CN105713858A - 一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其保藏号为CGMCCNo.11840，该菌株能产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质，本发明还提供了该菌株在防治番茄灰霉病中的应用，其对番茄灰霉病菌有良好的防效。该菌株及其微生物制剂的使用，可以降低番茄生产过程中化学农药的施用，具有良好的生态和社会效益。

Description

一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵及生物防治技术领域，具体涉及一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21及其应用。

背景技术

随着化学农药和传统抗生素的大量使用，食品安全和环境问题越发突出，生物防治在农业生产中的应用逐渐受到重视。近年来，微生物来源的脂肽被用于抗真菌病方面的研究有了很大的进展，相对于化学农药和传统抗生物质而言，脂肽类具有对动植物无害、可生物降解以及不易使病原微生物产生，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）以及蜡状芽孢杆菌（B.cereus）是产脂肽的主要菌种，产生的脂肽类抗生素主要有表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰原素（Fengycin）三大类。

不同类型的脂肽类抗生物质往往具有不同的生物活性。Iturins和fengycins对真菌具有较强的拮抗能力；surfactins主要对细菌、病毒和支原体有抑制作用，对真菌没有太大的抑制作用，但其能够增强Iturins或fengycins对真菌的医治效果，还能在植物根部形成一层生物膜保护植物根部免受病原菌的入侵。

不同的菌种产生的脂肽类物质不同，曹云（SQR9微生物有机肥防治黄瓜土传枯萎病的效应与机制研究，南京农业大学，2011）发现SQR9菌株含有Bacillomycin和Fengcin两种脂肽类抗生素，Ye等（Identificationofantifungalsubstance（IturinA2）producedbyBacillussubtilisB47anditseffectonSouthernCornLeafBlight，JournalofIntegrativeAgriculture，2012，11（1）：90-99.）鉴定枯草芽孢杆菌B47发酵液的主要成分为Iturin。

目前关于甲基营养型芽孢杆菌产脂肽类物质的研究较少，中国专利ZL201310466625.2公开了一种产脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus9912，其产生的脂肽化合物为6-AbuC16fengycin、anteiso-C15surfactin和anteiso-C15surfactinmethylester，即仅包含Surfactin和Fengcin两种类型的脂肽，对黄瓜灰霉病及苹果腐烂病等有防治效果。

发明内容

基于以上技术现状，本发明的目的是提供一株新的甲基营养型芽孢杆菌BH-21，并提供其应用，该菌株能产生多种脂肽类物质，对番茄灰霉病具有显著的防治效果。

本发明采用的技术方案如下：

一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BacillusmethylotrophicusBH21，该甲基营养型芽孢杆菌于2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11840，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

该甲基营养型芽孢杆菌BH21的16sRNA序列在Genebank的登录号为KT889363，其gyrB基因序列在Genebank的登录号为KT889364。

该甲基营养型芽孢杆菌BH21含有产生脂肽类抗生物质的基因，包括ituA、ituB、ituC、ituD，fenD，srfAB和yndJ基因。

该甲基营养型芽孢杆菌BH21产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质。

本发明还提供了所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21在防治番茄灰霉病中的应用。

具体地，将所述甲基营养型芽孢杆菌BH21的发酵液用于生物防治，所述发酵液由以下步骤制得：按体积比3%的接种量将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中，180r/min，32℃培养72h，得到发酵液，即可用于生物防治。

所述种子液通过下述方法获得：将保存的甲基营养型芽孢杆菌BH21划线转接到ZoBell's2216E培养基平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将获得的甲基营养型芽孢杆菌BH21的菌苔接种到PB液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h得到种子液。

所述的大量发酵培养基中包含：蔗糖20g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄3g，Na₂HPO₄10g，MgSO₄·7H₂O0.2g，酵母粉0.2g，CaCl₂0.7μg，MnSO₄·4H₂O1μg，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

本发明菌株能产生多种脂肽类抗生物质，具有显著的防治番茄灰霉病的效果，防效可高达95%以上。

附图说明

图1是PDA平板上BH21对番茄灰霉病菌的拮抗作用；

图2是甲基营养型芽孢杆菌BH21菌落形态；

图3是甲基营养型芽孢杆菌BH21菌体形态；

图4是基于16SrDNA序列的BH21系统发育树；

图5是基于gyrB基因序列的BH21系统发育树；

图6是BH21中脂肽类抗生物质的分子鉴定；

图7甲基营养型芽孢杆菌BH21发酵液的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

实施例1甲基营养型芽孢杆菌BH21的筛选

从采自中国渤海的海水和海泥中分离细菌，分离培养基（ZoBell's2216E）为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂16g，陈海水1000mL，pH值7.6-7.8。从分离平板上挑取菌落形态不同的菌株，分别与番茄灰霉病菌做平板对峙实验，将能出现抑菌圈的菌株定为有拮抗作用，共筛选出41株有拮抗作用的细菌，依次编号为BH1-BH41。采用平板对峙法进行复筛并记录抑菌圈直径，其中BH21抑菌带达到15mm（图1），对灰霉病菌的拮抗作用显著。

实施例2拮抗菌株BH21的菌落形态及生理生化鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛选的保藏号为CGMCCNo.11840的菌株进行菌种鉴定。

菌落形态观察在ZoBell's2216E细菌培养基上划线，于恒温培养箱中28±2℃培养3天，观察菌落形态。保藏号为CGMCCNo.11840的菌株的菌落呈凸起、乳白色、边缘缺刻状（图2）。挑取培养3天的菌落进行革兰氏染色后，在光学显微镜的100倍油镜下观察，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株的菌体长杆状、中生芽孢、革兰氏染色阳性（图3）。

耐盐试验：向培养基中分别加入NaCl，使含盐量为2.5%、5%、7.5%，。甲基营养型芽孢杆菌BH21在含NaCl2.5%、5%、7.5%的培养基中生长良好，在含NaCl10%，12.5%的培养基中生长缓慢，7天后长出菌苔。

耐甲醇试验：向培养基中分别加入甲醇溶液，使甲醇含量为5%、10%、。培养3天甲基营养型芽孢杆菌BH21在甲醇含量为5%、10%的培养基生长良好，在15%、20%、25%的培养基生长缓慢；7天后，全部长出菌苔。

初步鉴定该菌株为芽孢杆菌。

实施例3BH21菌株的16SrDNA鉴定

16SrDNA的扩增和测序采用菌体PCR的方法，PCR的扩增引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将扩增产物条带正确的PCR产物交由上海立菲生物技术有限公司纯化测序。测序结果显示，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株具有1450bp。

通过NCBI提供的GenBank的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行在线比对发育相似度。序列对齐采用CLUSTAL.W，系统发育树（图4）的构建采用MEGA6.0程序，计算方法为neighbour-joining和maximum-parsimony，bootstrapvalues是1000次。经分析显示，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株属于甲基营养型芽孢杆菌。

实施例4BH21菌株的gyrB鉴定

gyrB的扩增采用菌体PCR的方法，PCR的扩增引物为UP15′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′和UP2r5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。gyrB基因的PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将扩增产物条带正确的PCR产物交由上海立菲生物技术有限公司纯化测序。测序结果显示，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株具有1162bp。

通过NCBI提供的GenBank的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行在线比对发育相似度。序列对齐采用CLUSTAL.W，系统发育树（图5）的构建采用MEGA6.0程序，计算方法为neighbour-joining和maximum-parsimony，bootstrapvalues是1000次。经分析显示，保藏号为CGMCCNo.11840的菌株属于甲基营养型芽孢杆菌。

实施例5菌株BH21的培养

（1）BH21的种子培养基和培养条件

培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

培养条件：转速180r/min、28℃摇床培养18h，作为种子液备用。

（2）BH21发酵培养基和培养条件

培养基：蔗糖20g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄3g，Na₂HPO₄10g，MgSO₄·7H₂O0.2g，酵母粉0.2g，CaCl₂0.7μg，MnSO₄·4H₂O1μg，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

培养条件：发酵培养基100mL装于250mL三角瓶中，接种3%的种子菌液，转速180r/min、32℃在摇床发酵培养72h。该培养液中活菌数为5×10⁷cfu/ml，可以用于进行抗生物质的分析和番茄灰霉病的防治。

实施例6甲基营养型芽孢杆菌BH21的脂肽类抗生物质的PCR鉴定

采用与ituA，ituB，ituC，ituD，fenB，qk，fenD，srfAB，bamC，sboA和yndJ基因相关的引物，对筛选的保藏号为CGMCCNo.11840的菌株进行菌体PCR。PCR反应条件：25μl反应体系1μl培养14h的菌液，2.5μl10×PCR缓冲液，dNTPs各0.2mmol/L，上下游引物各0.5μmol/L，1.25UTaqDNA聚合酶(Takara，Dalian)。扩增ituA，ituB，ituD，srfAB，fenB和qk基因的程序为：94℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min；扩增bamC，fenD，ituC，sboA和yndJ基因程序为：94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，染色剂为GoldView。由图6（M：分子量标记物（DM2000）；泳道1：yndj；泳道2：sboA；泳道3：bamC；泳道4：ituC；泳道5：fenD；泳道6：qk；泳道7：ituB；泳道8：ituD；泳道9：ituA；泳道10：fenB；泳道11：srfAB）可见甲基营养型芽孢杆菌BH21可能含有yndj、ituC、、fenD、ituB、ituD、ituA、srfAB基因，它们分别为Iturin、Fengycin、Sufactin和Yndj的生物合成相关基因。扩增产物交由上海立菲生物技术有限公司纯化测序，核酸序列通过NCBI提供的GenBank的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行在线比对相似度，如表1。其中FNDF1/FNDR1引物扩增片段与fengycin合成相关，相似度为100%；而引物ituD2F/ituD2R,ituA1F/ituA1R和ITUCF1/ITUCR3引物扩增片段表现为96-99%的相似度，都与iturin家族脂肽类抗生物质相关。引物10F/110R和147F/147R扩增片段与目的基因扩增片段相似度都达到96%，说明菌株BH21具有表达surfactin和yndj活性的能力（表1）。

表1PCR产物核酸序列与相关基因的相似度

。

实施例7甲基营养型芽孢杆菌BH21的脂肽类抗生物质的色谱分析

脂肽类抗生物质的粗制备

摇瓶发酵72h后的发酵液9000r/min离心30min去除菌体。无菌上清液用盐酸调节pH至2.0。4℃冰箱过夜使沉淀过程完全。9000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用冻干机冻干，得到脂肽粗提物。将脂肽粗提物用适当甲醇溶解，离心取上清，用于下一步色谱分析。

脂肽类抗生物质的色谱分析

采用的色谱柱为watersXbridgePeptideBEHC18,300A，5um。流动相：0.1%HFAWater，0.1%HFA乙腈。洗脱条件为0.1%HFA乙腈（0%→100%），梯度洗脱80min。检测波长采用PDA检测器215nm波长扫描。流速为1ml/min，进样量为200ug，柱温为30℃。为验证发酵产物的稳定性，检测3个不同批次发酵液。由图7可看出甲基营养型芽孢杆菌BH21发酵液含有Iturin类、Fengycin类、Sufactin类脂肽类抗生物质，并且3个批次间色谱峰分布基本一致。

实施例8甲基营养型芽孢杆菌BH21在番茄叶片上的离体防效试验

取大小相对一致的盆栽番茄健康叶片，先用无菌水正反冲洗一次，再用75%酒精冲洗2min，之后用无菌水冲洗3次，去除残余酒精。用移液器分别将稀释10倍、20倍、50倍、100倍、200倍的拮抗细菌无菌发酵液对叶片进行冲洗，使整个叶片沾满发酵液，以无菌水处理做对照。分别接种直径8mm的灰霉病菌菌块，将叶片置于无菌培养皿中保湿，22℃温室培养，7d后测量叶片病斑直径，记录结果。

BH21发酵上清液稀释液处理番茄叶片，上述各浓度的处理对灰霉病的防效分别为100%、100%、100%、100%和92%。结果表明，BH21发酵上清液对灰霉病菌有很强的抑制作用，在番茄离体叶片上对灰霉病有很好的防治效果。

实施例9甲基营养型芽孢杆菌BH21对室内盆栽番茄灰霉病的防效试验

室内盆栽番茄幼苗，待长出3-4片真叶时供试。用喷壶定量喷施各个稀释度（10倍、50倍、100倍、200倍）的发酵上清液，无菌水喷施为空白对照，嘧霉胺（有效成分含量2%，1000倍稀释）作为常用的药剂对照，每处理20株，每株3mL，自然晾干，24h后用喷壶接种10⁷cfu/mL灰霉菌孢子悬浮液5mL。接种后用保鲜袋将番茄幼苗保湿，置于（22±1）℃（RH=90%）光照培养室培养，待空白对照病情指数达40%时，计算各处理的防效，结果见表2。

病情指数=[∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×9）]×100

防效（%）=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100

盆栽实验中，BH21各个浓度的发酵滤液均对灰霉病有一定的防治效果，发酵滤液100倍稀释液的防病效果最好，病情指数为1.2，防效为97.0%。

表2BH21发酵液与农药处理番茄的病情指数和防病效果

。

实施例10甲基营养型芽孢杆菌BH21防治番茄灰霉病的田间应用效果

于番茄棚室中进行防治番茄灰霉病的田间应用实验，实验设置3个处理：空白对照、甲基营养型芽孢杆菌BH21发酵液100倍稀释和嘧霉胺1000倍稀释液，不同处理间采用塑料薄膜隔开，以避免不同处理间的相互影响，便于实验结果统计。空白对照不做任何处理；发酵液喷施处理于番茄现蕾期开始间隔15天喷施一次（喷施量约每公顷1L原始发酵液）；嘧霉胺依照当地菜农的应用经验，在番茄灰霉病出现发病迹象的时候开始喷施，之后根据病情间隔7-10天喷施一次。待空白对照病情指数达到50%以上时，统计其他处理番茄叶霉病的病情指数及防病效果，结果见表3。

表3BH21处理田间番茄灰霉病的病情指数和防病效果

。

以上仅为本发明的较佳实施方式，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何不具有创造性的改进，如将发酵液按照常规方法制成各种微生物菌剂等，也都在本发明的保护范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCELISTING

<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21及其应用

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1450

<212>16sRNA

<213>甲基营养型芽孢杆菌BH21

<400>1

cagtgaggcggtctatcatgcagatcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtta60

gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggga120

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<210>2

<211>1162

<212>gyrB核酸

<213>甲基营养型芽孢杆菌BH21

<400>2

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Claims (9)

1.一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌BH21，该甲基营养型芽孢杆菌于2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11840。

2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其16sRNA序列在Genebank的登录号为KT889363，其gyrB基因序列在Genebank的登录号为KT889364。

3.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其含有产生脂肽类抗生物质的基因，包括ituA、ituB、ituC、ituD，fenD，srfAB和yndJ基因。

4.根据权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其特征在于：其产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和Yndj类脂肽类抗生物质。

5.权利要求1-4任一项所述的甲基营养型芽孢杆菌BH21的应用，其特征在于用于防治番茄灰霉病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述甲基营养型芽孢杆菌BH21的发酵液用于生物防治，所述发酵液由以下步骤制得：按体积比3%的接种量将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中，32℃培养72h，得到发酵液，即可用于生物防治。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述种子液通过下述方法获得：将保存的甲基营养型芽孢杆菌BH21划线转接到ZoBell's2216E培养基平板中，置于培养箱28℃恒温培养2天；将获得的甲基营养型芽孢杆菌BH21的菌苔接种到PB液体培养基中，28℃摇床振荡培养18h得到种子液。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的大量发酵培养基中包含：蔗糖20g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄3g，Na₂HPO₄10g，MgSO₄·7H₂O0.2g，酵母粉0.2g，CaCl₂0.7μg，MnSO₄·4H₂O1μg，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：制备发酵液时转速为180r/min。