CN102220271A - 一株海洋链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株海洋链霉菌及其应用。本发明提供的菌株，为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388，其保藏号为CGMCC No.4474。所述的菌在制备抑菌产品中的应用。所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1、金黄色葡萄球菌CGMCC 1.2386、枯草芽孢杆菌CGMCC 1.2428和/或白色念珠菌CGMCC 2.538。本发明的实验证明，本发明新分离出海洋链霉菌FXJ7.388，其具有如下优点：海洋链霉菌FXJ7.388对革兰氏阳性细菌和白色念珠菌具有抗性：具体为对多重耐药金黄色葡萄球菌MRSA、普通金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌有很强的抗菌活性，对白色念珠菌有一定的抑制作用。

Description

一株海洋链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株海洋链霉菌及其应用。
背景技术
放线菌是一类基因组DNA的G+C mol％含量高、具有复杂形态分化的革兰氏阳性细菌，因其菌落多呈放射状而得名。放线菌能生产包括抗生素在内的具有极高经济价值的多种生物活性物质，被认为是一类重要的药用微生物资源，迄今发现的两万余种微生物来源的生物活性物质中，约一半是由放线菌产生的。
临床抗生素的滥用使致病菌耐药性急剧增强，已有抗生素的疗效已经大幅度降低，迫切需要寻找新型抗生素。随着土壤来源放线菌中发现新活性产物的几率越来越低，人们将目光投向了海洋。占地球表面积超过70％的海洋，其环境具有高盐、高渗透压、低温、寡营养、特殊光照等特点，在这种环境中生存的放线菌往往具有不同于陆生土壤放线菌的多样性和次生代谢途径，因此，海洋是寻找新放线菌菌种及其活性化合物的理想场所。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种菌株。
本发明提供的菌株，为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388，其保藏号为CGMCC No.4474。
所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388CGMCC No.4474在制备抑菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或白色念珠菌(Candidia albicans)。所述产品为药物。
所述耐药金黄色葡萄球菌为耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1(Staphylococcus aureus MRSA 1-1)。
本发明的另一个目的是提供一种制备抑菌产品的方法。
本发明提供的方法，为发酵所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388CGMCC No.4474，收集发酵产物，即得到抑菌产品。
所述发酵的温度为25℃-30℃，所述发酵的温度具体为28℃。
所述发酵时间为7天-14天，所述发酵时间具体为7天或14天。
在收集发酵产物后，还包括如下步骤：
A、将所述发酵产物过滤除菌丝体、收集滤液；
B、用等体积的乙酸乙酯萃取步骤A得到的滤液，收集有机相；
C、减压蒸馏除去步骤B得到的有机相中的乙酸乙酯，得到残留物；
D、将步骤C得到的残留物溶解于甲醇中，得到抑菌产品。
所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或白色念珠菌(又名，白假丝酵母，Candida albicans)；所述耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)尤其优选为耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1(Staphylococcus aureus MRSA 1-1)。
所述产品为药物。
海洋链霉菌FXJ7.388于2010年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路一号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.4474，该菌株的分类命名为链霉菌Streptomyces sp.。
本发明的实验证明，本发明新分离出海洋链霉菌FXJ7.388，其具有如下优点：海洋链霉菌FXJ7.388对革兰氏阳性细菌和白色念珠菌具有抗性：具体为对多重耐药金黄色葡萄球菌MRSA、普通金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌有很强的抗菌活性，对白色念珠菌有一定的抑制作用。
附图说明
图1为海洋链霉菌FXJ7.388在16S rRNA基因的系统发育树
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、海洋链霉菌FXJ7.388的分离
一、菌种分离
2009年1月间从大连湾取得渤海近海海泥样品，样品尽快带回实验室中进行处理。海泥样品自然风干后用无菌水制成悬浮液，采用60℃加热十分钟的方法进行预处理，采用ISP-3培养基作为分离培养基，于28℃培养30天，挑单菌落于GYM培养基上纯化，得到海洋链霉菌FXJ7.388。
二、菌种鉴定
1、16S rRNA分析
提取海洋链霉菌FXJ7.388基因组DNA，采用放线菌16S rRNA通用引物(27f：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492r：5’-TACGGYTACCTTACGACTT-3’)扩增16SrRNA基因并纯化测序，序列测定结果通过NCBI的BLASTN程序进行相似性比较。
序列分析结果表明，海洋链霉菌FXJ7.388的16S rRNA的核苷酸序列为序列表中的序列1。
通过genbank比对，结果发现与海洋链霉菌FXJ7.388的16S rRNA基因序列相似性＞99％的已知菌株有两株，分别为链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T(genbank号为EF577247)及链霉菌Streptomyces chungwhensis DSM 41843(genbank 号为AY382292)(见图1所示)。
2、形态特征及生理生化鉴定
1)形态观察
将海洋链霉菌FXJ7.388与链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T(购自美国农业部)及链霉菌Streptomyces chungwhensis DSM 41843(购自德国菌种保藏中心)分别在GYM培养基上进行培养。
观察形态结果如下：海洋链霉菌FXJ7.388培养两周之后仅可见少量浅褐色的基内菌丝产生，培养1个月后可见极为稀疏的白色气生菌丝分布于菌落边缘处，不产色素；Streptomyces xinghaiensis培养3天后即可见浅褐色的基内菌丝，培养4-5天后即可见灰白色的气生菌丝和浅黄色的孢子丝，不产色素；Streptomyces chungwhensis培养4天后可见浅褐色的基内菌丝，5-6天后可见灰色的气生菌丝和白色的孢子丝，产生少量黑色素。
2)PH值
海洋链霉菌FXJ7.388的生长pH范围为5-9，而Streptomyces xinghaiensis及Streptomyces chungwhensis的生长pH范围均为6-8。
3)NaCl耐受
海洋链霉菌FXJ7.388、Streptomyces xinghaiensis、Streptomyces chungwhensis分别在含0-3％NaCl的GYM培养基上培养。
结果如下：海洋链霉菌FXJ7.388在含2-3％NaCl的条件下生长良好，Streptomyces xinghaiensis在含0-2％NaCl的条件下可生长并生长良好，Streptomyces chungwhensis 在含0-6％NaCl的条件下可生长并生长良好。
4)、碳、氮源利用方面
方法详见东秀珠、蔡妙英等编《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社，2001年出版)pp365-366。
结果Streptomyces chungwhensis能利用所有的碳源；海洋链霉菌FXJ7.388与Streptomyces xinghaiensis均不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、松三糖、海藻糖、木糖；海洋链霉菌FXJ7.388不能利用纤维二糖、葡聚糖、鼠李糖、蔗糖，而Streptomycesxinghaiensis能利用；海洋链霉菌FXJ7.388能利用葡萄糖，而Streptomycesxinghaiensis不能利用；海洋链霉菌FXJ7.388能利用甘氨酸，而Streptomycesxinghaiensis及Streptomyces chungwhensis均不能利用；海洋链霉菌FXJ7.388不能利用脯氨酸，而Streptomyces xinghaiensis及Streptomyces chungwhensis均能利用；海洋链霉菌FXJ7.388及Streptomyces xinghaiensis均不能利用酪氨酸，Streptomyces chungwhensis能利用。
5)降解、还原实验
方法详见东秀珠、蔡妙英等编《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社，2001年出版)pp370-388。
海洋链霉菌FXJ7.388能降解酪素及还原硝酸盐，而Streptomyces xinghaiensis及Streptomyces chungwhensis均不能；海洋链霉菌FXJ7.388及Streptomyces xinghaiensis均不能水解淀粉，而Streptomyces chungwhensis则能水解。
以上生理生化的结果具体见下表1所示：
表1三种链霉菌的的生理生化实验结果
Figure BDA0000064281480000041
Figure BDA0000064281480000051
“+”表示实验结果为阳性；“-”表示实验结果为阴性。
通过上述的鉴定结果表明，海洋链霉菌FXJ7.388与Streptomyces xinghaiensis及Streptomyces chungwhensis皆有很大区别，结合16S rRNA基因分析，推测海洋链霉菌FXJ7.388为不同于二者的新菌种，但属于同一属。
海洋链霉菌FXJ7.388于2010年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路一号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC 4474，该菌株的分类命名为链霉菌Streptomyces sp.。
实施例2、海洋链霉菌FXJ7.388的抗菌功能验证
一、海洋链霉菌FXJ7.388的琼脂块法抗菌实验
1、将海洋链霉菌FXJ7.388、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T及Streptomyces chungwhensis DSM 41843分别接种于GYM琼脂培养基(葡萄糖4.0g酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，碳酸钙2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml)中，28℃培养2周。
2、将供试菌采用LB液体培养基，37℃振荡培养24小时；真菌采用PDA液体培养基，25℃振荡培养48小时。振荡器转速均为165r/min，得到浓度为108cfu/ml的供试菌菌液，待培养基与菌液混匀后倒入活性测定用的培养皿中，冷却至培养基凝固。
供试细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.Aureus，细菌)CGMCC1.2386、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，细菌)CGMCC 1.2428、白色念珠菌(又名，白假丝酵母，Candida albicans，真菌)CGMCC 2.538、烟曲霉(Aspergillus fumigatus，真菌)CGMCC 3.772、大肠杆菌(大肠埃希氏杆菌，Escherichia coli，细菌)CGMCC 1.2385、肺炎克雷伯氏菌(肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种，Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae，细菌)CGMCC 1.1736；耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1、耐药大肠杆菌EMBL 4-1和敏感霍乱弧菌O1(均2003年由潍坊医学院提供)。
3、用打孔器取出步骤1培养好的放线菌琼脂块，置于步骤2凝固的含供试菌的培养基中，使圆柱形放线菌琼脂块底面紧贴含菌培养基琼脂表面。细菌于37℃静置培养24小时，真菌于25℃静置培养48小时，观察抑菌圈的直径。结果见表2。
表2三种链霉菌的琼脂块抗菌实验结果
Figure BDA0000064281480000061
Figure BDA0000064281480000071
以上结果表明，海洋链霉菌FXJ7.388抗耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1、金黄色葡萄球菌CGMCC 1.2386、枯草芽孢杆菌CGMCC 1.2428和白色念珠菌CGMCC 2.538。
二、海洋链霉菌FXJ7.388的发酵液脂溶性组分抗菌实验
1、放线菌及供试菌的培养
将海洋链霉菌FXJ7.388、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T及Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T分别在100ml的GYM液体培养基(葡萄糖4.0g酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，碳酸钙2.0g，蒸馏水1000.0ml)中于165r/min，28℃培养一周，分别得到海洋链霉菌FXJ7.388发酵液、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T发酵液及Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T发酵液，供脂溶性组分提取用；
将供试菌株接种到各自相应的培养基中，细菌采用LB培养基，37℃振荡培养24小时；真菌采用PDA培养基，25℃振荡培养48小时。振荡器转速均为165r/min。
供试细菌：金黄色葡萄球菌(细菌)CGMCC 1.2386、枯草芽孢杆菌(细菌)CGMCC1.2428、白色念珠菌(真菌)CGMCC 2.538、烟曲霉(真菌)CGMCC 3.772、大肠杆菌(细菌)CGMCC 1.2385、肺炎克雷伯氏菌(细菌)CGMCC 1.1736；耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1、耐药大肠杆菌EMBL 4-1和敏感霍乱弧菌01(均2003年由潍坊医学院提供)。
2、海洋链霉菌FXJ7.388发酵液脂溶性组分的获得
分别取海洋链霉菌FXJ7.388发酵液、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T发酵液及Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T发酵液的100ml分别过滤去除菌丝体，滤液采用等体积的乙酸乙酯萃取，反复萃取三次后合并各自的乙酸乙酯相，采用减压蒸馏的方法除去乙酸乙酯，获得残留物。残留物用2ml的甲醇充分溶解，从而分别获得三种菌发酵液的脂溶性组分(甲醇溶解物)：海洋链霉菌FXJ7.388甲醇溶解物、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T甲醇溶解物及Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T甲醇溶解物。
3、活性测定平板制备
将步骤1的供试菌按照同步骤一中第2步进行处理，得到含供试菌的培养基。
4、活性测定
用移液器分别移取2μl上述获得的海洋链霉菌FXJ7.388甲醇溶解物、Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T甲醇溶解物及Streptomyces xinghaiensis NRRL B-24674T甲醇溶解物，滴于直径为5mm的灭菌滤纸片中，待甲醇挥发至干后将滤纸片紧贴由步骤3得到的含不同供试菌的培养基琼脂表面。
供试细菌于37℃培养24小时，供试真菌于25℃培养48小时，观察抑菌圈的直径。结果见表3。
表3三种链霉菌的发酵液脂溶性组分抗菌实验结果
“-”表示无抗菌活性。
从上述结果可以看出，海洋链霉菌FXJ7.388对耐药金黄色葡萄球菌、普通金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌有很强的抗菌活性，对白色念珠菌有一定的抑制作用，对其余供试菌无活性；Streptomyces xinghaiensis对所有的测试菌均有一定的抗菌活性；Streptomyces chungwhensis则对所有的测试菌均无抗菌活性。并且，海洋链霉菌FXJ7.388不论是琼脂块还是其脂溶性组分的抗革兰氏阳性菌(耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1、金黄色葡萄球菌CGMCC 1.2386、枯草芽孢杆菌CGMCC 1.2428)的活性均强于Streptomyces xinghaiensis。
Figure IDA0000064281580000011

Claims (10)

1.海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388，其保藏号为CGMCC No.4474。
2.权利要求1所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388CGMCC No.4474在制备抑菌产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或白色念珠菌(Candidia albicans)。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：
所述耐药金黄色葡萄球菌为耐药金黄色葡萄球菌MRSA 1-1(Staphylococcus aureus MRSA 1-1)。
5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：
所述产品为药物。
6.一种制备抑菌产品的方法，为发酵权利要求1所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ7.388 CGMCC No.4474，收集发酵产物，即得到抑菌产品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述发酵的温度为25℃-30℃，所述发酵的温度具体为28℃；
所述发酵时间为7天-14天，所述发酵时间具体为7天或14天。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
在收集发酵产物后，还包括如下步骤：
A、将所述发酵产物过滤除菌丝体、收集滤液；
B、用等体积的乙酸乙酯萃取步骤A得到的滤液，收集有机相；
C、减压蒸馏除去步骤B得到的有机相中的乙酸乙酯，得到残留物；
D、将步骤C得到的残留物溶解于甲醇中，得到抑菌产品。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或白色念珠菌(Candidia albicans)；所述耐药金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)尤其优选为耐药金黄色葡萄球菌MRSA1-1(Staphylococcus aureus MRSA 1-1)。
10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于：
所述产品为药物。
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