CN103966133A - 一株链霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株链霉菌及其应用。本发明公开的一株链霉菌，其保藏编号为CGMCC No.9034。本发明公开的一株链霉菌为植物内生菌，对多种植物病原真菌抑制作用强，在植物病害生物防治中具有很多优点，例如：数量众多；在植物体内外大量存在；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；在植物体内外定殖力强；促进植物的生长等，该菌尤其是对大豆菌核病和杨树溃疡病的防治具有重要意义。同时，该链霉菌的培养条件简单、容易保存、易于工业化生产,具有良好的开发应用前景。

Description

一株链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株链霉菌及其应用，特别涉及一株拮抗植物病原真菌的链霉菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

植物真菌病害是世界上粮食生产和生态系统稳定性的主要威胁，目前对其防治主要依赖于化学防治，然而大量使用化学农药会导致植物病原真菌对农药抗性增强，同时因使用不当或过度使用会对环境造成严重污染。越来越多的研究发现，利用具有植物生长促进和抑制植物病原真菌作用的有益微生物进行生物防治是一个可行的、环保的、经济有效的、化学防治的替代策略。许多植物促生细菌都能够从根皮层穿越内皮屏障进入到植物的各个组织中稳定存在，形成植物内生菌与植物长期稳定存在。植物内生菌在进行植物真菌病害防治时可以适应植物的内部环境，而不会影响微生物的平衡。植物内生菌可以产生抗生素、细胞壁降解酶来抑制植物病原真菌的生长，并诱导寄主植物的抗性。同时，很多内生菌还能够产生植物激素、铁载体、生物固氮作用和解磷作用来促进植物生长。

植物内生放线菌是一类重要的抗生素生产菌株，同时能够产生植物生长促进剂和信号分子来促进他们的宿主植物生长，增强抗逆能力。目前，虽然已从很多作物如小麦、大米、土豆、胡萝卜、西红柿和柑橘等植物中分离获得内生放线菌，研究了它们的生物防治效果，植物生长促进作用及与植物的相互作用。然而，从药用植物，尤其是羊角拗，这样一个特殊的生态位中分离获得具有生物防治潜力的内生放线菌在国内外尚未见报道。羊角拗能够产生多种糖苷类化合物，具有杀虫止痒、通经络、强心消肿等多种生理功能。由于羊角拗与其内生放线菌长期的共同进化，内生放线菌很有可能产生与宿主植物相关天然产物。因此，从药用植物羊角拗活性组织中分离筛选获得的对植物病原真菌有拮抗作用的生防菌株，对于病原真菌的防治具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一株链霉菌及其应用，该菌可以拮抗苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria),杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)，大豆菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum)，同时可以产生较强的几丁质酶活性，IAA产量高达31.56μg/ml，并且对大豆和番茄具有显著的生长促进作用，对大豆菌核病和杨树溃疡病具有显著的防治效果。

本发明提供一株链霉菌，其保藏编号为CGMCC No.9034。

上述链霉菌的培养液、发酵液或其发酵液的过滤液也属于本发明的保护范围。

含有上述链霉菌、其培养液、其发酵液和/或其发酵液的过滤液的产品也属于本发明的保护范围；

所述产品具体为生物菌剂。

上述链霉菌、上述培养液、发酵液或其发酵液的过滤液、上述产品在抑制植物病原真菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物病原真菌为苹果轮纹病病原菌、杨树溃疡病病原菌或大豆菌核病病原菌。

上述链霉菌、上述培养液、发酵液或其发酵液的过滤液、上述产品在促进植物生长中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物为大豆或番茄；

所述生长的指标是株高和/或干重。

上述链霉菌、上述培养液、发酵液或其发酵液的过滤液、上述产品在预防和/或治疗大豆菌核病病原菌引起的疾病或杨树溃疡病病原菌引起的疾病中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述大豆菌核病病原菌引起的疾病为大豆菌核病；所述杨树溃疡病病原菌引起的疾病为杨树溃疡病。

本发明提供的一株链霉菌为植物内生菌，对多种植物病原真菌抑制作用强，在植物病害生物防治中具有很多优点，例如：数量众多；在植物体内外大量存在；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；在植物体内外定殖力强；促进植物的生长等，该菌尤其是对大豆菌核病和杨树溃疡病的防治具有重要意义。同时，该链霉菌的培养条件简单、容易保存、易于工业化生产,具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为SSD49对杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)的拮抗作用及对杨树溃疡病的防治。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)在文献“Dui-shu L I,Jing-jiangH U.Inductive effect of oligosaccharides on Dothiorella gregaria resistancein Populus tomentosa[J].Journal of Northwest A&F University(Natural ScienceEdition),2013,3:013.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在文献“陈旭,顾飞飞,李洁,等.三种表型试验单用和联用鉴定金黄色葡萄球菌能力的评估[J].中华微生物学和免疫学杂志,2013,33(005):355-359.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

白假丝酵母(Candida albicans)在文献“王明永,王凡平,郭晓芳,等.MBL抑制白假丝酵母菌刺激THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-8[J].中华微生物学和免疫学杂志,2011,31(1):14-19.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)在文献“马健,刘振宇,吕全,等.不同抗性杨树接种溃疡病菌后过氧化氢及其氧化酶的表达差异[J].东北林业大学学报,2013,40(12):118-122.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

大豆菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum)在文献“张吉清,张学雷,肖炎农,等.黑龙江省大豆菌核病菌生长特性及菌丝体亲和型测定[J].中国油料作物学报,2013,35(3):307.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

实施例中的大豆和番茄种子购自中国农业科学院。

实施例1、拮抗内生菌SSD49的筛选及其鉴定

一、拮抗内生菌SSD49从羊角拗(采自海南儋州市植物园)中分离得到。具体步骤如下：

取药用植物羊角拗的根组织风干48h后，用5％次氯酸钠处理10min，2.5g/100ml硫代硫酸钠的水溶液浸洗10分钟，用体积百分含量75％的乙醇水溶液处理5分钟，无菌水冲洗数次，最后在10g/100ml碳酸氢钠的水溶液浸洗10min。将植物组织在无菌的条件下用无菌的剪刀剪成长×宽×高约为1cm×1cm×1cm的组织块，将组织块直接放置在分离培养基TWYE上培养，28℃恒温培养3-6周，挑取菌落形态不同的菌株，再次在TWYE平板上进行划线纯化培养，最终获得内生菌菌株SSD49。

菌株SSD49经鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，该菌株已于2014年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.9034。

二、拮抗内生菌SSD49的相关活性

(一)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中央接入新鲜的苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)或杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)的菌饼，在平板周边接上菌株SSD49，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养。7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小。结果如表1所示，该菌对苹果轮纹病和杨树溃疡病病原菌抑菌带宽分别达到1.2cm和0.9cm。

SSD49对杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)的拮抗作用如图1中a所示。

(二)以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、白假丝酵母(Candida albicans)和大豆菌核病病原菌(Sclerotiniasclerotiorum)作为指示菌对拮抗内生菌SSD49的广谱抑菌活性进行分析，结果如表1所示。

(三)对SSD49是否含有聚酮合成酶(PKSs,polyketide synthases)和多烯类化合物的聚酮合成酶(PPKSs,PKSs for polyene component)的编码基因进行检测。

PCR体系：二甲基亚砜1μl，2×GC buffer4μl，KSF(或DX1)0.4μl，KSR(或DX2)0.4μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，拮抗菌株的DNA模板1μl，无菌水9.5μl。

PCR引物分别如下：

KSF：5’-GARGCSCTSGARAYSGAYCCVC-3’；(SEQ ID No.1)

KSR：5’-CCGTTSGACGCRCCGTCCTGGTTSAC-3’。(SEQ ID No.2)

DX1：5’-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3’，(SEQ ID No.3)

DX2：5’-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3’。(SEQ ID No.4)

R＝A/G，S＝C/G，Y＝C/T，V＝G/A/C，W＝A/T

KSF和KSR为检测聚酮合成酶(PKSs)的引物，DX1和DX2为检测多烯类化合物的聚酮合成酶编码基因(PPKSs)的引物。

PCR程序：95℃5min；95℃45s，58℃(PKSs)或50℃(PPKSs)45s，72℃50s，循环30次；72℃10min。

检测结果如表1所示。

(四)将SSD49接种到几丁质培养基上，每个培养皿接种6株菌，置于28℃培养箱中恒温培养，一周后观察是否有透明圈的出现，若有则为产几丁质酶阳性菌株，测量其透明圈直径，计算单位菌落透明圈大小。

单位菌落透明圈的大小＝透明圈的直径/菌落直径

结果如表1所示，该菌的单位菌落透明圈大小达到1.3cm。

(五)比色法测定吲哚乙酸(IAA)产量

将SSD49在含0.5g/L的色氨酸的ISP1液体培养基(0.5g/100ml胰蛋白胨，3g/100ml酵母浸粉,余量为水)培养,120rpm28℃培养72h。5000g离心10分钟取上清加入等量Salkowshi试剂(含有4.5g/L FeCl₃的10.8mol/L H₂SO₄的水溶液),然后用分光光度计测量其在530nm的吸光度，实验重复三次，用比色法建立定量检测吲哚乙酸的标准曲线，根据SSD49培养液在530nm的吸光度计算吲哚乙酸(IAA)产量。

表1SSD49的相关活性检测

苹果轮纹病和杨树溃疡病抑制效果以抑菌带宽(病原菌与拮抗菌之间形成的抑菌带宽度)表示，单位cm；抑菌活性：-，无效果；+、++和+++分别表示抑菌活性弱、抑菌活性中等和抑菌活性强；PKSs/PPKSs：+表示有，-表示没有；几丁质酶活性用单位菌落透明圈大小表示(透明圈的直径/菌落直径，无单位)；Dg-苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria),Bd-杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea),Ss-大豆菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum),Ca-白假丝酵母(Candida albicans),Sa-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),Ec-大肠杆菌(Escherichia coli)。

综上所述，SSD49为一株广谱抑菌效果强的多功能拮抗菌，其对三种植物病原真菌(苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria),杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeriadothidea)，大豆菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum))均有很好的抑制效果，对苹果轮纹病和杨树溃疡病病原菌的抑菌带宽达到1.2cm和0.9cm。同时可以产生较强的几丁质酶活性，IAA产量高达31.56μg/ml。

三、拮抗菌株SSD49的鉴定

提取SSD49的基因组DNA，以其为模板，用通用引物27f和1492r为引物，进行PCR扩增，得到16S rRNA序列，将该序列测序，并将测序结果提交到http://www.ezbiocloud.net/eztaxon进行序列分析，序列比对结果表明SSD49属于链霉菌属。

27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID No.5)

1492r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(SEQ ID No.6)

实施例2、拮抗菌株SSD49对大豆和番茄的促生效果

将SSD49用ISP2培养基(酵母提取物0.4g/100ml，麦芽提取物1g/100ml，葡萄糖0.4g/100ml,余量为水)28℃培养一周后，用无菌水冲洗下平板上的孢子，血球计数板观察并计算孢子浓度，最后用无菌水稀释到10⁷cfu/ml。将大豆和番茄种子种到装有灭菌土的塑料盆中，待长出两片真叶后施加50ml的拮抗菌SSD49孢子液(10⁷cfu/ml)于根际土中，大豆每盆种2株，番茄每盆种3株，每种植物各5盆，作为实验组大豆和番茄，同时设置不施加拮抗菌SSD49孢子液用等体积的无菌水代替的同一批大豆和番茄作为对照组大豆和番茄，将各植株进行温室培养。

在温室培养60天后测定各组大豆和番茄的地上部分和地下部分的长度和干重，结果如表2所示。

地上部分：浇灌SSD49孢子液的实验组植株长势明显比对照组植株要好，对照组大豆和番茄平均株高为49.97cm和18.66cm，实验组大豆和番茄平均株高为65.08cm和22.05cm，分别提高了30.24％和18.17％；对照组大豆和番茄地上部分的干重分别为1017mg和606.8mg，实验组大豆和番茄地上部分的干重分别为1585mg和907.4mg，分别提高了55.85％和49.54％。

地下部分：对对照组和实验组的长势进行比较，经过SSD49孢子液浇灌后的实验组大豆和番茄苗的长势分别较对照组大豆和番茄有很明显的提高。浇灌SSD49孢子液的实验组大豆和番茄的地下部分的干重与对照组相比，也分别提高了126.06％和106.89％。

实验结果表明拮抗菌株SSD49对大豆和番茄的生长有促进作用。

表2拮抗菌株SSD49对大豆和番茄的促生效果

CK表示对照组，SSD49代表实验组，表中数值为平均值±标准差，p<0.05

实施例3、拮抗菌株SSD49对大豆菌核病的防治效果

选取饱满大豆种子，每盆播种2粒，待第4片真叶长出时后浇灌50ml拮抗菌SSD49孢子液(浓度为10⁷cfu/ml)(制备方法同实施例2)，作为实验组，同一批大豆浇灌无菌水50ml作为对照组，浇灌7天后各组大豆均接种大豆菌核病病原菌孢子悬浮液(大豆菌核病病原菌孢子悬浮液的制备：将大豆菌核病病原菌用PDA固体培养基28℃培养一周后，用无菌水冲洗下平板上的孢子，用血球计数板计算孢子浓度，最后用无菌水稀释到10⁷cfu/ml))50ml于苗茎基部，各组设置5盆平行。

分别在接种后7d和15d统计各组的大豆菌核病发病情况与病情指数并计算防治效果，结果如表3所示。

病情分级标准如下:

0级:全株无任何可见症状。

l级:前期叶腋处及侧枝轻度感病；后期主茎上病斑长度小于1cm。

2级:前期主茎及侧枝均生有菌丝并呈水浸状腐烂,后期主茎上病斑长度1-3cm,病斑处苍白。

3级:前期主茎和侧枝均生长大量菌丝,呈严重水浸状腐烂；后期病斑处苍白,主茎内外密生菌核,病斑长度3-5cm。

4级:前期严重感病,基本上达到枯死程度；后期主茎上病斑超过5cm,病茎内外密生菌核。

0、1、2、3、4为各级代表值。

病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)

防治效果(％)＝100×(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数

表3拮抗菌株SSD49对大豆菌核病的防治效果

CK表示对照组，SSD49代表实验组，表中数值为平均值±标准差，p<0.05。

表3表明，SSD49可以明显抑制大豆菌核病病原菌在大豆体内的生长，减轻伤口病症程度，对核盘菌的防治效果高达88.24％，生物防治效果显著。

实施例4、拮抗菌株SSD49对杨树溃疡病的防治效果

选取大小粗细相当的北京杨(Populus beijingensis)(在文献“马健,刘振宇,吕全,等.不同抗性杨树接种溃疡病菌后过氧化氢及其氧化酶的表达差异[J].东北林业大学学报,2013,40(12):118-122.”中公开过)二年生离体枝条做生物防治实验。

首先用体积百分含量为70％的酒精水溶液对其进行表面消毒，用灭过菌的打孔器在枝条上部三分之一的位置打下直径5mm树皮圆片，在伤口中加入20μl拮抗菌SSD49孢子液(浓度为10⁷cfu/ml)(制备方法同实施例2)，将已经染菌的树皮圆片(打下直径5mm的健康北京杨树皮平放在长满杨树溃疡病病原菌的PDA平板上培养3天即得)放入伤口，在伤口下面1cm的位置包上湿棉花，保证伤口处的湿度，在枝条最下面包上湿棉花，使其正常生长，作为实验组。将20μl无菌水代替拮抗菌SSD49孢子液进行上述实验，作为对照组。实验重复6次，结果如图1中b所示。

图1b中，CK代表对照组；SSD49代表实验组。

图1b表明，与杨树溃疡病发病严重的对照组相比，实验组的伤口并未形成溃烂而是长出许多愈伤组织，这可能与其能产生吲哚乙酸有关，SSD49可以明显减轻伤口溃烂程度，表明拮抗内生菌SSD49能有效防治杨树溃疡病。

Claims (9)

1.一株链霉菌，其保藏编号为CGMCC No.9034。

2.权利要求1所述的链霉菌的培养液、发酵液或发酵液的过滤液。

3.含有权利要求1所述的链霉菌、其培养液、其发酵液和/或其发酵液的过滤液的产品。

4.权利要求1所述的链霉菌、权利要求2所述的培养液、发酵液或发酵液的过滤液或权利要求3所述的产品在抑制植物病原真菌中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物病原真菌为苹果轮纹病病原菌、杨树溃疡病病原菌或大豆菌核病病原菌。

6.权利要求1所述的链霉菌、权利要求2所述的培养液、发酵液或发酵液的过滤液或权利要求3所述的产品在促进植物生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为大豆或番茄；

所述生长的指标是株高和/或干重。

8.权利要求1所述的链霉菌、权利要求2所述的培养液、发酵液或发酵液的过滤液或权利要求3所述的产品在预防和/或治疗大豆菌核病病原菌引起的疾病或杨树溃疡病病原菌引起的疾病中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述大豆菌核病病原菌引起的疾病为大豆菌核病；所述杨树溃疡病病原菌引起的疾病为杨树溃疡病。