CN104195085A

CN104195085A - 一株具有广谱抗菌活性的链霉菌及其应用

Info

Publication number: CN104195085A
Application number: CN201410446273.9A
Authority: CN
Inventors: 马玉超; 刘晓瑜; 窦桂铭
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-03
Also published as: CN104195085B

Abstract

本发明公开了一株具有广谱抗菌活性的链霉菌及其应用。本发明所提供的链霉菌具体为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9536。该链霉菌可以拮抗多种植物病原真菌和多种人体条件致病菌，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有很强拮抗效果，其发酵液能明显抑制MRSA的生长，并且发酵液中的抑菌成分对酸碱热的稳定性很强。同时，该链霉菌的培养条件简单、容易保存、易于工业化生产，预示了其在开发新型生物农药和抗生素等方面的潜在应用价值。

Description

一株具有广谱抗菌活性的链霉菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株具有广谱抗菌活性的链霉菌及其应用。

背景技术

抗生素具有巨大的经济价值和医学意义。研究表明，抗生素主要由放线菌产生，而其中90％又由链霉菌产生，常用的抗生素如链霉素、土霉素，抗肿瘤的博莱霉素、丝裂霉素，抗真菌的制霉菌素，抗结核的卡那霉素，能有效防治水稻纹枯的井冈霉素等，都是链霉菌的次生代谢产物。研究链霉菌的次生代谢产物可以发现和筛选出新的在医药、农业和工业上具有重要应用价值的抗生素。

植物内生链霉菌是一类重要的抗生素生产菌株，同时能够产生植物生长促进剂和信号分子来促进他们的宿主植物生长，增强抗逆能力。微生物定殖在植物体内与其长期协同进化，使得植物内生菌形成了不同于土壤微生物的代谢途径，产生大量的化学结构新颖、抑菌效果较好、或有特殊作用的生物活性物质。

抗生素被广泛用于人类和动物的疾病治疗，导致耐药病原菌株的增加。耐药菌感染已成为危害人类健康的严重问题，每年有超过25000的病人死于多重耐药细菌的感染，在医疗保健环境中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起血液感染、肺炎和手术部位感染的主要原因，其通过各种机制对传统的β-内酰胺类大环内酯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素均表现高度耐药性，从而导致增加死亡率和住院费用。MRSA具有传播途径广、致病性强、多重耐药的特点，在临床治疗上十分棘手，所以受到普遍重视。随着耐药菌株的逐渐增多及其耐药性的不断增强，现有抗生素的临床治疗效果受到了严重的限制，寻找和开发新型抗生素资源势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌活性的链霉菌及其应用。

本发明所提供的链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1，该菌株已于2014年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9536。

本发明的另一个目的是提供一种菌剂。

本发明所提供的菌剂的活性成分为所述链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCCNo.9536。

该菌剂除包含作为活性成分的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。

所述链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液或发酵液的过滤液也属于本发明的保护范围。

所述链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，或所述菌剂，或所述发酵液或发酵液的过滤液在如下1)或2)中的应用也属于本发明的保护范围：

1)抑制病原真菌；

2)制备用于防治植物真菌病害的产品。

在1)中，所述植物病原真菌可为板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)、杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或辣椒疫霉(Phytophthora capsici)。

在2)中，所述植物真菌病害可为由下述任一植物病原真菌引起的病害：板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)、杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或辣椒疫霉(Phytophthora capsici)。所述产品具体可为药物，如生物农药。

所述链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，或所述菌剂，或所述发酵液或发酵液的过滤液在如下3)或4)中的应用也属于本发明的保护范围：

3)抑制人体条件致病菌；

4)制备用于抑制人体条件致病菌的产品。

在3)中，所述人体条件致病菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)、白假丝酵母(Candida albicans)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

在4)中，所述产品具体可为药物，如抗生素。

在本发明中，所述发酵液中链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的生物量为每升发酵液20g菌体。在本发明的一个实施例中，所述发酵液是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(a)将链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536接种于ISP1液体培养基(配方：胰蛋白胨5g，酵母浸粉3g，蒸馏水1L)中28℃恒温震荡(转速180rpm)培养2天，获得种子液；(b)以5％(体积百分含量)的比例将所述种子液加到100ml发酵培养基(配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L)中，28℃恒温培养至链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的生物量为每升发酵液约20g菌体，得到所述发酵液。

相应的，所述发酵液的过滤液是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述发酵液10000g离心2min后，取上清，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到所述发酵液的过滤液。

本发明的再一个目的是提供所述菌剂的制备方法。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536作为活性成分，得到所述菌剂。

本方法从药用植物荠苨中分离得到一株具有广谱抑菌活性的内生菌——链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，尤其对MRSA的拮抗作用强，为后续分离和提取对耐药细菌有抑制效果的抗生素奠定基础。目前，筛选对耐药细菌有拮抗作用的微生物已经有很多的报道，但从荠苨中分离出的抗耐药性金黄色葡萄球菌的链霉菌在国内外尚未见报道。实验证明，链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液能明显抑制板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)等多种植物病原真菌，以及MRSA等多种人体条件致病菌的生长，并且发酵液中的抑菌成分对酸碱热的稳定性很强。同时，该链霉菌的培养条件简单、容易保存、易于工业化生产，预示了其在开发新型生物农药和抗生素等方面的潜在应用价值。

保藏说明

菌种名称：链霉菌

拉丁名：(Streptomyces sp.)

菌株编号：SAT1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年8月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9536

附图说明

图1为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对多种植物病原真菌的平板拮抗作用。其中，a为板栗疫病菌；b为苹果轮纹病病原菌；c为杨树溃疡病病原菌；d为辣椒疫霉。

图2为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对MRSA的平板拮抗作用及链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536发酵液对MRSA的抑制效果。其中，a为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对MRSA的平板拮抗作用(图中箭头所示处)；b为链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536发酵液对MRSA的抑制效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)：在文献“何邦令,李超,王庆华,等.木霉菌和毛壳菌对板栗疫病的抗生作用[J].中国森林病虫,2006,25(3):4-7.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)：在文献“Dui-shu L I,Jing-jiang H U.Inductive effect of oligosaccharides on Dothiorella gregaria resistance in Populustomentosa[J].Journal of Northwest A & F University(Natural Science Edition),2013,3:013.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

白假丝酵母(Candida albicans)：在文献“王明永,王凡平,郭晓芳,等.MBL抑制白假丝酵母菌刺激THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-8[J].中华微生物学和免疫学杂志,2011,31(1):14-19.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)：在文献“马健,刘振宇,吕全,等.不同抗性杨树接种溃疡病菌后过氧化氢及其氧化酶的表达差异[J].东北林业大学学报,2013,40(12):118-122.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)：在文献“张吉清,张学雷,肖炎农,等.黑龙江省大豆菌核病菌生长特性及菌丝体亲和型测定[J].中国油料作物学报,2013,35(3):307.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)：在文献“牛晓磊,薛泉宏,涂璇,等.6株生防放线菌对辣椒疫霉的皿内拮抗研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2005,33(1):55-58.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)：在文献“Pasberg-Gauhl C.A need for new generation antibiotics against MRSA resistant bacteria[J].Drug Discovery Today:Technologies,2014,11:109-116.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

大肠杆菌(Escherichia coli)：在文献“黄六容,蒋露银,陈文瑞,等.超声对大肠杆菌生长和重组蛋白表达的影响[J].食品与发酵工业,2014,4:017.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。

实施例1、内生菌SAT1的分离与鉴定

一、内生菌SAT1的分离

取药用植物荠苨(采自北京鹫峰国家森林公园)的组织样品采集风干48h后，用5％(5g/100ml)次氯酸钠处理4-10分钟(叶片处理4min，茎处理6min，根处理10min)，2.5g/100ml硫代硫酸钠的水溶液浸洗10分钟，用体积百分含量75％的乙醇水溶液处理5分钟，无菌水冲洗数次，最后在10g/100ml碳酸氢钠的水溶液浸洗10min。将植物组织在无菌的条件下用无菌的剪刀剪成长×宽×高约为1cm×1cm×1cm的组织块，将组织块直接放置在分离培养基TWYE、GA、WA和HV上，28℃恒温培养3-6周，挑取菌落形态不同的菌株，再次在平板上进行划线纯化培养。将分离并纯化得到的其中一株内生菌菌株记为SAT1。

二、内生菌SAT1的鉴定

1、形态学鉴定

内生菌SAT1在ISP2培养基上28℃恒温培养。SAT1基内菌丝无横隔，不断裂，在分支处多见膨大；气生菌丝呈长直形，多分枝，1～2d气生菌丝为白色，2～3d后呈紫灰色；气生菌丝上有链状孢子形成，孢子呈卵圆形，孢子丝多为螺旋形，成熟后形成念珠状孢子链。依据《链霉菌鉴定手册》初步判断，菌株SAT1的菌丝具有典型的链霉菌属的菌丝形态。

2、16S rRNA鉴定

提取内生菌菌株SAT1的基因组DNA，用通用引物27f和1492r扩增16S rRNA序列，将该序列测序。

27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

内生菌菌株SAT1的16s rRNA的序列详见序列表中序列1，并将测序结果提交到http://www.ezbiocloud.net/eztaxon进行序列分析。序列比对结果表明菌株SAT1为链霉菌(Streptomyces sp.)。

鉴于上述形态学鉴定和16s rRNA序列同源性分析结果，将步骤一分离并纯化得到的内生菌菌株SAT1鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)。该链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1已于2014年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.9536。

实施例2、拮抗菌株SAT1的广谱抑菌活性的测定

一、菌株SAT1对植物病原菌的拮抗作用研究

在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中央接入新鲜的板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)、杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)或核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的菌饼(用打孔器打下5mm大小的真菌菌饼进行接种)，在平板周边接上链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养。7天后观察并记录抑菌带的有无以及大小。每个处理设置三次重复，结果取平均值。

结果如表1所示，该菌对上述五种植物病原真菌均有抑制效果，特别是板栗疫病菌和苹果轮纹病病原菌，其抑菌带宽达到2.0cm和1.8cm。链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对上述植物病原真菌的拮抗作用如图1中所示。

表1 菌株SAT1对植物病原真菌的拮抗作用

二、菌株SAT1对人体条件致病菌的拮抗作用研究

以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、大肠杆菌(Escherichia coli)和白假丝酵母(Candida albicans)作为指示菌对链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的广谱抑菌活性进行分析。

对MRSA的抑菌活性初筛方法如下：挑取适量指示菌接种于液体LB培养基中，过夜(12h)培养，培养温度为28℃，转速为180r/min，培养后菌液OD600值接近2。以100ml培养基中加入100μl菌液的比例，向融化后稍冷的LB培养基中加入指示菌菌液，充分摇匀后倒平板，待培养基冷却凝固后，每个平板接种链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，放入28℃恒温培养箱中观察链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对指示菌的抑制情况。若链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536周围出现透明的抑菌圈，说明链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对该指示菌有抑制效果。

对MRSA、大肠杆菌和白假丝酵母的抑菌活性大小检测方法如下：用划线法分别在LB培养基平板的两边分别接种链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，做好标记，放入28℃恒温培养箱中培养2天，待链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536长出，在平板中间空白处分别接种MRSA、白假丝酵母和大肠杆菌，划线要尽量接近两侧的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536菌落，划好线后置于28℃恒温培养箱中培养，随时观察培养基内指示菌生长情况。若指示菌在接近链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的区域内未长出菌落，说明链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对此指示菌有抑制作用，抑菌效果强弱以抑菌带(未长出指示菌的区域)大小表示，抑菌带>8mm表示抑菌效果强，抑菌带5-8mm表示抑菌效果中等，抑菌带2-5mm表示抑菌效果弱。每个处理设置三次重复，结果取平均值。

结果表明，链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有很强抑制效果(图2中a箭头所示处)，对白假丝酵母和大肠杆菌有较好的抑制效果。

表2 菌株SAT1对人体条件致病菌的拮抗作用

注：+++表示抑菌带>8mm，++表示抑菌带5-8mm，+表示抑菌带2-5mm。

实施例3、拮抗菌株SAT1的发酵液对MRSA的抑制效果

本实施例将对链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536进行发酵培养检测其发酵液活性。

挑取适量链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536菌体于ISP1液体培养基(配方：胰蛋白胨5g，酵母浸粉3g，蒸馏水1L)中28℃恒温震荡(转速180rpm)培养2天，获得种子液。以5％(体积百分含量)的比例加到100ml发酵培养基(配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L)中，28℃恒温培养7天(生物量为每升发酵液约20g菌体)。将MRSA以实施例2的方法混匀倒板，用打孔法检测发酵产物抑菌活性。发酵液10000×g离心2min后，取上清用5ml一次性注射器接上0.22μm的无菌滤器(PALL)过滤除菌。用5mm打孔器打孔，加入50μl链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液过滤液，以未接菌的液体培养基做对照。置于28℃恒温培养箱中培养1天，观察抑菌效果。若有抑菌效果，用直尺测量3孔培养基上每个孔的抑菌圈直径，取平均值计算抑菌圈大小。

结果显示，链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有很强的抑制效果，抑菌圈直径达到20mm，如图2中b所示。

实施例4、拮抗菌株SAT1的发酵液的热稳定性

将实施例3获得的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液于50，60，70，80，90，100，121℃下分别处理10min和30min后，以MRSA为供试菌，以发酵液作为对照(CK)，重复3次。参照实施例3方法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性。

结果如表3所示，链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液经高温处理后，抑菌能力没有显著改变。从抑菌圈直径大小可以看出，发酵液经过不同处理后，仅90℃、100℃和121℃处理30min后略有下降，但并没有明显的差异。结果表明链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液的抗细菌活性具有较强的热稳定性。

表3 菌株SAT1发酵液在不同温度下对MRSA的抑菌圈直径

实施例5、拮抗菌株SAT1的发酵液的酸碱稳定性

将实施例3获得的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液用1mol/L HC1调整pH为2，3，4，5，6五个处理；另取100mL发酵液用1mol/L NaOH调整pH为8，9，10，11，12五个处理，以1mol/L HCl，1mol/L NaOH和发酵液作为对照，以MRSA为供试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其稳定性。

结果如表4所示，链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液对酸碱的稳定性较好，活性并无明显下降。从抑菌圈直径大小可以看出，发酵液经过酸碱处理后，随着pH值的增大和降低，抑菌活性略有下降，pH2、pH3和pH10时抑菌圈直径减小了16.5％，pH11和pH12时抑菌圈直径减小了18.5％。结果表明链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液的抗细菌活性具有较强的酸碱稳定性。

表4 菌株SAT1发酵液在pH值下对MRSA的抑菌圈直径

Claims

1.链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9536。

2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536。

3.权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536的发酵液或发酵液的过滤液。

4.权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，或权利要求2所述的菌剂，或权利要求3所述的发酵液或发酵液的过滤液在如下1)或2)中的应用：

1)抑制病原真菌；

2)制备用于防治植物真菌病害的产品。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述植物病原真菌为板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)、杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；或

所述植物真菌病害为由下述任一植物病原真菌引起的病害：板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果轮纹病病原菌(Dothiorella gregaria)、杨树溃疡病病原菌(Botryosphaeria dothidea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或辣椒疫霉(Phytophthora capsici)。

6.权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536，或权利要求2所述的菌剂，或权利要求3所述的发酵液或发酵液的过滤液在如下3)或4)中的应用：

3)抑制人体条件致病菌；

4)制备用于抑制人体条件致病菌的产品。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述人体条件致病菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

8.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SAT1CGMCC No.9536作为活性成分，得到所述菌剂。