐嗜碱放线菌产生的抗菌物质中分离到一种新型的氨基糖苷类抗生素，称为丁酰苷菌素，它对许多细菌具有强的抑制作用。黄维真等分离到一株海洋放线菌——鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种(Streptomyces rutgersensis subsp.Gulangyunensis)，能够产生抗菌谱广毒性低的抗菌物质Minobiosamine和肌醇胺霉素等。这些研究表明海洋放线菌成为放线菌代谢产物的重要新来源。
三、发明内容
技术问题
本发明提供一种链霉菌抗菌产物及其生产方法，此抗菌物质具有作为食品防腐剂、化妆品防腐剂、饲料添加剂及药物的潜力。
技术方案
利用弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)GB-2产生的抗菌产物，是通过以下方法获得的：
1)链霉菌GB-2摇瓶种子液制备
取试管斜面链霉菌GB-2菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，28℃180rpm培养48-36h，至对数生长期，制成浓度为107-108cfu/L的摇瓶种子液；种子培养基配方：可溶性淀粉20.0g，黄豆粉15.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏2.5g，CaCO3 1.0g，人工海水1000mL，pH 7.5。
2)链霉菌GB-2种子罐种子液制备
取摇瓶种子液以体积比10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养。
3)链霉菌GB-2抗菌代谢产物发酵
将上述种子罐培养的种子液以体积比10％浓度接种于发酵培养基中，在28℃180rpm培养144-168小时，获得发酵液；发酵培养基配方与种子培养基配方相同。
4)抗菌代谢产物的获得
将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，分别用与发酵液相同体积的正己烷和乙酸乙酯以萃取法抽提二次除脂溶性杂质后，再用美国Millipore公司孔径为1KDa的中空纤维聚砜超滤膜截留分子量1000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即为获得的抗菌代谢产物。
有益效果
本发明的主要优点和积极效果如下：
1、本发明首次提供了一种对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌等致病菌和腐败菌具有广谱高效抑菌作用的链霉菌抗菌产物。
2.本发明提供的GB-2抗菌产物抑菌谱广。对多株致病菌和腐败菌有显著的抗菌活性，包括蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及6株耐药性金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等11株革兰氏阳性菌，大肠杆菌、荧光假单胞菌、普通变形杆菌、苍白杆菌等4株革兰氏阴性菌及啤酒酵母、米曲霉、扩展青霉、黄曲霉、烟霉、黑曲霉、桔青霉、白地霉、毛霉、少根根霉、扣类拟内孢霉、犁头霉、点青霉、番茄灰霉、黄色镰刀霉、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌等19株真菌。由于本发明提供的抗菌产物对多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的天然防腐剂或药品，具有重要应用价值。
3.本发明方法简便，成本低。
四、具体实施方式
本发明的链霉菌GB-2从连云港海域的海底泥中筛选获得，为公知公用菌株，于2006年3月21日在弗氏链霉菌变种Streptomyces fradiae GB-2，已于2006年3月21日在Genebank公开，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&val＝90971283(见网页拷贝附件)，南京农业大学食品科技学院实验室可对外提供。经鉴定属于弗氏链霉菌变种Streptomyces fradiae，主要生物学特性为革兰氏阳性菌，高氏一号合成琼脂培养菌落为气生菌丝紫红色或紫色，基内菌丝棕色，圆形或近圆形，不透明，表面粗糙，有时出现皱褶，无光泽，边缘不光滑，菌落分泌粉红色可溶性色素，且在不同培养基上气生菌丝、基内菌丝及可溶性色素颜色变化较大；孢子丝分枝多，为直线形、波曲形及2-5个螺旋的略松螺旋形态，孢子丝成熟后形成的孢子链成串珠状；孢子为椭圆形，表面光滑无刺，两面内凹，约(1.2～1.5)μm×(0.7～0.9)μm；细胞壁组成中含L，L-DAP及甘氨酸、天冬氨酸，无特征性糖(糖型C)，细胞壁化学组分属于I型；在20～45℃下pH3.62～10.53范围内生长，能耐受70g·L-1NaCl，能水解淀粉和纤维素，液化明胶，产生黑色素，不产生硫化氢，凝固和胨化牛奶，还原硝酸盐和亚硝酸盐，能利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、肌醇和甘油，不利用果糖、核糖、甘露醇、山梨醇、醋酸钠、丙酸钠、柠檬酸三钠及酒石酸钾钠。
本发明链霉菌GB-2产生的抗菌产物通过以下方法获得的。抗菌产物生产过程为：
3)链霉菌GB-2摇瓶种子液制备
取试管斜面链霉菌GB-2菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，28℃180rpm培养48-36h，至对数生长期，制成浓度为107-108cfu/L的摇瓶种子液；种子培养基配方：可溶性淀粉(购自上海国药集团，化学纯)20.0g，黄豆粉15.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏2.5g，CaCO3 1.0g，人工海水1000mL，pH 7.5。人工海水配方：NaCl 24.477g，Na2SO4 3.9170g，KCl 0.6640g，KBr 0.0960g，SrCl2 0.0240g，MgCl2·6H2O 4.9810g，CaCl2·H2O 1.1020g，NaHCO3 0.1920g，H3BO3 0.0260g，NaF 0.0039g，蒸馏水至1000mL，pH 7.5。
4)链霉菌GB-2种子罐种子液制备
取摇瓶种子液以10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养。
3)链霉菌GB-2抗菌代谢产物发酵
将上述种子罐培养的种子液以10％浓度接种于发酵培养基中，在28℃180rpm培养144-168小时，获得发酵液；发酵培养基配方与种子培养基配方相同。
4)抗菌代谢产物的获得
将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，用正己烷和乙酸乙酯除脂溶性杂质后，再用Millipore超滤膜截留分子量1000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即获得抗菌代谢产物。
链霉菌GB-2抗菌产物的抑菌试验
1.抑菌实验所采用的指示菌包括15种细菌：藤黄微球菌(Micrococcus luteusCMCC28001)，来源于医学微生物菌种保藏管理中心；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereusAS1.1846)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus AS1.2465)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis AS1.788)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AS1.140)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli AS1.487)、荧光假单胞菌(Pseudomouas fluorescens AS1.1802)，购自于中国普通微生物菌种保藏中心；
普通变形杆菌(Proteus vulzaris)、苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium DN2)，为本实验室保藏菌种(孙力军，陆兆新，别小妹等.1株抗菌植物内生菌EJH-2菌株的分离和鉴定[J].中国微生态学杂志，2006，18(1)：23-26)，可对外提供；
耐药性金黄色葡萄球菌(Durg-resistant Staphylococcus aureus，DRSA)187、DRSA563、DRSA 99330、DRSA 00019、DRSA 98062、DRSA 98064为南京农业大学动物医学院实验室分离保存，并对外提供(梁声强，张阳根，江先海.肺部感染细菌的分离培养及耐药情况分析[J].实用医技杂志，2006，13)。
抑菌实验所采用的指示菌包括19种真菌：
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AS2.114)、黑曲霉(Aspergillus niger AS3.350)、扩展青霉(Penicillium expansum AS3.3703)，购自于中国普通微生物菌种保藏中心；
烟霉(Aspetgillus fumigatus)、米曲霉(Aspergillus oryzae AS3.951)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、桔青霉(Penicillium citrinum AS3.3703)、点青霉(Penicilliumnotatum AS3.4356)、白地霉(Geotrichum candidum)、毛霉(Mucor sp.)、少根根霉(Rhizopus arrizus AS3.2670)、扣类拟内孢霉(Endomycopsis)、犁头霉(Absidiacarumbifera AS3.62)、番茄灰霉(Botrytis cinerea)、黄色镰刀霉(Fusarium culmorum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、香蕉炭疽病菌(Collectotrichum musae)、棉花枯萎病菌(Fusarium vasinfectum ACCC30224)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)，为本实验室保藏菌种(孙力军，陆兆新，别小妹等.1株抗菌植物内生菌EJH-2菌株的分离和鉴定[J].中国微生态学杂志，2006，18(1)：23-26)。
2.指示菌的培养基，细菌培养基采用营养琼脂培养基(MH)；真菌培养基培养采用马铃薯PDA培养基。
3.抑菌试验
实验方法参考CHAE GUN PHAE(Research Laboratory of Resources Utilization，Tokyo Institute of Technology.)发表的文献JOURAL of FERMENTATION ANDBIOENGINEERING Vol.69，No.11-7，1990。
3.1细菌：各指示菌活化(营养琼脂培养基)→制各种子液(肉膏蛋白胨培养基去琼脂)→用0.85％NaCI溶液稀释成不同梯度→涂平板并测定OD600.确定不同细菌最适涂布浓度(OD600为0.02-0.03左右适宜)→将不同指示菌0.1ml均匀涂于直径为9cm平板表面→晾干后，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再将抗菌产物加于牛津杯200μl(牛津杯直径5mm)或滤纸片100μl(滤纸片直径12mm)→37℃下培养16-24小时，记录抑菌圈直径大小。
3.2真菌：指示菌活化(PDA培养基)→用无菌0.85％NaCl溶液将孢子洗下，制成孢子悬液→稀释至最适涂布浓度(以指示菌生长布满平皿为宜)→吸取0.1ml涂平板→晾干后，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再将抗菌产物加于牛津杯(200μl)或滤纸片(100μl)→30℃下培养48-72小时，记录抑菌圈直径大小。
抑菌效果见表1和表2。抑菌试验结果证明：链霉菌GB-2抗菌产物对11种革兰氏阳性菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及6株耐药性金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)，和4种革兰氏阴性菌(大肠埃希氏杆菌、荧光假单胞菌、普通变形杆菌、苍白杆菌)，以及19种霉菌(啤酒酵母、米曲霉、扩展青霉、黄曲霉、烟霉、黑曲霉、桔青霉、白地霉、毛霉、少根根霉、扣类拟内孢霉、犁头霉、点青霉、番茄灰霉、黄色镰刀霉、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌)均具有显著的的抑菌效果。由于本发明提供的抗菌产物对多种有害细菌和霉菌具有明显抑制作用，表现出高效广谱特性，因此可以开发成为一种新型的天然防腐剂或药品，具有重要应用价值。
表1链霉菌GB-2抗菌产物对15种细菌的抑菌效果
| 指示菌 | 抑菌圈直径(mm) | |
| 革兰氏阳性菌 | 藤黄微球菌Micrococcus luteus CMCC28001a蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus AS1.1846b苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisc枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisc金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus AS1.2465b耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 187耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 563 | 45.75±1.2831.24±0.2932.77±0.2129.00±0.4126.53±0.5923.63±1.0634.62±2.41 |
| 革兰氏阴性菌 | 耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 99330耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 00019耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 98062耐药性金黄色葡萄球菌DRSA 98064大肠埃希氏杆菌Escherichia coli AS1.487b荧光假单胞菌Pseudomouas fluorescens AS1.1802b普通变形杆菌Proteus vulzarisc苍白杆菌Ochrobactrum intermedium DN2c | 24.79±1.6624.47±0.9724.50±0.5531.36±2.4729.56±0.3530.57±0.2033.48±0.3617.97±0.29 |
注：抑菌圈直径(mm)为3次重复平均值±标准差.
表2链霉菌GB-2提取物对19种真菌的抑菌效果
| 指示菌 | 抑菌圈直径(mm) |
| 啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS2.114b烟霉Aspergillus fumigatusc黑曲霉Aspergillus niger AS3.350b米曲霉Aspergillus oryzae AS3.951c黄曲霉Aspergillus flavusc桔青霉Penicillium citrinum AS3.3703c扩展青霉Penicillium expansum AS3.3703b点青霉Penicillium notatum AS3.4356c白地霉Geotrichum candidumc毛霉Mucor sp.c少根根霉Rhizopus arrizus AS3.2670c扣类拟内孢霉Endomycopsisc犁头霉Absodoa carumbifera AS3.62c番茄灰霉Botrytis cinereac黄色镰刀霉Fusarium culmorumc小麦赤霉病菌Fusarium graminearumc香蕉炭疽病菌Collectotrichum musaec棉花枯萎病菌Fusarium vasinfectum ACCC30224c稻瘟病菌Pyricularia griseac | 10.16±0.4713.60±0.6811.99±0.8317.73±1.0818.47±1.3112.62±0.3415.03±0.9219.79±0.7912.85±0.3211.27±0.6311.12±0.4611.97±0.539.11±0.4116.49±0.7617.56±1.1718.41±0.4619.42±1.1312.55±0.6419.22±1.01 |
注：抑菌圈直径(mm)为3次重复平均值±标准差
Claims (3)
1.利用弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)GB-2生产的抗菌产物。
2.权利要求1所述抗菌产物的生产方法，其特征在于：
1)链霉菌GB-2摇瓶种子液制备
取试管斜面链霉菌GB-2菌种接种于装有种子培养基的摇瓶中，28℃180rpm培养48-36h，至对数生长期，制成浓度为107-108cfu/L的摇瓶种子液；
种子培养基配方：可溶性淀粉20.0g，黄豆粉15.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏2.5g，CaCO31.0g，人工海水1000mL，pH7.5；
2)链霉菌GB-2种子罐种子液制备
取摇瓶种子液以体积比10％接种于种子罐中，培养至对数期，获得浓度为107-108cfu/L种子罐种子液，种子罐培养基、培养条件同摇瓶种子培养；
3)链霉菌GB-2抗菌代谢产物发酵
将上述种子罐培养的种子液以体积比10％浓度接种于发酵培养基中，在28℃180rpm培养144-168小时，获得发酵液；发酵培养基配方与种子培养基配方相同；
4)抗菌代谢产物的获得
将发酵液通过陶瓷微过滤除去菌体，分别用与发酵液相同体积的正已烷和乙酸乙酯以萃取法抽提二次除脂溶性杂质后，再用Millipore超滤膜截留分子量1000以内的生物分子，将滤出液经过1-2nm的纳滤膜，即为获得的抗菌代谢产物。
3.权利要求1所述抗菌产物在防腐剂及药物方面的应用。
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