CN103382450A - 广谱抗菌活性的链霉菌株t115及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明分离到一种新菌株：链霉菌（Streptomyces sp.）T115 CGMCC 7448，该菌为放线菌株，培养周期短，生长繁殖速度快，可以在短时间内产生广谱抗菌活性物质。经实验证实，对9种植物致病真菌均具有极强的抑制作用。本发明还提供利用该菌株发酵生产抗菌活性物质的方法，可在短时间内生产较高活力抗菌活性物质，发酵产物中的抗菌活性物质对热及光等具有极强的稳定性。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种新的具有广谱抗菌活性的链霉菌株，本发明还涉及该菌株及其发酵制品在生物农药及生物菌肥等方面的应用。
背景技术：
生物农药研究的一个重要方向是从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的新物质。随着环境保护、绿色食品及农业可持续发展的需要，农用抗生素作为低毒低残留的生物农药日益受到人们的重视。目前，从微生物中发现的大约22500种生物活性物质中近70%是由放线菌产生的。放线菌是抗生素的主要来源，己知抗生素的60%是放线菌产生的，其中主要集中在链霉菌属，如链霉素、金霉素、四环素、巴龙霉素、丝裂霉素等重要抗生素。
随着对土壤放线菌代谢特性的深入研究，以及分离和培养方法的进一步改进，越来越多的土壤放线菌将得到分离。链霉菌一直被认为是产生各种抗生素的主要来源。遗传多样性分析表明，链霉菌属可产生的抗生素约有上万种，而目前发现的只是很小一部分。
虽然放线菌最初应用在医药方面，但随着其对生态环境影响小、污染少而在农业方面得到了广泛的应用。许多研究证实放线菌在植物病虫草害的生物防治方面作用显著，具有很好的应用前景。
因此，发现新的抗菌活性菌株尤为重要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种新的具有广谱抗菌活性，特别是对植物致病菌具有极强抑制活性的链霉菌株；本发明的直接目的是提供一种新的链霉菌株。
本发明的另一个目的是提供一种方法，利用该新的链霉菌株生产抗菌活性物质。
本发明人从我国海南省某地区的土壤样品中分离到了一种新菌株：链霉菌（Streptomyces sp.）T115，该菌株属于放线菌株，该菌株已于2013年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7448。
本发明所述的链霉菌T115的形态特征和培养特征为：
菌落密集成褶皱，起初呈白色，后变为灰色，绒毛状，菌落背面为橙黄色。光学显微镜下菌丝呈垂直状，0.45-1.20μm宽，如图1；电镜下观察孢子丝呈链状直丝，孢子呈椭圆形，表面光滑，见图2。
将T115接种到鉴定培养基上培养10天后，观察发现在各种培养基上T115气生菌丝和基内菌丝均生长良好，且呈现不同颜色，在马铃薯块和燕麦粉琼脂培养基上均产生可溶性色素，分别呈浅芒果棕色和火岩棕色。如表2、图3所示。
提取此菌的DNA，以27F和1492R为引物，扩增16S rDNA的序列。该16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
将该序列进行Blast比较，与链霉菌属（Streptomyces sp.）菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明T115与Streptomyces vinaceusdrappus亲缘关系最近，如图4。
结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，参照《链霉菌鉴定手册》初步鉴定T115为链霉菌属中的灰红紫类群。
T115生长繁殖速度快，可以在短时间内（96h）培养出大量具有极强广谱抗菌活性的产生菌培养液。极大地节约了生产时间和能耗。利用该菌生产生物农药和生物菌肥可以极大地降低生产成本。
本发明所述的利用链霉菌T115生产抗菌活性物质的方法，是将链霉菌T115接种到筛选培养基中培养，得到含有抗菌活性代谢产物的培养液。
所述筛选培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。
其中，所述碳源选自下述化合物中一种或几种：燕麦粉、淀粉、黄豆饼粉、大米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖；
所述氮源选自下述化合物中一种或几种：酵母粉、蛋白胨、硝酸钾、酪蛋白、牛肉膏；
所述无机盐选自NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCO3；所述NaCl的终浓度为1.0g/L，K2HPO4的终浓度为1.0g/L，MgSO4的终浓度为0.5g/L，CaCO3的终浓度为3.0g/L。
所述水是无污染的清洁水，来源不限，如可为蒸馏水、自来水或井水等。
所述碳源优选是燕麦和大米粉，终含量分别优选：燕麦粉5g/L、大米粉5g/L。
所述氮源优选酵母粉，优选终浓度2g/L。
以上所述碳源、氮源和无机盐的用量均为在1L水中的含量。
所述链霉菌T115的接种量无特别限制，一般为105～107个孢子/mL筛选培养基。
所述培养温度是25～29℃，优选28℃。
所述培养方式是：可以150～260rpm的转速振荡培养2～5d，也可静置培养3-10d。
由链霉菌T115发酵上述筛选培养基得到的发酵制品也属于本产品的保护范围。
所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体形式。
本发明的链霉菌T115的优点如下：
1、对细菌、真菌都具有较强的抑菌活性，说明具有广谱抑菌活性（见实施例1）；
2、对9种植物病原真菌均具有极强的抑菌活性，抑菌率均在60%以上（见实施例2）；
3、生长繁殖迅速，合成抑菌活性物质的速度快，摇床培养96h即可达到高峰（见实施例3）；
4、抑菌活性物质对热、光具有极强的稳定性，便于以后的分离纯化、应用及储藏（见实施例3）。
因此，T115是理想的研究、改造应用的出发材料菌株。在抑制植物致病真菌，生产生物农药和生物菌肥等领域具有实现工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用和市场前景。
附图说明：
图1为链霉菌（Streptomyces sp.）T115的光学显微镜图；
图2为链霉菌（Streptomyces sp.）T115的电子显微镜图；
图3为链霉菌（Streptomyces sp.）T115在不同鉴定培养基上的菌落形态图，从左到右依次为在高氏Ⅰ号培养基、查氏培养基、马铃薯块、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、淀粉铵琼脂上培养10天后的菌落形态图；
图4为链霉菌（Streptomyces sp.）T115系统进化树图
图5为链霉菌（Streptomyces sp.）T115菌株抗菌活性物质的合成规律图，图中横座标为培养时间，纵座标抑菌圈面积。
图6～9为链霉菌（Streptomyces sp.）T115发酵液中抑菌活性物质的温度、pH、紫外和日光稳定性图。
生物材料保藏信息：
名称：链霉菌（Streptomyces sp.）T115
保藏编号：CGMCC No.7448
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
保藏时间：2013年4月10日。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。
除了实施例1中观察T115培养特征用的是鉴定培养基外，其余实施例中所提到培养基均为筛选培养基，所用的各种培养基配方具体如下：
1、筛选培养基：燕麦0.5%、大米粉0.5%、酵母粉0.2%、NaCl0.1%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.3%，自然pH，112℃灭菌20min备用。
2、鉴定培养基：
1)高氏Ⅰ号培养基：KNO31.0g、K2HPO40.5g、硫酸镁0.5g、NaCl0.5g、硫酸亚铁0.01g、可溶性淀粉20g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，121℃下灭菌30min。
2)查氏培养基Ⅰ号：蔗糖30.0g、NaNO32.0g、K2HPO41.0g、硫酸镁0.5g、KCl0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，112℃下灭菌30min。
3)马铃薯块：去皮马铃薯，削成斜面装入试管内，底部放一点棉花，加水使棉花湿润，然后将马铃薯块放在试管内的棉花上，121℃下灭菌30min。
4)葡萄糖酵母膏琼脂培养基：葡萄糖10g、酵母膏10g、琼脂15g、、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，112℃下灭菌30min。
5)燕麦粉琼脂培养基：燕麦粉20g、琼脂18g、痕量盐溶液1.0ml、琼脂18g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，121℃下灭菌30min。痕量盐溶液配方：硫酸亚铁0.1g、氯化锰0.1g、硫酸锌0.1g、蒸馏水100ml。燕麦粉在自来水中蒸或煮20min，四层滤布，蒸馏水补至1000ml。
6)淀粉铵琼脂培养基：可溶性淀粉10.0g、硫酸铵2.0g、K2HPO41.0g、硫酸镁1.0g、NaCl1.0g、碳酸钙3.0g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，121℃下灭菌30min。
3、PDA综合培养基：
马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂20g、水1000ml、pH自然。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10min，然后用四层纱布过滤得土豆营养液，添加其它成分，补足水至1000ml，112℃灭菌20min，混匀后铺平板或制作斜面培养基。
实施例1链霉菌（Streptomyces sp.）T115的分离、筛选及菌种鉴定
一、菌株分离纯化
1、链霉菌（Streptomyces sp.）T115的分离样品采自我国海南省某地区的土壤样品。将采集到的土壤样品120℃加热1h后，置于无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水打散均匀，取5ml悬液加入盛有50ml加入抑制剂（K2Cr2O775ug/ml及青霉素2ug/ml）的筛选培养基的三角瓶中，在28℃和150rpm下，振荡培养后7d，移取5ml培养液至另一盛有新鲜筛选培养基的三角瓶中培养3-5d。取富集后的培养液做一系列的稀释梯度，分别涂布筛选平板（筛选培养基+抑制剂），倒置28℃恒温培养，分离能够旺盛生长菌株。
2、将得到的纯菌种接种到斜面筛选培养基上，4℃保存。
二、广谱抗菌活性菌株筛选
取以上筛选菌株进行发酵培养，培养基为筛选培养基，每支试管装5ml，28℃、200rpm培养3d，过滤除菌。取发酵液，采用管碟法，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌（Escherichia coil）和根霉（Rhizopus)为指示菌进行抑菌活性分析。
结果表明T115具有广谱抑菌活性，对革兰氏阴性细菌大肠杆菌、革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和真菌根霉均具有极强的抑菌活性，见表1。
表1T115发酵液对三种指示菌的抑制作用
三、菌种鉴定
对筛选出的T115菌株的表型特征、培养特征和16S rDNA进行系统鉴定，结果如下：
表型特征
在筛选培养基上，菌落密集成褶皱，起初呈白色，后变为灰色，绒毛状，菌落背面为橙黄色。光学显微镜下菌丝呈垂直状，0.45-1.20μm宽，如图1；电镜下观察孢子丝呈链状直丝，孢子呈椭圆形，表面光滑，如图2。
培养特征
将T115接种到高氏Ⅰ号培养基、查氏培养基、马铃薯块、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、淀粉铵琼脂等鉴定培养基上培养10天后，观察发现在各种培养基上 T115气生菌丝和基内菌丝均生长良好，且呈现不同颜色，在马铃薯块和燕麦粉琼脂培养基上均产生可溶性色素，分别呈浅芒果棕色和火岩棕色。如表2、图3所示。
表2T115在不同培养基上的培养特征
提取T115的基因组，以27F和1492R为引物，扩增16S rDNA的序列，该16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
将该序列进行Blast比较，与链霉菌属（Streptomyces sp.）菌株的同源性最高，相似性均大于99％，系统进化树分析表明T115与Streptomyces vinaceusdrappus亲缘关系最近，见图4。
结合菌株形态观察、培养特性、及16S rDNA的鉴定结果，参照《链霉菌鉴定手册》初步鉴定T115为链霉菌属中的灰红紫类群。
实施例2T115对植物病源真菌的抑菌活性分析
方法：
T115接种到筛选培养基中，28℃、200rpm培养3d，取发酵液对9种病原真菌进行抑菌活性分析。采用生长速率法，取1ml发酵液与9ml融化的PDA培养基充分混匀，倒入无菌培养皿中制成平板。待培养基凝固后，在平板中央接入一直径为7mm的病原菌饼（带有菌丝的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加1ml蒸馏水的PDA平板为空白对照。培养至对照长到50cm左右时，十字交叉法测量菌落直径，并通过以下公式计算抑制率。
结果：
如表3所示：T115对这9种病原真菌均有很强的抑制效果，对菌丝生长的抑制率均在60%以上；其中，致病疫霉、辣椒疫霉和匍枝根霉在平板上几乎不生长，菌丝生长抑制率接近100%；和谷镰刀菌、核盘菌、茄链格孢、褐孢霉在平板上微弱生长，且生长非常缓慢，菌丝生长抑制率均达到80%以上；
表3T115发酵液对9种植物病原真菌的抑制作用
结论：
T115对植物病源真菌具有极强的抑制效果。
实施例3T115抑菌活性物质的稳定性分析
1、抑菌活性物质的代谢规律分析
方法：
采用摇瓶发酵培养法：孢子从斜面接种到装有20ml筛选培养基的100ml三角瓶中，于260rpm、28℃恒温振荡培养2d，得种子培养液；然后以4％的接种量接种于100ml筛选培养基中，相同条件进行发酵培养，发酵过程中，每12h取样1ml于1.5ml离心管中，10000rpm、离心20min，取上清液经微孔滤膜过滤后得发酵液，以枯草杆菌为指示菌，采用管碟法测抑菌活性。
结果：
T115的生长繁殖速度非常快，12h培养基就开始变浑浊；36h便可以检测到明显抑菌活性，抑菌活性呈先升后降的趋势，72h之前抑菌活性相对较低，72h之后便迅速增强，96h时抑菌活性达到峰值，之后随着发酵时间的延长，抑菌活性缓慢降低，见图5。
结论：
T115培养96h时抑菌活性达到峰值。
2、抑菌活性物质的热稳定性分析
方法：
按以上条件摇瓶培养T11596h后得发酵液，将所得发酵液于25、60、70、80、90、100℃分别水浴处理30min和60min，迅速冷却后，以枯草杆菌为指示菌，采用管碟法测抑菌活性。
结果：
T115发酵液中抑菌活性物质在70℃之前非常稳定，70℃之后随着处理温度的升高和处理时间的延长，抑菌活性迅速降低，见图6。
结论：
T115发酵液在70℃以下热稳定性良好，抑菌活性不受影响。
3、抑菌活性物质的酸碱稳定性分析
方法：
将T115发酵液用1mol/L HCl和1mol/L NaOH分别调pH为2、4、6、8、10、12，并于4℃放置24h，10000rpm下离心20min，再分别将各发酵液的pH慢慢调至原发酵液pH（即6.5），以枯草杆菌为指示菌，未经处理的发酵液为对照，采用管碟法测定抑菌活性。
结果：
T115发酵液抑菌活性在pH6-8的范围内非常稳定，抑菌圈面积几乎没有变化，在pH2和12时，抑菌活性明显降低，说明抑菌活性物质在及酸和及碱环境下不稳定，如图7。
结论：
T115发酵液抑菌活性在pH6-8的范围内非常稳定。
4、抑菌活性物质的光稳定性分析
方法：
将T115发酵液置于无菌培养皿中，将其放在距离20V紫外灯30cm的位置及日光下，每隔1h分别取1ml放入离心管中，以枯草杆菌为指示菌，未经处理的发酵液为对照，采用管碟法测抑菌活性。
结果与结论：
T115发酵液抑菌活性对紫外及日光具有很好的稳定性，随着照射时间的延长，抑菌活性几乎没有太大变化，见图8和9。非常适合产业化应用。
Claims (9)
1.链霉菌（Streptomyces sp.）T115CGMCC7448。
2.一种链霉菌，其特征在于菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.用权利要求1或2所述的链霉菌生产抗菌活性物质的用途。
4.一种生产抗菌活性物质的方法，将将权利要求1或2所述的链霉菌接种到筛选培养基中培养，得到抗菌活性物质。
5.权利要求4所述的方法，所述筛选培养基包括碳源、氮源、无机盐和水；所述碳源选自燕麦粉、淀粉、黄豆饼粉、大米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖中的一种或几种；所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硝酸钾、酪蛋白、牛肉膏中的一种或几种；所述无机盐选自NaCl、K2HPO4、MgSO4或CaCO3中的一种或几种。
6.权利要求5所述的方法，所述碳源是燕麦和大米粉，在筛选培养基中的终含量为燕麦粉5g/L、大米粉5g/L；所述氮源是酵母粉，在筛选培养基中的终含量为2g/L。
7.权利要求5所述的方法，在筛选培养基中所述无机盐的成分及终浓度是：NaCl1.0g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO40.5g/L和CaCO33.0g/L。
8.权利要求4所述的方法，所述链霉菌的接种量为105～107个孢子/mL筛选培养基，培养温度是25～29℃；培养方式是150～260rpm振荡培养2～5天或静置培养3～10天。
9.用权利要求1或2所述的链霉菌得到的发酵培养制品。
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